Summary
Primær flimmerhår er ekstracellulære strukturer forbundet med centriole. Primær deteksjon av flimmerhår av immunofluorescerende farging er en relativt enkel prosedyre som resulterer i ekstremt bilder av høy kvalitet. I denne protokollen ble fibroblaster som uttrykte primære flimmerhårene faste, immunostained og avbildet i et fluorescerende eller konfokalt mikroskop.
Abstract
Primær flimmerhår er dynamisk regulert under cellesyklusprogresjon, spesielt under G0/G1-fasene av cellesyklusen, som resorberes før mitose. Primær flimmerhår kan visualiseres med svært sofistikerte metoder, inkludert transmisjonselektronmikroskopi, 3D-bildebehandling eller bruk av programvare for automatisk påvisning av primære flimmerhår. Imidlertid er immunofluorescerende farging av primær flimmerhår nødvendig for å utføre disse metodene. Denne publikasjonen beskriver en protokoll for enkel påvisning av primære flimmerhår in vitro ved farging acetylated alfa tubulin (axoneme) og gamma tubulin (basal kropp). Denne immunofluorescerende fargeprotokollen er relativt enkel og resulterer i bilder av høy kvalitet. Den nåværende protokollen beskriver hvordan fire cellelinjer (C2C12, MEF, NHLF og hudfibroblaster) som uttrykker primære flimmerhår ble fikset, immunostet og avbildet med et fluorescerende eller konfokalt mikroskop.
Introduction
Primær flimmerhår er sensoriske, ensomme, membranbundne, ikke-motile strukturer forbundet med cellens mor centriole. Primære flimmerhår finnes på de fleste virveldyrceller med unntak av røde blodlegemer, adipocytter1og hepatocytter2. Primær flimmerhår dannes som en langstrakt axoneme sammensatt av mikrotubuli, hvis hovedkomponent er α-tubulin. Aksonmen vokser fra basalkroppen, som er strukturert fra γ-tubulin. Lengden på den primære cilia varierer mellom 2-10 μm; imidlertid kan dimensjonene endres under glyylering, sult, hypoksi, cytotoksisk stress, eller etter eksponering for irioniserendestråling 3,4,5,6,7. Vanligvis har celler bare en primær cilium, som er involvert i morfogenese og cellesignalveier som er viktige for cellespredning og differensiering8,,9.
Primær flimmerhårene reguleres dynamisk under cellesyklusprogresjon, spesielt i G0/G1-fasene, og resorberes før de går inn i mitose i en prosess forbundet med tubulin deacetylering mediert av HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Det nøyaktige øyeblikket for primær cilia resorpsjon avhenger av celletype og uttrykk for gener direkte involvert i denne prosessen, for eksempel Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Avhengig av celletypen uttrykker den primære beholderen ulike typer reseptorer, iionkanaler og aktive signalveier. Disse inkluderer de viktigste signalreseptorene som påvirker spredning og overlevelse, EGFR, PDGFR og FGFR. Også inkludert er noen av signalveiene som kan påvirke funksjonen til ett eller flere organer, inkludert Hedgehog, Notch og Wnt. Takket være disse reseptorene og signalveiene utfører primærflimmeri også en kjemosensorisk funksjon. Denne funksjonen gjør det mulig for primære flimmerhår å oppdage spesifikke ligander for hakk, hormoner og biologisk aktive stoffer som serotonin eller somatostatin. Andre spesifikke funksjoner utstilt av primære flimmerhår av forskjellige lengder inkluderer reaksjon på endringer i temperatur, tyngdekraft og osmolalitet14.
Primær flimmerhår kan visualiseres gjennom ulike metoder, for eksempel live visualisering, transmisjonselektronmikroskopi, 3D-bildebehandling eller ved programvare for automatisk påvisning av primære cilia5,,15,,16,,17. Disse metodene er imidlertid svært spesialiserte og pågående forskningsbehov grunnleggende, raske og enkle metoder for farging av primærflimmerhår i alle stadier av forskningen. Beskrevet er en enkel og nyttig metode for påvisning av primære flimmerhår i kultiverte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av kulturmedier, løsninger og retter
- Autoklav dekkslips (22 x 22 mm). Forbered 6 brønnplater. Tin fosterbovinserum (FBS) og antibiotika penicillin/streptomycin og varm kulturmediet til romtemperatur (RT). Bruk trypsin-EDTA (0,25 %) og 1x PBS (fosfat bufret saltvann med kalsium og magnesium) for å passere cellene.
