Summary
Primära cilier är extracellulära strukturer som är associerade med centriole. Primära cilier upptäckt av immunofluorescent färgning är en relativt enkel procedur som resulterar i extremt högkvalitativa bilder. I detta protokoll, fibroblaster uttrycker primära cilier var fast, immunostained och avbildas i en fluorescerande eller confocal mikroskop.
Abstract
Primära cilier regleras dynamiskt under cellcykelns förlopp, specifikt under faserna G0/G1 av cellcykeln, som resorberas före mitos. Primära cilier kan visualiseras med mycket sofistikerade metoder, inklusive transmissionselektronmikroskopi, 3D-avbildning, eller med hjälp av programvara för automatisk detektering av primära cilier. Men immunofluorescent färgning av primära cilier behövs för att utföra dessa metoder. Denna publikation beskriver ett protokoll för enkel upptäckt av primära cilier in vitro genom färgning acetylerat alfa tubulin (axoneme) och gamma tubulin (basal kropp). Detta immunofluorescerande färgningsprotokoll är relativt enkelt och resulterar i bilder av hög kvalitet. Det föreliggande protokollet beskriver hur fyra cellinjer (C2C12, MEF, NHLF och hudfibroblaster) som uttrycker primära cilier var fasta, immunstainerade och avbildade med ett fluorescerande eller konfokalmikroskop.
Introduction
Primära cilier är sensoriska, solitary, membran-bundna, nonmotile strukturer som är associerade med cellens moder centriole. Primära cilier finns på de flesta ryggradsdjur celler med undantag av röda blodkroppar, adipocyter1, och hepatocyter2. Primära cilier bildas som en avlång axoneme komponerad av mikrotubuli, vars huvudkomponent är α-tubulin. Axonemen växer från den basala kroppen, som är strukturerad från γ-tubulin. Längden på den primära cilier varierar mellan 2–10 μm; dess dimensioner kan dock förändras under glykoliation, svält, hypoxi, cytotoxisk stress, eller efter exponering för joniserande strålning3,4,5,6,7. Vanligtvis har celler bara en primärcilium, som är involverad i morfogenes och cellsignaleringsvägar som är viktiga för cellproliferation och differentiering8,9.
Primära cilier regleras dynamiskt under cellcykelns förlopp, specifikt under G0/G1-faserna, och resorbed innan man går in mitos i en process som är associerad med tubulin deacetylation medierad av HDAC6 (hitondeacetylase 6)10. Det exakta ögonblicket för primär cilier resorption beror på celltyp och uttrycket av gener som är direkt involverade i denna process, såsom Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Beroende på celltyp uttrycker de primära cilierna olika typer av receptorer, jonkanaler och aktiva signalvägar. Dessa inkluderar de viktigaste signalreceptorerna som påverkar proliferation och överlevnad, EGFR, PDGFR, och FGFR. Också ingår några av de signalervägar som kan påverka funktionen av ett eller flera organ, inklusive Hedgehog, Notch, och Wnt. Tack vare dessa receptorer och signalvägar, den primära cilier också utföra en chemosensory funktion. Denna funktion gör det möjligt för primära cilier att upptäcka specifika ligander för Notch, hormoner, och biologiskt aktiva substanser såsom serotonin eller somatostatin. Andra specifika funktioner som uppvisas av primära cilier av olika längder inkluderar reaktion på förändringar i temperatur, gravitation, och osmolalitet14.
Primära cilier kan visualiseras genom olika metoder, såsom livevisualisering, transmissionselektronmikroskopi, 3D-avbildning, eller genom programvara för automatisk detektering av primär cilier5,15,16,17. Emellertid, dessa metoder är mycket specialiserade och pågående forskning behöver grundläggande, snabb, och enkla metoder för färgning primära cilier i varje skede av forskningen. Beskrivs är en enkel och användbar metod för detektion av primära cilier i odlade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av kultur media, lösningar, och rätter
- Autoklavera täcksliparna (22 x 22 mm). Förbered 6 brunnsplåtar. Thaw fetala bovin serum (FBS) och antibiotika penicillin/streptomycin och värma odlingsmediet till rumstemperatur (RT). Använd trypsin-EDTA (0,25%) och 1x PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning med kalcium och magnesium) för att få passage av cellerna.
