Summary
Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.
Abstract
Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1 del ciclo cellulare, che vengono riassorbite prima della mitosi. Le ciglia primarie possono essere visualizzate con metodi altamente sofisticati, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o l'utilizzo di un software per il rilevamento automatico delle ciglia primarie. Tuttavia, per eseguire questi metodi è necessaria una colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie. Questa pubblicazione descrive un protocollo per la facile rilevazione delle ciglia primarie in vitro colorando la tubulina alfa acetilatata (axoneme) e la tubulina gamma (corpo basale). Questo protocollo di colorazione immunofluorescente è relativamente semplice e si traduce in immagini di alta qualità. Il presente protocollo descrive come quattro linee cellulari (C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti cutanei) che esprimono ciglia primarie sono state fissate, immunizzate e immagini con un microscopio fluorescente o confocale.
Introduction
Le ciglia primarie sono strutture sensoriali, solitarie, legate alla membrana e nonmotile associate alla centriola madre della cellula. Le ciglia primarie si trovano sulla maggior parte delle cellule vertebrate, ad eccezione dei globuli rossi, degli adidociti1e degli epariti2. Le ciglia primarie sono formate come un asceone allungato composto da microtubuli, il cui componente principale è la tubulina. L'ascia cresce dal corpo basale, strutturato γ-tubulina. La lunghezza delle ciglia primarie varia tra 2 e 10 m; tuttavia, le sue dimensioni possono cambiare durante la glicilazione, la fame, l'ipossia, lo stress citotossico o dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti3,4,5,6,7. Di solito, le cellule hanno un solo cilio primario, che è coinvolto nella morfogenesi e nei percorsi di segnalazione cellulare importanti per la proliferazione cellulare e la differenziazione8,9.
Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1, e riassorbite prima di entrare nella mitosi in un processo associato alla deacetilazione della tubulina mediata da HDAC6 (deacetilase istone 6)10. Il momento esatto della riassorbimento delle ciglia primarie dipende dal tipo di cellula e dall'espressione dei geni direttamente coinvolti in questo processo, come Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. A seconda del tipo di cellula, le ciglia primarie esprimono diversi tipi di recettori, canali ioni e percorsi di segnalazione attivi. Questi includono i più importanti recettori di segnalazione che influenzano la proliferazione e la sopravvivenza, EGFR, PDGFR, e FGFR. Sono inclusi anche alcuni dei percorsi di segnalazione che possono influenzare la funzione di uno o più organi, tra cui Riccio, Notch, e Wnt. Grazie a questi recettori e vie di segnalazione, le ciglia primarie svolgono anche una funzione chemiosensoriale. Questa funzione consente alle ciglia primarie di rilevare ligand specifici per Notch, ormoni, e sostanze biologicamente attive come serotonina o somatostatina. Altre funzioni specifiche esposte da ciglia primarie di diverse lunghezze includono la reazione ai cambiamenti di temperatura, gravità e osmolalità14.
Le ciglia primarie possono essere visualizzate attraverso vari metodi, come la visualizzazione dal vivo, la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o il software per il rilevamento automatico delle cigliaprimarie 5,15,16,17. Tuttavia, questi metodi sono altamente specializzati e la ricerca in corso ha bisogno di metodi di base, veloci e facili per colorare le ciglia primarie in ogni fase della ricerca. Descritto è un metodo facile e utile per il rilevamento delle ciglia primarie nelle cellule culture.
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Protocol
1. Preparazione di mezzi di coltura, soluzioni e piatti
- Autoclave le copertine (22 x 22 mm). Preparare 6 piastre di pozzo. Scongelare il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina/streptomicina antibiotica e riscaldare la temperatura ambiente media e ambiente di coltura (RT). Utilizzare trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (fosfato tamponato salino con calcio e magnesio) per passare le cellule.
- Preparare la paraformaldeide fresca del 4% (PFA) in dH2O (800 mg di PFA in 20 mL di dH2O). Il PFA deve essere preparato per ogni esperimento. Mescolare e riscaldare la soluzione a 55 gradi centigradi per 30 minuti nel cofano. Raffreddare a RT. Aggiungere 1 M di idrossido di sodio fino a quando la soluzione diventa chiara (pH - 7,2–7,4). Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
Nota: PFA è tossico; indossare sempre adeguate attrezzature di protezione personale e prepararsi nel cappuccio chimico. - Preparare 500 mL di mezzi di coltura, DMEM (mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco) contenente il 10% di FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 2% di glutammina.
