Summary
1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.
Abstract
1 차 적인 섬모는 세포 주기 진행 도중 동적으로 통제됩니다, 특히 세포 주기의 G0/G1 단계 도중, 미토시스의 앞에 resorbed되고. 1 차 섬모는 전송 전자 현미경 검사법, 3D 이미징, 또는 1 차 섬모의 자동 검출을 위한 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하여 고도로 정교한 방법으로 시각화될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 수행하기 위해서는 1차 섬모의 면역형성 염색이 필요하다. 이 간행물은 아세틸화 알파 튜룰린 (axoneme)과 감마 튜룰린 (기저 몸)을 염색하여 체외에서 1 차 섬모를 쉽게 검출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 면역 형광 염색 프로토콜은 비교적 간단하고 고품질의 이미지를 초래합니다. 본 프로토콜은 1차 섬모를 발현하는 4개의 세포주(C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)가 어떻게 고정되고 면역염색되고 형광 또는 공초점 현미경으로 이미지되었는지를 설명합니다.
Introduction
1 차 적인 섬모는 세포의 어머니 중심과 관련 되 었던 감각, 독방, 막 바인딩, 비 momotile 구조. 1 차 섬모는 적혈구, 백혈구1,및 간세포2를제외한 대부분의 척추 동물 세포에서 발견된다. 1차 섬모는 마이크로튜부에 의해 구성된 길쭉한 축소메로 형성되며, 그 주요 성분은 α-tubulin이다. 축 사 메는 기저체에서 성장, 이는 γ-tubulin에서 구조화. 기본 섬모의 길이는 2-10 μm 사이다릅니다. 그러나, 그 치수는 글리시션, 기아, 저산소증, 세포독성 스트레스, 또는 이온화 방사선3,,4,,5,,6,,7에노출 된 후 변경 될 수 있습니다. 일반적으로, 세포는 세포 증식 및 분화8,,9에중요한 형태 발생 및 세포 신호 경로에 관여하는 단 하나의 1 차실을 갖는다.
1차 섬모는 세포 주기 진행 중에, 특히 G0/G1 단계 동안 동적으로 조절되며, HDAC6(히스톤 deacetylase 6)10에의해 매개되는 튜룰린 탈염과 관련된 과정에서 미토시스를 입력하기 전에 재조판된다. 1차 섬모 재흡수의 정확한 순간은 오로라 A, Plk1, TcTex-1 11,1112,13과같은 이 과정에 직접 관여하는 유전자의 세포 유형 및 발현에 따라 달라집니다.,, 세포 유형에 따라, 1 차 적인 섬모는 수용체의 다른 모형을 표현합니다, 이온 채널, 및 액티브 신호 통로. 이들은 증식및 생존에 영향을 미치는 가장 중요한 신호 수용체를 포함, EGFR, PDGFR, 및 FGFR. 또한 고슴도치, 노치 및 Wnt. 이러한 수용체 및 신호 경로 덕분에 하나 이상의 장기의 기능에 영향을 줄 수 있는 신호 경로 중 일부가 포함되어 있으며, 1차 섬모는 또한 화학 감각 기능을 수행합니다. 이 기능을 통해 1 차 적인 섬모 는 노치에 대 한 특정 리간드를 감지 할 수 있습니다., 호르몬, 그리고 세로토닌 또는 somatostatin 같은 생물학적 활성 물질. 다른 길이의 기본 섬모에 의해 전시 된 다른 특정 기능은 온도, 중력 및 진동(14)의변화에 대한 반응을 포함한다.
1차 섬모는 라이브 시각화, 전송 전자 현미경, 3D 이미징, 또는 1차,섬모5,15,,5,16,17의자동 검출을 위한 소프트웨어에 의해 다양한 방법을 통해 시각화될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 고도로 전문화 하 고 지속적인 연구 연구의 모든 단계에서 기본, 신속 하 고 쉬운 방법을 필요. 기재된 배양된 세포에서 1차 섬모를 검출하기 위한 쉽고 유용한 방법이기 다.
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Protocol
1. 문화 매체, 솔루션 및 요리 준비
- 커버립(22 x 22mm)을 자동 클래브합니다. 6 개의 잘 접시를 준비하십시오. 태아 소 혈청 (FBS) 및 항생제 페니실린 / 연쇄 절제술을 하고 문체 배지를 실온 (RT)으로 따뜻하게합니다. 트립신-EDTA 사용 (0.25%) 및 1x PBS (칼슘과 마그네슘을 곁들인 인산염 완충식식염)이 세포를 통과한다.