- Bered färsk paraformaldehyd (PFA) med 4 % i dH2O (800 mg PFA i 20 mL dH2O). PFA måste vara nyförberedd för varje experiment. Rör om och värm lösningen vid 55 °C i 30 min i huven. Kyl ner vid RT. Tillsätt 1 M natriumhydroxid tills lösningen blir klar (pH = 7,2–7.4). Förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
Obs: PFA är giftigt; alltid bära tillräcklig personlig skyddsutrustning och förbereda i den kemiska huven. - Förbered 500 mL av kultur media, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) som innehåller 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, och 2% glutamin.
- Förbered 13 mL av 1% gelatinlösning i steril dH2O (130 mg gelatin i 13 mL av dH2O). Använd 2 mL av 1% gelatin för varje brunn i en 6 brunnsplatta. Håll steril.
- Rengör laminärflödeshuven med hjälp av 70% etanol. Placera det erforderliga materialet inuti laminärflödeshuven innan experimentet påbörjas.
2. Cellkultur för immuncytokemi färgning
- Tina cellerna (i denna studie C2C12, MEF, NHLF, och hudfibroblaster) med hjälp av standardtekniker och platta dem i en T75-kolv kompletterad med ~10–12 mL av det preparerade mediet. Inkubera vid 37 °C/5% CO2/90% relativ luftfuktighet (RH) tills cellerna når 70% sammanflödet.
- Ta bort cellerna från inkubatorn och placera dem i laminär flödeshuven. Ta bort odlingsmediet och skölj cellerna kort 2x med 1x PBS. Lägg till ~2 mL på 0,25 % trypsin-EDTA i T75-kolven och inkubera vid 37 °C i ~5 min. Kontrollera med jämna mellanrum på det inverterade mikroskopet för att övervaka cellavlossning.
OBS: Inkubationstiden beror på cellinjen och måste därför bestämmas empiriskt. - Försiktigt resuspend cellerna i 10 mL av kultur media, pipettering försiktigt för att skapa en enda cell suspension. Skölj kolven igen om det behövs.
- Placera cellupphängningen i ett 50 mL koniskt rör och centrifug i 5 min vid ~200 x g. Dekantera supernatanten, tillsätt 10 mL odlingsmedier och försiktigt återanvända pelleten. Ta 20 μL av cellupphängningen och blanda i ett 1:1-förhållande med trypanblått och räkna i en cytometer enligt standardmetoden.
- Placera en coverslip inuti varje brunn av en 6 väl platta med hjälp av pincett. Coat täck täck med gelatin genom att hälla ~ 2 mL i brunnarna. Detta kommer att hjälpa cellerna att fästa vid täcken. Ta bort gelatinlösningen och låt lufttorka i några minuter. De täcken är nu färdiga för odling av cellerna. Starta odlingen omedelbart.
- Frö 100.000 fibroblaster i varje brunn och tillsätt 2 mL av kultur media. Inkubera cellerna för 24 h vid 37 °C/5% CO2/90% RH. Vid denna punkt kan cellerna behandlas enligt användarens behov. Behandlingar för att inducera ciliation har tidigare beskrivits4,5.
OBS: Det ursprungliga sånumret beror på cellernas fördubblingstid och bör bestämmas i enlighet med detta.
3. Immunfluorescerande färgning av primära cilier in vitro
- Värm 4%-paraformaldehyden till RT. Förbered Pasteur-pipetter, 1x PBS (RT), avfallsbehållare, 15 mL koniska rör, mikropipetter (0,5–10 μL, 20–200 μL, och 100–1 000 μL) och spetsar. Ta cellerna från inkubatorn och placera dem i bänken.