- Preparare 13 mL di soluzione di gelatina dell'1% in dH2O sterile (130 mg di gelatina in 13 mL di dH2O). Utilizzare 2 mL di 1% gelatina per ogni pozzo in un piatto 6 bene. Mantenere sterile.
- Pulire il cofano a flusso laminare con il 70% di etanolo. Posizionare il materiale richiesto all'interno del cofano di flusso laminare prima di iniziare l'esperimento.
2. Coltura cellulare per la colorazione dell'immunocitochimica
- Scongelare le cellule (in questo studio C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti della pelle) utilizzando tecniche standard e placcarle in una fiaschetta T75 integrata con 10-12 mL dei supporti preparati. Incubare a 37 gradi centigradi/5% di CO2/90% di umidità relativa (RH) fino a quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza.
- Rimuovere le cellule dall'incubatrice e posizionarle nel cofano a flusso laminare. Rimuovere i supporti di coltura e risciacquare brevemente le cellule 2x con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di 0,25% di trypsin-EDTA nella fiaschetta T75 e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Controllare periodicamente il microscopio invertito per monitorare il distacco delle cellule.
NOTA: il tempo di incubazione dipende dalla linea della cella e pertanto deve essere determinato empiricamente. - Risundere delicatamente le cellule in 10 mL di supporti di coltura, pipettando con attenzione per creare una sospensione a singola cella. Se necessario, sciacquare nuovamente il pallone.
- Posizionare la sospensione della cella in un tubo conico di 50 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g. Decantare il supernatant, aggiungere 10 mL di mezzi di coltura, e delicatamente rispendere il pellet. Prendere 20 L della sospensione cellulare e mescolare in un rapporto 1:1 con blu trypan e contare in un citometro seguendo il metodo standard.
- Mettere un coperture all'interno di ogni pozzo di un piatto 6 ben con una pinzetta. Rivestire le coperture con gelatina versando 2 mL nei pozzetti. Questo aiuterà le celle ad attaccarsi alle coperture. Togliere la soluzione di gelatina e lasciare asciugare l'aria per qualche minuto. Le coperture sono ora pronte per la coltivazione delle cellule. Avviare immediatamente la coltivazione.
- Semina 100.000 fibroblasti in ogni pozzo e aggiungi 2 mL di media culturali. Incubare le cellule per 24 h a 37 s /5% CO2/90% RH. A questo punto, le cellule possono essere trattate in base alle esigenze dell'utente. I trattamenti per indurre la ciliazione sono stati descritti in precedenza4,5.
NOTA: Il numero di seeding iniziale dipende dal tempo di raddoppio delle celle e deve essere determinato di conseguenza.
3. Colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie in vitro
- Riscaldare la paraformaldeide del 4% a RT. Preparare le pipette Pasteur, 1x PBS (RT), il contenitore dei rifiuti, i tubi conici da 15 mL, le micropipette (0,5–10 L, 20–200 L e 100–1.000 L) e le punte. Prendi le cellule dall'incubatrice e posizionale nella panca.
NOTA: La procedura di colorazione non deve essere eseguita in condizioni sterili. Tutte le soluzioni devono essere disponibili in RT. - Rimuovere i supporti da ogni pozzo. Lasciare il coperto all'interno del pozzo. Lavare delicatamente le celle 3x con 2 mL di 1x PBS. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere 2 mL del 4% PFA in ogni pozzo per fissare le cellule. Incubare per 10 min a RT. Rimuovere il PFA e lavare 3x con 1x PBS.
NOTA: Utilizzare sempre un volume sufficiente per coprire l'intero coperti durante i periodi di incubazione. Non lasciare mai asciugare le cellule. Non versare mai nessuna delle soluzioni direttamente sul coperto. - Preparare 0,5% Triton X-100 in 13 mL di 1x PBS 10 min prima dell'uso. Aggiungere 2 mL in ogni pozzo. Incubare per 15 min. Lavare delicatamente 4x con 1x PBS.