- dH2O (800 mg의 PFA 에서 dH2O)로 신선한 4 % 파라 포름알데히드 (PFA)를 준비하십시오. PFA는 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다. 후드에서 30 분 동안 55 °C에서 용액을 저어 가열합니다. RT에서 냉각하십시오. 용액이 명확해질 때까지 1M 수산화 나트륨을 추가하십시오(pH = 7.2-7.4). 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오.
참고: PFA는 독성; 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 화학 후드에 준비합니다. - 문화 매체 500mL, DMEM(덜벡코의 수정 독수리 매체)은 10% FBS, 1% 페니실린/연쇄절제술, 글루타민 2%를 함유하고 있습니다.
- 멸균 dH2O (130 mg의 젤라틴 130 mg dH2O)로 13 mL의 젤라틴 용액13 mL을 준비하십시오. 6 웰 플레이트에 각 웰마다 1 % 젤라틴 2 mL을 사용합니다. 멸균을 유지합니다.
- 70% 에탄올을 사용하여 라미나르 플로우 후드를 청소하십시오. 실험을 시작하기 전에 라미나르 흐름 후드 내부에 필요한 재료를 배치합니다.
2. 면역 세포 화학 염색을위한 세포 배양
- 표준 기술을 사용하여 세포(본 연구에서 C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)를 해동하고 준비된 매체의 ~10-12mL로 보충된 T75 플라스크에서 이를 플레이트한다. 세포가 70%에 도달할 때까지237°C/5% CO 2/90%의 상대 습도(RH)에서 배양한다.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 라미나르 흐름 후드에 배치합니다. 배양 매체를 제거하고 1x PBS로 세포를 2배 짧게 헹구는 다. T75 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA의 ~2mL를 넣고 ~5분 동안 37°C에서 배양한다. 세포 분리를 모니터링하기 위해 반전 된 현미경에 주기적으로 확인하십시오.
참고: 잠복기 시간은 세포주에 따라 다르므로 경험적으로 결정되어야 합니다. - 10mL의 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재봉, 조심스럽게 파이펫팅하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 필요한 경우 플라스크를 다시 헹구십시오.
- 셀 서스펜션을 50mL 원심관과 원심분리기를 ~200 x g에서 5분 동안 배치합니다. 상류제를 데칭하고, 문화 매체의 10mL를 추가하고, 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 셀 서스펜션의 20 μL을 복용하고 1:1 비율로 트립팬 블루와 혼합하고 표준 방법에 따라 사이토미터에 세십시오.
- 핀셋을 사용하여 6 웰 플레이트의 각 웰 안에 하나의 커버 슬립을 놓습니다. 웰에 ~ 2 mL을 부어 젤라틴으로 커버립을 코팅합니다. 이렇게 하면 세포가 커버립에 부착하는 데 도움이 됩니다. 젤라틴 용액을 제거하고 몇 분 동안 공기 건조하게하십시오. 커버립은 이제 세포의 재배를 위한 준비가 되었습니다. 즉시 재배를 시작합니다.
- 각 우물에 100,000 섬유 아세포를 씨앗과 문화 매체의 2 mL을 추가합니다. 37°C/5% CO 2/90% RH에서224시간 동안 세포를 배양한다. 이 시점에서, 세포는 사용자의 요구에 따라 처리될 수 있다. 섬모를 유도하는 치료법은 이전에4,,5로기술되었다.
참고: 초기 시드 번호는 셀의 두 배 시간에 따라 달라지며 그에 따라 결정되어야 합니다.
3. 체외에서 1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색
- RT에 4% 파라포름알데히드를 따뜻하게 하십시오. 파스퇴르 파이펫, 1x PBS(RT), 폐기물 용기, 15mL 원문 관, 마이크로파이프(0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1,000 μL) 및 팁. 인큐베이터에서 세포를 가져 와서 벤치에 놓습니다.