OBS: Infärgningsproceduren behöver inte utföras under sterila förhållanden. Alla lösningar måste vara på RT. - Ta bort media från varje brunn. Lämna täckskydd inuti brunnen. Tvätta försiktigt cellerna 3x med 2 mL på 1x PBS. Med hjälp av en Pasteur-pipett, tillsätt 2 mL av 4% PFA i varje brunn för att fixera cellerna. Inkubera i 10 min vid RT. Ta bort PFA och tvätta 3x med 1x PBS.
OBS: Använd alltid en tillräcklig volym för att täcka hela täckkläckningen under inkubationsperioderna. Låt aldrig cellerna torka. Häll aldrig någon av lösningarna direkt på täcket. - Förbered 0,5% Triton X-100 i 13 mL på 1x PBS 10 min före användning. Lägg till 2 mL i varje brunn. Inkubera i 15 min. Tvätta försiktigt 4x med 1x PBS.
OBS: Triton X-100 är olösligt i PBS vid RT. Värm 0,5% Triton X-100 lösningen till 37 °C i ett vattenbad för att lösa upp den. - Tina getserum 5 min före användning. Späd getserumet i 1x PBS i ett 1:20-förhållande som en blockerande lösning. Tillsätt 150 μL till varje täckplatta och inkubera i 20 min vid RT.
OBS: Förläng blockeringsperioden upp till 60 min vid behov. Tvätta inte cellerna efter blockering med getserum. - Tina de primära antikropparna (dvs. anti-acetylerad alfa tubulin och anti-gamma tubulin) 5 min före användning. Späd antikropparna separat i 1x PBS enligt följande: mus anti-acetylerade alpha tubulin i en 1:800 förhållande och kanin anti-gamma tubulin i en 1:300 förhållande. Ta bort blockeringslösningen. Tvätta inte. Tillsätt 150 μL av båda antikroppsutspädningarna till täcklinerna och inkubera i 60 min vid RT.
OBS: Om du inkuberar användning över natten 500–1 000 μL av de primära antikroppslösningarna, förslut 6 brunnsplattan med paraffinfilm, och förvara vid 4 °C. Alternativt, använd 150 μL antikropp och inkubera i en fuktighetskammare. - Ta bort de primära antikropparna. Tvätta täcken mycket försiktigt 3x med 2 mL av 1x PBS. Förbered de sekundära antikropparna i 1x PBS genom att separat späda Cy3-får anti-mus och Alexa Fluor488 getanti-kanin i ett 1:300-förhållande. Tillsätt 150 μL av båda sekundära antikroppsutspädningarna till täcklinerna. Inkubera i 45 min vid RT i mörker.
OBS: Inkubera i mörker för att undvika fotoblekning. Andra kombinationer av sekundära antikroppar kan användas efter behov. - Förbered en DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindol) lösning enligt tillverkarens anvisningar. Förvara de överskjutande alikvoterna vid -20 °C. Späd 10 μL från en bestånds alikvot (1:5 000) i 50 mL 1x PBS. Tillsätt 2 mL av denna utspädning till täcken. Inkubera i 5 min vid RT i mörker.
OBS: Det är viktigt att inkubera cellerna i mörker för att undvika fotoblekning. DAPI-utspädningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad. - Förbered 2 nålar, diabilder, pincett och monteringsmedia. Märk bilderna.
- Ta bort DAPI-lösningen från brunnarna. Tvätta 3x med 1x PBS. Sätt en droppe monteringsmedia på varje bild. Använd nålen för att försiktigt lyfta täckskydden från brunnens botten. Vänd på täcket med hjälp av pincetten och placera den försiktigt över släppet av monteringsmedia. Ta försiktigt bort eventuella bubblor.
- Skydda objektglasen mot ljus och förvara dem över natten vid 4 °C.
- Använd ett fluorescerande eller konfokalmikroskop med hög förstoring för att visualisera de primära cilierna.