NOTA: Triton X-100 è insolubile in PBS a RT. Riscaldare la soluzione Triton X-100 dello 0,5% a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua per scioglierla. - Scongelare il siero di capra 5 minuti prima dell'uso. Diluire il siero di capra in 1x PBS in un rapporto 1:20 come soluzione di blocco. Aggiungere 150 L a ciascuna coverslip e incubare per 20 min a RT.
NOTA: Prolungare il periodo di blocco fino a 60 min se necessario. Non lavare le cellule dopo aver bloccato con siero di capra. - Scongelare gli anticorpi primari (ad esempio, tubulina alfa anti-acetilatata e tubulina anti-gamma) 5 minuti prima dell'uso. Diluire gli anticorpi separatamente in 1x PBS come segue: tubulina alfa anti-acetilatata del topo in un rapporto 1:800 e tubulina anti-gamma del coniglio in un rapporto 1:300. Rimuovere la soluzione di blocco. Non lavare. Aggiungere 150 L di entrambe le diluizioni anticorpo alle coperture e incubare per 60 min a RT.
NOTA: Se l'incubazione durante la notte utilizza 500–1.000 L delle soluzioni anticorpale primarie, sigillare la piastra del pozzo 6 con pellicola di paraffina e conservarlo a 4 gradi centigradi. In alternativa, utilizzare 150 L di anticorpi e incubare in una camera di umidità. - Rimuovere gli anticorpi primari. Lavare i coperture molto delicatamente 3x con 2 mL di 1x PBS. Preparare gli anticorpi secondari in 1x PBS diluendo separatamente Cy3 pecora anti-topo e Alexa Fluor488 capra anti-coniglio in un rapporto 1:300. Aggiungere 150 L di entrambe le diluizioni secondarie degli anticorpi alle coperture. Incubare per 45 minuti a RT al buio.
NOTA: Incubare al buio per evitare la fotobleaching. Altre combinazioni di anticorpi secondari possono essere utilizzate in base alle esigenze. - Preparare una soluzione DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) secondo le istruzioni del produttore. Conservare le aliquots in eccesso a -20 gradi centigradi. Diluire 10 L da un aliquot azionario (1:5.000) in 50 mL di 1x PBS. Aggiungere 2 mL di questa diluizione alle coperture. Incubare per 5 minuti a RT al buio.
NOTA: È importante incubare le cellule al buio per evitare il fotobleaching. La diluizione DAPI può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese. - Preparare 2 aghi, scivoli, pinzette e supporti di montaggio. Etichettare le diapositive.
- Rimuovere la soluzione DAPI dai pozzetti. Lavare 3x con 1x PBS. Inserire una goccia di supporto di montaggio su ogni diapositiva. Utilizzare l'ago per sollevare delicatamente il coperture dal fondo del pozzo. Capovolgere il coperto utilizzando le pinzette e posizionarlo delicatamente sopra la goccia del supporto di montaggio. Rimuovere con attenzione eventuali bolle.
- Proteggere i vetrini dalla luce e conservarli durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Utilizzare un microscopio fluorescente o confocale con ingrandimento elevato per visualizzare le ciglia primarie.
NOTA: Le diapositive possono essere conservate al buio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.
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Representative Results
La colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di alta qualità. In questi esperimenti, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie erano fissati, immunosorizzati e ritrattati in un microscopio fluorescente o confocale seguendo il protocollo sopra descritto. Il cilium primario è stato rilevato utilizzando l'acetilata tubulina e γ-tubulina. La valutazione delle ciglia primarie può essere eseguita su vari livelli e qualsiasi cambiamento in questo senso può essere collegato all'esposizione alle radiazioni ionizzanti, al metabolismo cellulare (ad esempio, alla fame) o al trattamento chimico (ad esempio, la citostatica)5,18.
