Summary
一次繊毛は、中心に関連する細胞外構造である。免疫蛍光染色による一次繊毛検出は、非常に高品質な画像をもたらす比較的簡単な手順です。このプロトコルでは、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。
Abstract
一次繊毛は、細胞周期進行中、特に細胞周期のG0/G1段階の間に動的に調節され、有糸分裂の前に再調節される。一次繊毛は、透過型電子顕微鏡、3Dイメージング、または一次繊毛の自動検出のためのソフトウェアを使用するなど、高度に洗練された方法で視覚化することができます。しかしながら、これらの方法を行うためには、一次繊毛の免疫蛍光染色が必要である。本書では、アセチル化アルファチューブリン(axoneme)とガンマ管(基底体)を染色することにより、インビトロで一次繊毛を容易に検出するためのプロトコルについて説明する。この免疫蛍光染色プロトコルは比較的単純であり、高品質の画像をもたらします。本プロトコルは、原性繊毛を発現する4つの細胞株(C2C12、MEF、NHLF、および皮膚線維芽細胞)を、どのように固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した方法を記述する。
Introduction
原性繊毛は、細胞の母中心に関連する感覚的、孤独な、膜結合性、非モタイル構造である。原発性繊毛は、赤血球、血液胞子1、および肝細胞2を除くほとんどの脊椎動物細胞に見られる。原繊毛は、細管によって構成される細長い軸索として形成され、その主成分はαチューブリンである。アキソンムは、γチューブリンから構成される基底体から成長する。プライマリ繊毛の長さは2~10μmの間で変化する。しかし、その寸法は、グリチル化、飢餓、低酸素、細胞毒性ストレス、または電離放射線33、4、5、6、74,5,6,7への暴露後に変化する可能性があります。通常、細胞は一次シリウムを1つしか持っていないが、これは形態形成および細胞シグナル伝達経路に関与し、細胞増殖および分化に重要な8,99である。
一次繊毛は、細胞周期進行中、特にG0/G1相中に動的に調節され、HDAC6(ヒストンデアセチルラーゼ6)10によって媒介される管内脱アセチル化に関連する過程で有糸分裂に入る前10にリソードされる。一次繊毛吸収の正確な瞬間は,、オーロラA、Plk1、TcTex-1 11、12、1311,など、このプロセスに直接関与する細胞の種類と遺伝子の発現に依存する。1213細胞の種類に応じて、プライマリ繊毛は異なるタイプの受容体、イオンチャネル、および活性シグナル伝達経路を発現する。これらには、増殖および生存に影響を及ぼす最も重要なシグナル伝達受容体、EGFR、PDGFR、およびFGFRが含まれる。また、ヘッジホッグ、ノッチ、Wntを含む1つ以上の器官の機能に影響を与える可能性のあるシグナル伝達経路のいくつかも含まれています。この機能により、原発性繊毛は、ノッチ、ホルモン、セロトニンまたはソマトスタチンなどの生物学的に活性な物質に対する特異的なリガンドを検出することができます。異なる長さの一次繊毛によって示される他の特定の機能は、温度、重力、および浸透病性14の変化に対する反応を含む。
一次繊毛は、ライブビジュアライゼーション、透過電子顕微鏡、3Dイメージング、または一,次繊毛5、15、16、1715の5自動検出のためのソフトウェアなど、さまざまな方法を通じて可視化することができる。,1617しかし、これらの方法は高度に専門化されており、研究のあらゆる段階で原型繊毛を染色するための基本的で迅速で簡単な方法が必要です。記載は、培養細胞における一次繊毛の検出に対する簡易で有用な方法である。
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Protocol
1. 文化メディア、ソリューション、料理の準備
- カバーリップをオートクレーブ(22 x 22 mm)にします。6つのウェルプレートを準備します。ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質ペニシリン/ストレプトマイシンを解凍し、培養培地を室温(RT)まで温める。トリプシン-EDTAを使用する (0.25%)1x PBS(リン酸緩衝食塩分カルシウムとマグネシウム)を細胞を通過させる。
- 新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)をdH2O(20mLの20mLで800mgのPFA)で調製します。22PFAは各実験に対して新たに準備されなければならない。55°Cで溶液を攪拌し、ボンネットで30分間加熱します。溶液が明らかになるまで1M水酸化ナトリウムを加える(pH = 7.2-7.4)RTで冷却します。4°Cで1週間まで保管してください。
注: PFA は毒性があります。常に適切な個人用保護具を着用し、化学フードに準備します。 - 500 mL の培養培地、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン 1%、グルタミン 2% を含む DMEM (DULBEC の修正イーグル培地) を準備します。