OBS: Objektglasen kan förvaras i mörker vid 4 °C i upp till 2 månader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den immunofluorescerande färgning av primära cilier är en relativt enkel procedur som resulterar i högkvalitativa bilder. I dessa experiment, fibroblaster uttrycker primära cilier var fast, immunostained och avbildas i en fluorescerande eller confocal mikroskop efter protokollet som beskrivs ovan. Den primära cilium upptäcktes med hjälp av acetylerade α-tubulin och γ-tubulin. Utvärderingen av primära cilier kan utföras på olika nivåer och varje förändring i detta avseende kan kopplas till exponering för joniserande strålning, cellmetabolism (t.ex., svält), eller kemisk behandling (t.ex. cytostatika)5,18.
Effekten av joniserande strålning på primära cilier har studerats i olika cellinjer (t.ex. myoblast cellinjen C2C12), som var bestrålade (2, 6, 10 och 20 Gy) och förändringarna i primära cilier incidens analyseras. Enligt Filipova vid al.4, modifierar låga bestrålningsdoser inte förekomsten av en enda primär cilier i C2C12-celler. Högre doser av joniserande strålning (dvs., 20 Gy) framkallade dock utseendet på flera primära cilier (Figur 1A,B,C). På samma sätt, när NHLF celler var bestrålade vid 2 Gy den primära cilier upptäcktes av immunofluorescens (Figur 2).
Metabolisk stress är också känt för att öka frekvensen av primära cilier19. I detta fall var MEF fibroblaster utsvultna och analyserade för förändringar i primära cilier incidensen (Figur 3).
Immunofluorescens färgning visade att fibroblast celler som primära cilier efter behandling med doxorubin och taxol. De fibroblaster som behandlades med 120 nM doxorubicin uttryckt en enda primärcilium (Figur 4); högre doser framkallade utseendet på flera primära cilier (Figur 5). Behandling med 1,25 nM taxol resulterade också i närvaro av en enda primär cilium (Figur 6). I motsats till behandlingen med doxorubicin upptäcktes inte flera cilier efter behandling med högre doser av taxol5.
Figur 1: Förekomst av primära flimmerhår i bestrålade C2C12-celler. Representativa fotografier av primära cilier i C2C12 celler. Primära cilia upptäckt utfördes av immunofluorescens. Axoneme (pil) av de primära cilier bedömdes med acetylerad α-tubulin antikropp (röd) och den basala kroppen genom γ-tubulin antikropp (pil, grön). Kärnor var färgas med DAPI (blå). (A) och (B) flera cilier observerades 72 h efter bestrålning med 20 Gy. (C) Enstaka primära flimmerhår efter 72 h bestrålning med 20 Gy4. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Påvisande av primära cilier i bestrålade NHLF-celler. Representativa fotografier av primära cilier i NHLF-celler. Primära cilier (pil) upptäckt utfördes av immunofluorescens. Den axonemes av de primära cilier var färgas med acetylated α-tubulin antikropp (röd) och de basala organ med γ-tubulin antikropp (grön). Kärnor var färgas med DAPI (blå). Enda primära cilier 24 timmar efter bestrålning vid 2 Gy. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Förekomst av primära cilier i MEF-cellerna efter metabolisk stress framkallad av serumsvält. Representativa fotografier av primära cilier 24 h efter serum svält (0,1% FBS) i MEF celler. Primära cilier (pil) upptäckt utfördes av immunofluorescens. Axonemes var märkta med acetylerade α-tubulin antikropp (röd). Basala organ var färgas med γ-tubulin antikropp (grön). Kärnor var färgas med DAPI (blå). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa fotografier av primära cilier i hudfibroster. Primära cilier (pil) upptäckt utfördes av immunofluorescens. Primära cilier var färgas med acetylerade α-tubulin antikropp (röd), medan de basala organ var färgas med γ-tubulin antikropp (grön). Kärnor var färgas med DAPI (blå). Primära cilier upptäcktes 72 h efter behandling med 120 nM doxorubicin5. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa fotografier av flera cilier i hudfibroster. Primära cilier (pil) upptäckt utfördes av immunofluorescens. De axonemes var märkta av acetylerad α-tubulin antikropp (röd) och de basala organen var färgas med γ-tubulin antikropp (grön). Kärnor var färgas med DAPI (blå). Flera cilier upptäcktes 72 h efter behandling med 120 nM doxorubicin5. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa fotografier av fibroblaster av huden som behandlats med taxol. Primära cilier (pil) upptäcktes av immunofluorescens. Primära cilier var färgas med acetylerad α-tubulin antikropp (röd) och med γ-tubulin antikropp (grön). Axoneme atomkärnor var färgas med DAPI (blå). Primära cilier upptäcktes 72 h efter behandling med 1.25 nM taxol5. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera författare har beskrivit olika metoder för detektering av primära cilier, ibland också beskriva olika fixeringsmetoder som kan påverka deras upptäckt6,20,21,22. Oavsett är det svårt att hitta ett komplett och okomplicerat protokoll för identifiering. Den färdiga tillgången på en sådan metod skulle utan tvekan vara till stor hjälp för att studera primär cilier utredning, särskilt i tidiga skeden av forskningen eller för en snabb och enkel metod för att testa förekomsten av primära cilier i en vald cellinje. Därför beskrivs detta protokoll så detaljerat som möjligt för påvisande av primära cilier in vitro efter olika sorters behandling.