L'effetto della radiazione ionizzante sulle ciglia primarie è stato studiato in varie linee cellulari (ad esempio, la linea cellulare mielasti C2C12), che sono state irradiate (2, 6, 10 e 20 Gy) e i cambiamenti nell'incidenza delle ciglia primarie analizzati. Secondo Filipova al.4, basse dosi di irradiazione non modificano il verificarsi di una singola ciglia primaria nelle cellule C2C12. Tuttavia, dosi più elevate di radiazioni ionizzanti (cioè 20 Gy) hanno indotto la comparsa di ciglia primarie multiple(Figura 1A,B,C). Analogamente, quando le cellule NHLF sono state irradiate a 2 Gy, le ciglia primarie sono state rilevate dall'immunofluorescenza (Figura 2).
Lo stress metabolico è noto anche per aumentare la frequenza delle cigliaprimarie 19. In questo caso, i fibroblasti MEF sono stati affamati e analizzati per i cambiamenti nell'incidenza delle ciglia primarie (Figura 3).
La colorazione dell'immunofluorescenza ha rivelato che le cellule fibroblasti trasportavano ciglia primarie dopo il trattamento con doxorubina e taxol. Quei fibroblasti trattati con 120 nM doxorubicin esprimevano un unico cilio primario (Figura 4); dosi più elevate hanno indotto la comparsa di ciglia primarie multiple (Figura 5). Il trattamento con 1,25 nM taxol ha portato anche alla presenza di un unico cilio primario (Figura 6). In contrasto con il trattamento con doxorubicin, ciglia multiple non sono stati rilevati dopo il trattamento con dosi più elevate di taxol5.
Figura 1: occorrenza di ciglia primarie nelle cellule C2C12 irradiate. Fotografie rappresentative delle ciglia primarie nelle celle C2C12. Il rilevamento primario delle ciglia è stato eseguito dall'immunofluorescenza. L'ascia (freccia) delle ciglia primarie è stata valutata con l'anticorpo acetilato della tubulina (rosso) e il corpo basale da un anticorpo γ-tubulina (freccia, verde). Nuclei erano macchiati di DAPI (blu). (A) e (B) sono state osservate ciglia multiple 72 h dopo l'irradiazione con 20 Gy. (C) Ciglia primarie singole dopo 72 h irradiazione con 20 Gy4. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevamento delle ciglia primarie nelle cellule NHLF irradiate. Fotografie rappresentative delle ciglia primarie nelle celle NHLF. Il rilevamento delle ciglia primarie (freccia) è stato eseguito dall'immunofluorescenza. Gli assonomi delle ciglia primarie erano macchiati con anticorpo acetilato (rosso) e i corpi basali con anticorpo γ-tubulina (verde). Nuclei erano macchiati di DAPI (blu). Ciglia primarie singole 24 ore dopo l'irradiazione a 2 Gy. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Incidenza delle ciglia primarie nelle cellule MEF dopo lo stress metabolico indotto dalla fame del siero. Fotografie rappresentative delle ciglia primarie 24 h dopo la fame del siero (0,1% FBS) nelle cellule MEF. Il rilevamento delle ciglia primarie (freccia) è stato eseguito dall'immunofluorescenza. Gli assomimi sono stati etichettati con anticorpo acetito-tubulina (rosso). I corpi basali erano macchiati γ anticorpo a-tubulina (verde). Nuclei erano macchiati di DAPI (blu). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Fotografie rappresentative delle ciglia primarie nei fibroblasti cutanei. Il rilevamento delle ciglia primarie (freccia) è stato eseguito dall'immunofluorescenza. Le ciglia primarie erano macchiate con anticorpo acetito-tubulina (rosso), mentre i corpi basali erano macchiati con anticorpo γ-tubulina (verde). Nuclei erano macchiati di DAPI (blu). Ciglia primarie sono state rilevate 72 h dopo il trattamento con 120 nM doxorubicin5. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Fotografie rappresentative di ciglia multiple nei fibroblasti della pelle. Il rilevamento delle ciglia primarie (freccia) è stato eseguito dall'immunofluorescenza. Gli assonomi sono stati etichettati con l'anticorpo acetito-tubulina (rosso) e i corpi basali sono stati macchiati con γ-tubulina (verde). Nuclei erano macchiati di DAPI (blu). Ciglia multiple sono state rilevate 72 h dopo il trattamento con 120 nM doxorubicin5. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Fotografie rappresentative di fibroblasti cutanei trattati con taxol. Le ciglia primarie (freccia) sono state rilevate dall'immunofluorescenza. Le ciglia primarie erano macchiate con anticorpo acetilato (rosso) e con γ-tubulina (verde). I nuclei Axoneme erano macchiati di DAPI (blu). Ciglia primarie sono state rilevate 72 h dopo il trattamento con 1,25 nM taxol5. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Diversi autori hanno descritto diversi metodi per il rilevamento delle ciglia primarie, a volte anche descrivendo vari metodi di fissazione che possono influenzare il lororilevamento 6,20,21,22. Indipendentemente da ciò, è difficile trovare un protocollo completo e diretto per il rilevamento. La disponibilità di tale metodo sarebbe indubbiamente di grande aiuto per lo studio dell'indagine primaria sulle ciglia, soprattutto nelle prime fasi della ricerca o per un metodo rapido e facile per testare la presenza di ciglia primarie in una linea cellulare scelta. Pertanto, questo protocollo è descritto nel modo più dettagliato possibile per il rilevamento delle ciglia primarie in vitro dopo diversi tipi di trattamento.