- Forbered fersk 4 % paraformaldehyd (PFA) i dH2O (800 mg PFA i 20 ml dH2O). PFA må være nylaget for hvert eksperiment. Rør og varm oppløsningen ved 55 °C i 30 min i hetten. Avkjøl ved RT. Tilsett 1 M natriumhydroksid til oppløsningen blir klar (pH = 7,2–7,4). Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
Merk: PFA er giftig; bruk alltid tilstrekkelig personlig verneutstyr og forberede seg i den kjemiske hetten. - Forbered 500 ml kulturmedier, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle medium) som inneholder 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2% glutamin.
- Forbered 13 ml 1 % gelatinoppløsning i steril dH2O (130 mg gelatin i 13 ml dH2O). Bruk 2 ml 1% gelatin for hver brønn i en 6 brønnplate. Hold deg steril.
- Rengjør laminærstrømningshetten med 70 % etanol. Plasser det nødvendige materialet inne i laminærstrømningshetten før du starter forsøket.
2. Cellekultur for immunocytochemistry farging
- Tin cellene (i denne studien C2C12, MEF, NHLF, og hud fibroblaster) ved hjelp av standard teknikker og plate dem i en T75 kolbe supplert med ~ 10-12 ml av forberedt media. Inkuber ved 37 °C/5 % CO2/90 % relativ fuktighet (RF) til cellene når 70 % samløpet.
- Fjern cellene fra inkubatoren og plasser dem i laminær strømningshette. Fjern kulturmediet og skyll cellene kort 2x med 1x PBS. Legg ~ 2 ml på 0,25% trypsin-EDTA i T75 kolben og inkuber ved 37 ° C i ~ 5 min. Kontroller regelmessig på det inverterte mikroskopet for å overvåke celleavløsning.
MERK: Inkubasjonstiden avhenger av cellelinjen og må derfor bestemmes empirisk. - Forsiktig resuspend cellene i 10 ml kultur media, pipettering nøye for å skape en enkelt celle suspensjon. Skyll kolben igjen om nødvendig.
- Plasser cellefjæringen i et konisk rør på 50 ml og sentrifuge i 5 min ved ~200 x g. Dekanter det overnaturante, tilsett 10 ml kulturmedier, og forsiktig resuspend pellet. Ta 20 μL av cellefjæringen og bland i et 1:1-forhold med trypanblå og tell i et cytometer etter standardmetoden.
- Plasser en dekkslip inne i hver brønn av en 6 brønnplate ved hjelp av pinsett. Coat dekkglassene med gelatin ved å helle ~ 2 ml i brønnene. Dette vil hjelpe cellene feste til dekkglassene. Fjern gelatinoppløsningen og la lufttørke i noen minutter. Dekkslipsene er nå klare for dyrking av cellene. Start dyrkingen umiddelbart.
- Seed 100.000 fibroblaster i hver brønn og legg til 2 ml kulturmedier. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C/5 % CO2/90 % RF. På dette punktet kan cellene behandles i henhold til brukerens behov. Behandlinger for å indusere ciliasjon har tidligere blitt beskrevet4,5.
MERK: Det første såingsnummeret avhenger av cellenes doblingstid og bør bestemmes tilsvarende.
3. Immunofluorescerende farging av primær flimmerhår in vitro
- Varm 4 % paraformaldehyd til RT. Klargjør Pasteurpipetter, 1x PBS (RT), avfallsbeholder, 15 ml koniske rør, mikropipetter (0,5–10 μL, 20–200 μL og 100–1000 μL) og spisser. Ta cellene fra inkubatoren og plasser dem på benken.