- 1%ゼラチン溶液13 mLを滅菌dH2O(130mgのゼラチンを13mLのdH2Oで調製)6ウェルプレートに各ウェルに1%ゼラチンの2mLを使用してください。無菌を保ちます。
- 70%エタノールを使用して層流フードを洗浄します。実験を開始する前に、必要な材料を層流フードの内側に配置します。
2. 免疫細胞染色のための細胞培養
- 標準的な技術を用いて細胞(本研究ではC2C12、MEF、NHLF、および皮膚線維芽細胞)を解凍し、調製した培地の〜10〜12mLを添加したT75フラスコにプレートする。細胞が合流率70%に達するまで、37°C/5%CO2 /90%相対湿度(RH)でインキュベートします。2
- インキュベーターから細胞を取り出し、層流フードに入れます。培養培地を取り出し、1x PBSで細胞を2倍にすすめます。0.25%トリプシンEDTAの約2mLをT75フラスコに加え、37°Cで〜5分間インキュベートします。反転した顕微鏡を定期的に確認して、細胞の剥離を監視します。
注意:インキュベーション時間は細胞株によって異なるため、経験的に決定する必要があります。 - 10 mLの培養培地中の細胞を穏やかに再懸濁し、慎重にピペット処理して単一の細胞懸濁液を作り出す。必要に応じてフラスコを再びすすいします。
- 細胞懸濁液を50 mLの円錐管に入れ、遠心分離機を~200 x gで5分間置 きます。上清をデカントし、10 mLの培養培地を加え、ペレットを静かに再懸濁します。細胞懸濁液を20μLとし、トリパンブルーで1:1の比率で混合し、標準的な方法に従ってサイトメーターにカウントします。
- ピンセットを使用して6ウェルプレートの各ウェルの中に1つのカバースリップを置きます。ウェルに約2mLを注いで、カバーリップにゼラチンを塗ります。これにより、セルがカバーリップにアタッチされます。ゼラチン溶液を取り出し、数分間空気乾燥させます。カバーリップは細胞の培養の準備が整いました。すぐに栽培を開始します。
- 種子100,000線維芽細胞を各ウェルに入れ、2mLの培養培地を加える。細胞を37°C/5%CO2/90%RHで24時間培養する。この時点で、細胞は、ユーザのニーズに応じて処理することができる。毛様体化を誘導する治療法は、4,55に先に述べた。
注: 初期シード数はセルの倍時間によって異なり、それに応じて決定する必要があります。
3. インビトロにおける原型繊毛の免疫蛍光染色
- 4%パラホルムアルデヒドを温め、RT.パスツールピペット、1x PBS(RT)、廃液容器、15 mL円錐管、マイクロピペット(0.5~10μL、20~200μL、100~1,00μL)、先端を用意します。インキュベーターから細胞を取り出し、ベンチに置きます。
注:染色手順は、滅菌条件で行う必要はありません。すべてのソリューションは RT である必要があります。 - 各井戸からメディアを取り外します。カバースリップは井戸の中に置いておきなさい。細胞3xを2mLの1x PBSで非常に穏やかに洗います。パスツールピペットを使用して、各ウェルに4%PFAの2mLを加えて細胞を固定します。RTで10分間インキュベートし、PFAを取り出し、1x PBSで3倍洗います。
注:インキュベーション期間中は、カバースリップ全体をカバーするのに十分なボリュームを常に使用してください。細胞を乾燥させないでください。カバースリップに直接ソリューションを注ぎないでください。 - 0.5% トリトンX-100を13 mLの10分の10分で準備します。各ウェルに2mLを加えます。15分間インキュベートします。1倍のPBSで4倍とやさしく洗います。
注:トリトンX-100はRTでPBSに不溶性です。 - 使用前にヤギの血清5分を解凍します。ヤギの血清をブロッキング溶液として1:20比で1x PBSで希釈します。各カバースリップに150 μLを加え、RTで20分間インキュベートします。
注:必要に応じて、ブロック期間を最大60分まで延長してください。ヤギの血清でブロッキングした後、細胞を洗浄しないでください。 - 一次抗体(すなわち、抗アセチル化アルファチューブリンおよび抗ガンマ尿管)を使用する5分前に解凍する。1x PBSで抗体を別々に希釈する:マウス抗アセチル化アルファ尿細管を1:800比、ウサギの抗ガンマ尿管を1:300比で希釈します。ブロックソリューションを削除します。洗わないで下してください。両方の抗体希釈液をカバーリップに150 μL加え、RTで60分間インキュベートします。
注:一晩インキュベートする場合は、一次抗体溶液の500〜1,000 μLを使用する場合は、パラフィンフィルムで6ウェルプレートを密封し、4°Cで保存してください。 あるいは、150 μLの抗体を使用し、湿度チャンバ内でインキュベートします。 - 一次抗体を除去します。カバーリップを1x PBSの2 mLで3倍洗います。Cy3ヒツジの抗マウスとアレクサFluor488ヤギ抗ウサギを1:300比で別々に希釈することにより、1x PBSで二次抗体を調製します。両方の二次抗体希釈液の150 μLをカバースリップに加えます。暗闇の中でRTで45分間インキュベートします。