참고: 염색 절차는 멸균 조건에서 수행 될 필요가 없습니다. 모든 솔루션은 RT에 있어야 합니다. - 각 우물에서 미디어를 제거합니다. 커버슬립을 우물 안에 둡니다. 매우 부드럽게 1 x PBS의 2 mL로 셀 3 x를 씻으십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 웰에 4% PFA의 2mL을 추가하여 세포를 수정합니다. RT에서 10분 동안 배양하십시오. PFA를 제거하고 1배 PBS로 3배 세척합니다.
참고: 항상 충분한 볼륨을 사용하여 인큐베이션 기간 동안 전체 커버슬립을 덮습니다. 세포를 건조시키지 마십시오. 커버슬립에 직접 솔루션을 붓지 마십시오. - 사용하기 10분 전에 13mL로 0.5% 트리톤 X-100을 준비한다. 각 웰에 2mL를 추가합니다. 15분 동안 배양합니다. 1x PBS로 부드럽게 4배 세탁하십시오.
참고: Triton X-100은 RT에서 PBS에서 불용성입니다. - 사용 5 분 전에 염소 세럼을 해동하십시오. 염소 세럼을 블로킹 솔루션으로 1:20 비율로 1x PBS로 희석합니다. 각 커버슬립에 150 μL을 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
참고: 필요한 경우 차단 기간을 최대 60분까지 연장합니다. 염소 세럼으로 차단 한 후 세포를 씻지 마십시오. - 1 차 적인 항체를 해동 (즉, 안티 아세틸화 알파 tubulin 및 항 감마 tubulin) 5 분 사용 전에. 1x PBS에서 항체를 1:800 비율로 마우스 안티 아세틸화 알파 튜룰린과 토끼 항감마 튜룰린을 1:300 비율로 희석시킨다. 차단 솔루션을 제거합니다. 씻지 마십시오. 커버립에 항체 희석제 150μL을 넣고 RT에서 60분 동안 배양합니다.
참고: 1차 항체 용액의 500-1,000 μL을 하룻밤 동안 배양하는 경우 파라핀 필름으로 6웰 플레이트를 밀봉하고 4°C에 보관하십시오. 또는, 150 μL의 항체를 사용하고 습도 챔버에서 배양한다. - 1 차적인 항체를 제거합니다. 1x PBS 2mL로 커버립을 3x매우 부드럽게 씻으십시오. Cy3 양 항마우스와 알렉사 플루오488 염소 항토끼를 1:300 비율로 희석하여 1x PBS에서 이차 항체를 준비한다. 커버립에 이차 항체 희석제 150 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 45 분 동안 배양하십시오.
참고: 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 배양하십시오. 이차 항체의 그밖 조합은 필요에 따라 이용될 수 있습니다. - 제조업체의 지침에 따라 DAPI(4', 6-디아미드노-2-페닐린돌) 솔루션을 준비합니다. -20°C에 초과 알리쿼트를 저장합니다. 1x PBS의 50mL에서 주식 알리쿼트(1:5,000)에서 10 μL을 희석시희석한다. 커버립에 이 희석 2mL를 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
참고: 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 세포를 배양하는 것이 중요합니다. DAPI 희석은 최대 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. - 2 개의 바늘, 슬라이드, 핀셋 및 장착 미디어를 준비합니다. 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
- 우물에서 DAPI 솔루션을 제거합니다. 1x PBS로 3배 세척합니다. 각 슬라이드에 마운팅 미디어를 한 방울 만 넣습니다. 바늘을 사용하여 우물 바닥에서 커버슬립을 부드럽게 들어 올립니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 뒤집어 마운팅 미디어를 부드럽게 놓습니다. 조심스럽게 거품을 제거합니다.
- 슬라이드를 빛으로부터 보호하고 4 °C에서 밤새 보관하십시오.
- 높은 배율로 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 1 차 적인 섬모를 시각화하십시오.
참고: 슬라이드는 최대 2개월 동안 4°C의 어둠 속에서 저장할 수 있습니다.
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Representative Results
1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색은 고품질 심상을 초래하는 상대적으로 간단한 절차입니다. 이러한 실험에서, 1차 섬모를 발현하는 섬유아세포는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 형광 또는 공초점 현미경으로 고정, 면역염색, 이미지화되었다. 1차 실륨은 아세틸화된 α-tubulin 및 γ-tubulin을 사용하여 검출되었다. 1차 섬모의 평가는 다양한 수준에서 수행될 수 있으며 이와 관련하여 임의의 변화는 이온화 방사선, 세포 대사(예를 들어, 기아), 또는 화학적 치료(예를 들어, 세포정전기)5,,18에노출될 수 있다.