MERK: Fargeprosedyren trenger ikke utføres under sterile forhold. Alle løsninger må være på RT. - Fjern medier fra hver brønn. La dekksglasset stå inne i brønnen. Vask cellene forsiktig 3x med 2 ml 1x PBS. Bruk en Pasteur pipette, legg til 2 ml 4% PFA i hver brønn for å fikse cellene. Inkuber i 10 min ved RT. Fjern PFA og vask 3x med 1x PBS.
MERK: Bruk alltid et tilstrekkelig volum til å dekke hele dekkglasset i inkubasjonsperiodene. La aldri cellene tørke. Hell aldri noen av løsningene direkte på dekkglasset. - Forbered 0,5 % Triton X-100 i 13 ml 1x PBS 10 min før bruk. Legg til 2 ml i hver brønn. Inkuber i 15 min. Vask forsiktig 4x med 1x PBS.
MERK: Triton X-100 er uoppløselig i PBS ved RT. Varm opp 0,5 % Triton X-100-oppløsningen til 37 °C i et vannbad for å oppløse den. - Tin geiteserum 5 min før bruk. Fortynn geiteserumet i 1x PBS i et 1:20-forhold som en blokkeringsløsning. Tilsett 150 μL i hver dekkslipp og inkuber i 20 min ved RT.
MERK: Utyve blokkeringsperioden opptil 60 min om nødvendig. Ikke vask cellene etter blokkering med geiteserum. - Tin de primære antistoffene (det vil vil vil at anti-acetylated alfa tubulin og anti-gamma tubulin) 5 min før bruk. Fortynn antistoffene separat i 1x PBS som følger: mus anti-acetylated alfa tubulin i et 1:800 forhold og kanin anti-gamma tubulin i et 1:300 forhold. Fjern blokkeringsløsningen. Ikke vask. Tilsett 150 μL av begge antistofffortynningene til dekkglassene og inkuber i 60 min ved RT.
MERK: Hvis du ruger over natten, bruk 500–1000 μL av de primære antistoffløsningene, forsegler du 6 brønnplaten med parafinfilm og oppbevares ved 4 °C. Alternativt kan du bruke 150 μL antistoff og inkubere i et fuktighetskammer. - Fjern de primære antistoffene. Vask dekkglassene veldig forsiktig 3x med 2 ml 1x PBS. Forbered de sekundære antistoffene i 1x PBS ved separat fortynne Cy3 sauer anti-mus og Alexa Fluor488 geit anti-kanin i et 1:300 forhold. Tilsett 150 μL av begge sekundære antistofffortynninger til dekkglassene. Inkuber i 45 min ved RT i mørket.
MERK: Inkuber i mørket for å unngå fotobleaching. Andre kombinasjoner av sekundære antistoffer kan brukes etter behov. - Forbered en DAPI -løsning (4', 6-diamidino-2-fenylindol) i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar overflødige aliquots ved -20 °C. Fortynn 10 μL fra en aksje aliquot (1:5,000) i 50 ml av 1x PBS. Tilsett 2 ml av denne fortynningen til dekkslepene. Inkuber i 5 min ved RT i mørket.
MERK: Det er viktig å inkubere cellene i mørket for å unngå fotobleaching. DAPI-fortynningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. - Forbered 2 nåler, sklier, pinsett og monteringsmedier. Merk lysbildene.
- Fjern DAPI-løsningen fra brønnene. Vask 3x med 1x PBS. Sett én dråpe monteringsmedier på hvert lysbilde. Bruk nålen til å løfte dekkslippen forsiktig fra brønnens bunn. Snu dekkslepperen med pinsettene og plasser den forsiktig over dråpen med monteringsmedier. Fjern forsiktig eventuelle bobler.
- Beskytt lysbildene mot lys og oppbevar dem over natten ved 4 °C.
- Bruk et fluorescerende eller konfokalt mikroskop med høy forstørrelse for å visualisere den primære flimmerhårene.