注:フォトブリーチを避けるために暗闇の中でインキュベート。二次抗体の他の組み合わせは、必要に応じて使用することができます。 - メーカーの指示に従ってDAPI(4'、6-ディミジノ-2-フェニリンドール)溶液を準備します。過剰なアリコートを-20°Cに保存する。 1x PBSの50 mLで、ストックアリコート(1:5,000)から10μLを希釈します。カバーリップにこの希釈液の2 mLを追加します。暗闇の中でRTで5分間インキュベートします。
注:光の漂白を避けるために暗闇の中で細胞をインキュベートすることが重要です。DAPI希釈は、4°Cで最大1ヶ月間保存できます。 - 針、スライド、ピンセット、取り付け用メディアを2枚用意します。スライドにラベルを付けます。
- ウェルから DAPI ソリューションを削除します。1x PBSで3倍洗います。各スライドに取り付けメディアを1滴置きます。針を使って、カバースリップをウェルの底からそっと持ち上げます。ピンセットを使用してカバースリップを反転し、取り付けメディアのドロップの上にそっと置きます。気泡を慎重に取り除きます。
- スライドを光から保護し、4 °Cで一晩保管してください。
- 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、高倍率でプライマリ繊毛を可視化します。
注:スライドは、最大2ヶ月間、4°Cの暗闇の中に保存することができます。
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Representative Results
原繊毛の免疫蛍光染色は、高品質の画像をもたらす比較的簡単な手順です。これらの実験では、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、上記のプロトコルに従って蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。一次シリウムはアセチル化αチューブリンおよびγチューブリンを用いて検出した。原繊毛の評価は、種々のレベルで行うことができるし、この点に関する任意の変化は、電離放射線、細胞代謝(例えば、飢餓)、または化学処理(例えば、細胞増殖抑制)5、18,18への曝露に関連することができる。
電離放射線が一次繊毛に及ぼす影響は、照射された様々な細胞株(例えば、筋芽細胞株C2C12)で研究されており、一次繊毛発生率の変化を分析した。al.4のフィリポワによれば、低い照射量はC2C12細胞における単一の一次繊毛の発生を変えない。しかし、電離放射線の高用量(すなわち、20Gy)は、多元繊毛の出現を誘発した(図1A、B、C)。同様に、NHLF細胞を2Gyで照射した場合、原クテリアは免疫蛍光によって検出された(図2)。
代謝ストレスは、原型繊毛19の頻度を増加させることも知られている。この場合、MEF線維芽細胞は飢え、原繊発生率の変化について分析した(図3)。
免疫蛍光染色は、線維芽細胞がドキソルービンおよびタキソールで処理した後に一次繊毛を運んだことを明らかにした。120 nMドキソルビシンで処理された線維芽細胞は、単一の一次シリウムを発現した(図4);高用量は、複数の一次繊毛の出現を誘発した(図5)。1.25 nMタキソールによる治療も、単一の一次シリウムの存在をもたらした(図6)。ドキソルビシンによる治療とは対照的に、多重繊毛は、高用量のタキソール5での治療後に検出されなかった。
図1:照射されたC2C12細胞における一次繊毛の発生。 C2C12細胞における原発繊毛の代表的な写真。原発性繊毛検出は、免疫蛍光によって行った。一次繊毛のアキソネム(矢印)をγ-tubulin抗体(矢印、緑色)によりアセチル化α-チューブリン抗体(赤色)および基底体で評価した。核はDAPI(青色)で染色した。(A)及び(B)多重繊毛を20Gyで照射した後72時間観察した。(C)20 Gy4で 72 時間照射した後の単一の一次繊毛 。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:照射されたNHLF細胞における原発繊 毛の検出NHLF細胞における原発繊毛の代表的な写真。初等繊毛(矢印)検出は、免疫蛍光によって行った。一次繊毛のアキソネムをアセチル化したα-チューブリン抗体(赤色)とγ-チューブリン抗体(緑色)を用いた基底体で染色した。核はDAPI(青色)で染色した。単一の一次繊毛は2Gyで照射後24時間。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:血清飢餓によって誘発された代謝ストレス後のMEF細胞における原発繊の発生率。 MEF細胞における血清飢餓後の原発繊毛24時間(0.1%FBS)の代表的な写真。初等繊毛(矢印)検出は、免疫蛍光によって行った。アセチル化α-チューブリン抗体(赤色)でアキサンドを標識した。基底体をγ-チューブリン抗体(緑色)で染色した。核はDAPI(青色)で染色した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:皮膚線維芽細胞における原発繊の代表的な写真。 