1차 섬모에 대한 이온화 방사선의 효과는 조사된 다양한 세포주(예를 들어, myoblast 세포주 C2C12)에서 연구되고 있으며(2, 6, 10 및 20 Gy) 및 1차 섬모 발생률의 변화를 분석하였다. al.4에서필리포바에 따르면, 낮은 조사 량은 C2C12 세포에서 단일 1 차 섬모의 발생을 수정하지 않습니다. 그러나, 이온화 방사선의 더 높은 복용량 (즉, 20 Gy) 다중 원발성 섬모의 출현을 유도(도 1A, B, C). 유사하게, NHLF 세포가 2Gy에서 조사되었을 때 1차 섬모는 면역형광에 의해 검출되었다(도2).
대사 스트레스는 또한 1차 섬모의 빈도를 증가시키는 것으로 알려져있다(19) 이 경우, MEF 섬유아세포는 1차 섬모 발생률의 변화를 위해 굶주리고 분석하였다(도3).
면역 형광 염색은 섬유 아세포 세포가 독소 루빈과 탁솔로 치료 한 후 1 차 적인 섬모를 운반했다는 것을 밝혔습니다. 120nM 독소루비신으로 치료된 섬유아세포는 단일 1차 실륨(도4)을발현하였다. 더 높은 복용량은 다중 1 차 섬모의 모양을 유도(도 5). 1.25 nM 탁솔을 가진 처리는 또한 단일 1 차실(도 6)의존재를 초래했다. 독소루비신을 가진 처리와는 대조적으로, 다중 섬모는 탁솔5의더 높은 복용량으로 처리 후에 검출되지 않았습니다.
그림 1: 조사된 C2C12 세포에서 1차 섬모의 발생. C2C12 세포에서 1 차 섬모의 대표적인 사진. 1차 섬모 검출은 면역형광에 의해 수행되었다. 1차 섬모의 축손메(arrow)는 아세틸화α-tubulin 항체(red)와 기저체(arrow, green)로 평가하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. (A)및(B)다중 섬모는 20Gy와 조사 후 72h를 관찰하였다. (C)72h 조사 후 단일 1차 섬모와 20 Gy4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조사된 NHLF 세포에서 1차 섬모의 검출. NHLF 세포에서 1 차 섬모의 대표 사진. 1차 섬모(arrow) 검출은 면역형광에 의해 수행되었다. 1차 섬모의 축소메는 아세틸화 α-tubulin 항체(red)와 γ-tubulin 항체(green)를 가진 기초 체체로 염색하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 2 Gy에서 조사 후 24 시간 단일 기본 섬모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈청 기아에 의해 유도된 대사 스트레스 후 MEF 세포에서 1차 섬모의 발생률. MEF 세포에서 혈청 기아(0.1% FBS) 후 1차 섬모 24h의 대표적인 사진. 1차 섬모(arrow) 검출은 면역형광에 의해 수행되었다. 악소네메는 아세틸화 α-tubulin 항체(red)로 표지되었다. 기저 체는 γ-tubulin 항체 (녹색)로 염색하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 피부 섬유아세포에서 1차 섬모의 대표적인 사진. 1차 섬모(arrow) 검출은 면역형광에 의해 수행되었다. 1차 섬모는 아세틸화 α-tubulin 항체(red)로 염색되었고, 기저 체는 γ-tubulin 항체(green)로 염색되었다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 1차 섬모는 120nM 독소루비신5로치료 후 72h를 검출했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 피부 섬유아세포에서 여러 섬모의 대표적인 사진. 1차 섬모(arrow) 검출은 면역형광에 의해 수행되었다. 축소메는 아세틸화 α-tubulin 항체(red)에 의해 표지되었고 기저 체는 γ-tubulin 항체(green)로 염색하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 다중 섬모는 120 nM 독소루비신5로치료 후 72 h를 검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 탁솔로 치료된 피부 섬유아세포의 대표적인 사진. 1차 섬모(arrow)는 면역형광에 의해 검출되었다. 1차 섬모는 아세틸화된 α-tubulin 항체(red)와 γ-tubulin 항체(green)로 염색하였다. 악소네메 핵은 DAPI(파란색)로 염색하였다. 1차 섬모는 치료 후 72h로 검출되었고, 1.25 nM 탁솔5로처리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
몇몇 저자는 1 차적인 섬모의 검출을 위한 다양한 방법을 기술했습니다, 때때로6또한 그들의 검출6,20,,21,,22에영향을 미칠 수 있는 각종 고정 방법을 기술합니다. 에 관계없이 탐지를 위한 완전하고 간단한 프로토콜을 찾기가 어렵습니다. 이러한 방법의 준비 가용성은 의심 할 여지없이 1 차 섬모 조사의 연구에 큰 도움이 될 것입니다, 특히 연구의 초기 단계에서 또는 선택한 세포주에서 기본 섬모의 존재를 테스트하는 빠르고 쉬운 방법. 따라서, 이 프로토콜은 다른 종류의 치료 후 시험관 내 1차 섬모의 검출을 위해 가능한 한 많은 세부 사항으로 기술된다.