Il presente protocollo è stato modificato per l'uso su basegiornaliera 20,23,24. Ad esempio, il 10% di formalina è stato sostituito dal 4% di PFA, la cui preparazione fresca è raccomandata a causa della sua breve durata di conservazione. Il PFA è una buona scelta per preservare la morfologia cellulare ed è particolarmente adatto alla visualizzazione delle proteine legate alla membrana. I solventi organici, come il metanolo, hanno un effetto disidratante sulla cellula e rimuovono piccole molecole solubili e lipidi durante il processo di fissazione, rendendolo così inadatto all'uso in determinati scenari25. La permeabilizzazione si ottiene con 0,5% Triton X-100 in 1x PBS per 15 min. Il siero di capra in una diluizione 1:20 in 1x PBS per 20 min viene utilizzato come agente di blocco. Entrambi gli anticorpi primari, tubulina anti-acetilated del topo e coniglio anti-γ-tubulina, possono essere incubati contemporaneamente per 60 min utilizzando una diluizione 1:800 e 1:300 in 1x PBS,rispettivamente 20,21,23,24. Inoltre, gli anticorpi secondari, anti-topo IgG (molecola intera) F(ab)2 frammento-Cy3 anticorpo prodotto in pecore e Alexa Fluor488 AffiniPure F(ab')2 frammento capra anti-coniglio IgG, sono stati diluiti 1:300 in 1x PBS. Sono stati incubati contemporaneamente per 45 minuti.
Potrebbe essere necessario adottare misure di standardizzazione supplementari nel caso in cui gli anticorpi primari siano incubati durante la notte. Durante lo sviluppo del protocollo si è scoperto che un'incubazione notturna ha bisogno di un volume di almeno 500-1.000 L di soluzione di anticorpi primari, la piastra del pozzo 6 deve essere sigillata con parafilm e lo stoccaggio deve essere a 4 gradi centigradi per prevenire l'evaporazione.
I passaggi più critici per la colorazione di successo delle ciglia primarie sono: 1) scelta della linea cellulare e pratica ottimale della coltura cellulare; 2) l'uso di coperture rivestite di gelatina; 3) uso costante di paraformaldeide fresca del 4%; 4) incubazione dell'anticorpo secondario e DAPI al buio; 5) eseguendo un leggero capovolgimento e posizionamento delle copertine sulla parte superiore del supporto di montaggio nella diapositiva.
Non sono previste potenziali limitazioni nelle future applicazioni del protocollo. Inoltre, la ricerca sulle ciglia primarie sta diventando sempre più rilevante in una varietà di campi e sono essenziali metodi di rilevamento delle ciglia facili, veloci e affidabili. Inoltre, questo protocollo faciliterà il futuro studio delle ciglia primarie nei tipi di cellule in cui le ciglia primarie sono state finora non rilevate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Difesa della Repubblica Ceca - Piano di sviluppo dell'organizzazione a lungo termine Aspetti medici delle armi di distruzione di massa della Facoltà di Scienze della salute militare, Università della Difesa; il Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport, repubblica Ceca (Progetto di Ricerca Specifico n. Grazie anche a Daniel Diaz per la sua gentile assistenza nella revisione in lingua inglese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