初等繊毛(矢印)検出は、免疫蛍光によって行った。原性繊毛をアセチル化したα-チューブリン抗体(赤色)で染色し、一方、基底体をγ-チューブリン抗体(緑色)で染色した。核はDAPI(青色)で染色した。原発繊毛は、120 nMドキソルビシン5による処置後72時間検出された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 皮膚線維芽細胞における複数の繊毛の代表的な写真。 初等繊毛(矢印)検出は、免疫蛍光によって行った。アセチル化α-チューブリン抗体(赤色)によりアセキレートしたアキセネムを標識し、基底体をγ-tubulin抗体(緑色)で染色した。核はDAPI(青色)で染色した。120 nMドキソルビシン5による処置後72時間に複数の繊毛を検出した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:タキソールで治療した皮膚線維芽細胞の代表的な写真。 原発性繊毛(矢印)は蛍光免疫によって検出された。原性繊毛をアセチル化したα-チューブリン抗体(赤色)とγ-チューブリン抗体(緑色)で染色した。アキソンム核をDAPI(青色)で染色した。原発繊毛は、1.25 nMタキソール5で治療後72時間検出された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの,著者は、プライマリ繊毛の検出のための多様な方法を説明し、時には検出6、20、21、2220,に影響を与えることができる様々な固定方法も記述している。62122いずれにせよ、検出のための完全でわかりやすいプロトコルを見つけることは困難です。このような方法の準備ができたのは、特に研究の初期段階や、選択された細胞株におけるプライマリ繊毛の存在をテストするための迅速かつ容易な方法のために、一次繊毛調査の研究に大きな助けとなるであろう。したがって、このプロトコルは、異なる種類の治療後にインビトロで初代繊毛を検出するために可能な限り詳細に説明される。
現在のプロトコルは、,毎日20、23、24で使用するために変更されました。例えば、10%ホルマリンは4%PFAに置き換えられ、その新しい準備は、その短い貯蔵寿命のために推奨される。PFAは細胞形態を保存するのに適しており、膜結合タンパク質の可視化に特に適しています。メタノールなどの有機溶媒は、細胞に脱水作用を有し、固定プロセス中に小さな可溶性分子および脂質を除去し、従って、特定のシナリオ25での使用には不向きとなる。透過性は1x PBSで0.5%トリトンX-100で15分間達成される。1xPBS中の1:20希釈液中のヤギ血清を20分間、ブロッキング剤として使用する。一次抗体はいずれも、マウス抗アセチル化チューブリンとウサギの抗γ-チューブリン、1x PBSでそれぞれ1:800および1:300希釈を用いて60分間同時にインキュベート20,21,23,することができる。また、二次抗体は、抗マウスIgG(全分子)F(ab′)2断片-羊で産生されるF(ab′)2断片-Cy3抗体及びアレクサFluor488 AffiniPure F(ab')のフラグメントヤギ抗ウサギIgGを、1x PBSで1:300希釈した。彼らは45分間同時にインキュベートされた。
一次抗体を一晩インキュベートする場合は、追加の標準化手順を取る必要があります。プロトコルの開発中に、一晩のインキュベーションには少なくとも500〜1,000μLの一次抗体溶液の体積が必要であり、6ウェルプレートはパラフィルムで密封する必要があり、蒸発を防ぐために貯蔵は4°Cでなければならないことが判明しました。
一次繊毛の染色に成功するための最も重要なステップは、1)細胞株の選択と最適な細胞培養の実践です。2)ゼラチンコーティングカバーリップの使用;3)新鮮な4%パラホルムアルデヒドの一貫した使用;4)暗い二次抗体およびDAPIのインキュベーション;5)スライド内の取り付けメディアの上に、優しいフリップとカバースリップの配置を行います。
プロトコルの将来のアプリケーションには、予測される潜在的な制限はありません。また、一次繊毛研究は様々な分野で関連性が高まっており、容易で迅速かつ信頼性の高い繊毛検出法が不可欠です。さらに、このプロトコルは、原繊毛が検出されずにここまでであった細胞型における原線繊毛の将来の研究を促進する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません.
Acknowledgments
この作業は、チェコ共和国の防衛省によって支援されました - 長期組織開発計画軍事保健科学部の大量破壊兵器の医療側面、防衛大学;チェコ共和国教育・青年スポーツ省(特定研究プロジェクト第一:SV/FVZ201703)とPROGRES Q40/06また、英語の改訂で彼の親切な支援のためのダニエル・ディアスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
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