Det föreliggande protokollet ändrades för användning på daglig basis20,23,24. Till exempel ersattes 10% formalin av 4% PFA, vars färska preparat rekommenderas på grund av dess korta lagringstid. PFA är ett bra val för att bevara cellmorfologi och är speciellt lämpad för visualisering av membranbundna proteiner. Organiska lösningsmedel, såsom metanol, har en uttorkande effekt på cellen och avlägsna små, lösliga molekyler och lipider under fixeringsprocessen, vilket gör den olämplig för användning i vissa scenarier25. Permeabilisering uppnås med 0,5% Triton X-100 i 1x PBS i 15 min. Getserum i en 1:20 utspädning i 1x PBS i 20 min används som blockeringsmedel. Både primära antikroppar, mus anti-acetylerad tubulin och kanin anti-γ-tubulin, kan inkuberas samtidigt i 60 min med hjälp av en 1:800 och 1:300 utspädning i 1x PBS,respektive 20,21,23,24. Dessutom späddes de sekundära antikropparna, anti-mouse IgG (hela molekylen) F(ab′)2-fragmentet–Cy3-antikroppen som produceras hos får och Alexa Fluor488 AffiniPure F(ab')1x PBS- fragmenteringsmedel för kanin IgG. De ruvades samtidigt i 45 min.
Det kan vara nödvändigt att vidta extra standardiseringssteg om de primära antikropparna skulle inkuberas över natten. Under utvecklingen av protokollet konstaterades att en inkubation över natten behöver en volym på minst 500–1 000 μL primärantikroppslösning, 6 brunnsplattan måste tätas med parafilm, och lagringen måste vara vid 4 °C för att förhindra avdunstning.
De mest kritiska stegen för framgångsrik färgning av primära cilier är: 1) val av cellinje och optimal cellkultur praxis; 2) användning av gelatinbelagda täcks täcken; 3) konsekvent användning av färsk 4% paraformaldehyd; 4) inkubation av den sekundära antikroppen och DAPI i mörker; 5) utför en mild flip och placering av coverslip ovanpå monteringsmedia i bilden.
Det finns inga förutses potentiella begränsningar i de framtida tillämpningarna av protokollet. Dessutom är primära cilier forskning blir mer relevant inom en mängd olika områden, och enkel, snabb och tillförlitlig cilier detektionsmetoder är väsentliga. Vidare kommer detta protokoll att underlätta den framtida studien av primära cilier i celltyper där primära cilier har hittills oupptäckta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av försvarsministeriet i Tjeckien - Långsiktig organisation utvecklingsplan Medicinska Aspekter av massförstörelsevapen vid fakulteten för militära hälsovetenskaper, Försvarshögskolan; ministeriet för utbildning, ungdomsfrågor och idrott, Tjeckien (särskilt forskningsprojekt nr: SV/ FVZ201703) och PROGRES Q40/06. Tack också till Daniel Diaz för hans vänliga hjälp i engelska språkrevidering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