MERK: Lysbildene kan oppbevares i mørket ved 4 °C i opptil 2 måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunofluorescerende farging av primære flimmerhår er en relativt enkel prosedyre som resulterer i bilder av høy kvalitet. I disse eksperimentene ble fibroblaster som uttrykte primære flimmerhårene faste, immunostained og avbildet i et fluorescerende eller konfokalt mikroskop etter protokollen beskrevet ovenfor. Det primære ciliumet ble oppdaget ved hjelp av acetylated α-tubulin og γ-tubulin. Evalueringen av primære flimmerhår kan utføres på ulike nivåer, og enhver endring i denne forbindelse kan knyttes til eksponering for irioniserende stråling, cellemetabolisme (f.eks. sult) eller kjemisk behandling (f.eks. cytostatika)5,18.
Effekten av irritasjonsstråling på primære flimmerhår er undersøkt i ulike cellelinjer (f.eks. myoblastcellelinjen C2C12), som ble bestrålt (2, 6, 10 og 20 Gy) og endringene i primær cilia forekomst analysert. Ifølge Filipova ved al.4endrer lave bestrålingsdoser ikke forekomsten av en enkelt primær flimmerhår i C2C12-celler. However, higher doses of ionizing radiation (i.e., 20 Gy) induced the appearance of multiple primary cilia (Figure 1A,B,C). Tilsvarende, når NHLF celler ble bestrålt ved 2 Gy den primære flimmerhår ble oppdaget ved immunofluorescence (Figur 2).
Metabolsk stress er også kjent for å øke frekvensen av primære cilia19. I dette tilfellet ble MEF fibroblaster sultet og analysert for endringer i primær cilia forekomst (figur 3).
Immunofluorescence farging viste at fibroblastceller bar primær flimmerhår etter behandling med doxorubin og taxol. De fibroblastene behandlet med 120 nM doksorubicin uttrykte en enkelt primær cilium (figur 4); høyere doser induserte utseendet til flere primære flimmerhår (figur 5). Behandling med 1,25 nM taxol resulterte også i tilstedeværelse av en enkelt primær cilium (figur 6). I motsetning til behandlingen med doksorubicin ble det ikke påvist flere flimmerhåre etter behandling med høyere doser taxol5.
Figur 1: Forekomst av primære flimmerhår i bestrålte C2C12-celler. Representative fotografier av primære cilia i C2C12 celler. Primær deteksjon av flimmerhår ble utført ved immunofluorescence. Aksonme (pil) av primærflimmerhår ble vurdert med acetylated α-tubulin antistoff (rød) og basal kroppen ved γ-tubulin antistoff (pil, grønn). Nuclei ble farget med DAPI (blå). (A) og (B) ble det observert flere flimmerhår 72 timer etter bestråling med 20 Gy. (C) Enkelt primær flimmerhår etter 72 t bestråling med 20 Gy4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Påvisning av primære flimmerhår i bestrålte NHLF-celler. Representative fotografier av primære flimmerhår i NHLF-celler. Primær deteksjon av flimmer (pil) ble utført ved immunofluorescence. Aksonene i primærflimmerhårene ble farget med acetylated α-tubulin antistoff (rød) og basallegemene med γ-tubulin antistoff (grønn). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Enkelt primære cilia 24 timer etter bestråling på 2 Gy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forekomst av primær flimmerhår i MEF-cellene etter metabolsk stress indusert av serumsult. Representative fotografier av primærflimmerhår 24 timer etter serumsult (0,1% FBS) i MEF-celler. Primær deteksjon av flimmer (pil) ble utført ved immunofluorescence. Axonemes ble merket med acetylated α-tubulin antistoff (rød). Basallegemer ble farget med γ-tubulin antistoff (grønn). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative fotografier av primære flimmerhår i hudfibroblaster. Primær deteksjon av flimmer (pil) ble utført ved immunofluorescence. Primær flimmerhår ble farget med acetylated α-tubulin antistoff (rød), mens basallegemene var farget med γ-tubulin antistoff (grønn). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Primær flimmerhår ble påvist 72 timer etter behandling med 120 nM doksorubicin5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative fotografier av flere flimmerhår i hudfibroblaster. Primær deteksjon av flimmer (pil) ble utført ved immunofluorescence. Aksonene ble merket med acetylated α-tubulin antistoff (rød) og basallegemene ble farget med γ-tubulin antistoff (grønn). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Flere flimmerhår ble påvist 72 timer etter behandling med 120 nM doksorubicin5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative fotografier av hudfibroblaster behandlet med taxol. Primær flimmerhår (pil) ble oppdaget ved immunofluorescence. Primær flimmerhår ble farget med acetylatert α-tubulin antistoff (rød) og med γ-tubulin antistoff (grønn). Axoneme kjerner ble farget med DAPI (blå). Primære flimmerhår ble påvist 72 timer etter behandling med 1,25 nM taxol5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere forfattere har beskrevet ulike metoder for påvisning av primære flimmerhår, noen ganger også beskriver ulike fikseringsmetoder som kan påvirkederes deteksjon 6,20,21,22. Uansett er det vanskelig å finne en komplett og grei protokoll for deteksjon. Den klare tilgjengeligheten av en slik metode ville utvilsomt være til stor hjelp til studiet av primær flimmerhårundersøkelse, spesielt i tidlige stadier av forskning eller for en rask og enkel metode for å teste tilstedeværelsen av primære flimmerhår i en valgt cellelinje. Derfor er denne protokollen beskrevet i så mye detalj som mulig for påvisning av primære flimmerhår in vitro etter ulike typer behandling.