본 프로토콜은,매일20,23,,24에사용하기 위해 수정되었다. 예를 들어, 10%의 포르말린은 4% PFA로 대체되었으며, 저장 수명이 짧기 때문에 신선한 준비를 권장합니다. PFA는 세포 형태를 보존하기위한 좋은 선택이며 막 결합 단백질의 시각화에 특히 적합합니다. 메탄올과 같은 유기 용매는 고정 과정에서 세포에 탈수 효과를 가지며 고정 과정에서 작고 수용성 분자 및 지질을 제거하므로 특정시나리오(25)에서사용하기에 적합하지 않습니다. 1x PBS에서 0.5% 트리톤 X-100으로 15분 동안 투과가 달성됩니다. 염소 세럼은 1x PBS에서 1분 20분 동안 희석하여 블로킹 제로 사용된다. 1차 항체, 마우스 안티아세틸화 튜룰린 및 토끼 안티-γ-tubulin은 각각20,21,,23,,24로1x PBS에서 1:800 및 1:300 희석을 사용하여60분동안 동시에 배양될 수 있다. 또한, 이차 항체, 항마우스 IgG(전체 분자) F(ab′)2 단편-Cy3 항체는 양과 알렉사 플루오르488 아피니퓨어 F(ab')₂ 단편 염소 항토끼 IgG에서 생성되었으며, 1x PBS에서 1:300을 희석하였다. 그들은 45 분 동안 동시에 배양되었습니다.
1차 항체가 하룻밤 사이에 배양될 경우 추가 표준화 단계를 수행해야 할 수도 있다. 프로토콜의 개발 과정에서 야간 배양은 1차 항체 용액의 최소 500-1,000 μL의 부피를 필요로 하며, 6웰 플레이트는 파라필름으로 밀봉되어야 하며, 증발을 방지하기 위해 저장이 4°C여야 한다는 것을 발견했다.
1 차적인 섬모의 성공적인 염색을 위한 가장 중요한 단계는: 1) 세포주 및 최적 세포 배양 사례의 선택; 2) 젤라틴 코팅 커버립의 사용; 3) 신선한 4 % 파라 포름 알데히드의 일관된 사용; 4) 어둠 속에서 이차 항체 및 DAPI의 배양; 5) 슬라이드의 장착 매체 위에 커버 슬립의 부드러운 플립 및 배치를 수행.
프로토콜의 향후 응용 프로그램에는 예측가능한 잠재적 제한 사항이 없습니다. 또한, 1차 섬모 연구는 다양한 분야에서 더욱 관련성이 높아지고 있으며, 쉽고 빠르며 신뢰할 수 있는 섬모 검출 방법이 필수적입니다. 또한, 이 프로토콜은 1차 섬모가 발견되지 않은 세포 유형에서 1차 섬모의 향후 연구를 용이하게 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 체코 국방부에 의해 지원되었다 - 장기 조직 개발 계획 군사 보건 과학 학부의 대량 살상 무기의 의료 측면, 국방부; 교육부, 청소년 및 스포츠, 체코 (특정 연구 프로젝트 번호: SV / FVZ201703) 및 PROGRES Q40/06. 또한 다니엘 디아즈에게 영어 개정에 대한 그의 친절한 도움에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
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