Den nåværende protokollen ble endret for bruk daglig20,23,24. For eksempel ble 10% formalin erstattet av 4% PFA, hvis ferske preparat anbefales på grunn av kort lagringstid. PFA er et godt valg for å bevare cellemorfologi og er spesielt egnet til visualisering av membranbundne proteiner. Organiske løsemidler, som metanol, har en dehydrerende effekt på cellen og fjerner små, oppløselige molekyler og lipider under fikseringsprosessen, og gjør det dermed uegnet for bruk i visse scenarier25. Permeabilisering oppnås med 0,5% Triton X-100 i 1x PBS i 15 min. Geiteserum i en 1:20 fortynning i 1x PBS i 20 min brukes som et blokkeringsmiddel. Begge primære antistoffer, mus anti-acetylated tubulin og kanin anti-γ-tubulin, kan inkuberes samtidig i 60 min ved hjelp av en 1:800 og 1:300 fortynning i 1x PBS,henholdsvis 20,21,23,24. I tillegg ble de sekundære antistoffene, antimus-IgG (hele molekylet) F(ab′)2 fragment–Cy3 antistoff produsert i sauer og Alexa Fluor488 AffiniPure F(ab')₂ fragment geit anti-kanin IgG, fortynnet 1:300 i 1x PBS. De ble inkubert samtidig i 45 min.
Det kan være nødvendig å ta ekstra standardiseringstrinn dersom de primære antistoffene inkuberes over natten. Under utviklingen av protokollen ble det funnet at en inkubasjon over natten trenger et volum på minst 500–1000 μL primær antistoffløsning, 6-brønnplaten må forsegles med parafilm, og lagring må være ved 4 °C for å forhindre fordampning.
De mest kritiske trinnene for vellykket farging av primære flimmerhår er: 1) valg av cellelinje og optimal cellekulturpraksis; 2) bruk av gelatinbelagte dekkglass; 3) konsekvent bruk av fersk 4% paraformaldehyd; 4) inkubasjon av sekundært antistoff og DAPI i mørket; 5) utføre en mild flip og plassering av dekkglasset på toppen av monteringsmediet i lysbildet.
Det er ingen forutsette potensielle begrensninger i de fremtidige anvendelsene av protokollen. Videre blir primær flimmerhåring mer relevant på en rekke felt, og enkle, raske og pålitelige flimmerhårede metoder for deteksjon av flimmer er avgjørende. Videre vil denne protokollen legge til rette for fremtidig studie av primære flimmerhår i celletyper der primære flimmerhår har vært hittil uoppdaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet i Tsjekkia - Langsiktig organisasjon utviklingsplan Medisinske aspekter av masseødeleggelsesvåpen av Fakultet for militære helsevitenskap, Forsvarsuniversitet; Kunnskapsdepartementet, Ungdom og idrett, Tsjekkia (Spesifikt forskningsprosjekt nr: SV/ FVZ201703) og PROGRES Q40/06. Takk også til Daniel Diaz for hans vennlige hjelp i engelsk språkrevisjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
