Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Подготовка клеточных экстрактов cryogrinding в автоматизированной морозильной мельницы

Published: January 29, 2021 doi: 10.3791/61164
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем надежный метод приготовления экстрактов целых клеток из дрожжей или других клеток с использованием криогенной морозильной мельницы, которая сводит к минимуму деградацию и денатурацию белков. Клеточные экстракты подходят для очистки функциональных белковых комплексов, протеомных анализов, исследований совместного иммунопреципиентации и обнаружения модификаций половых белков.

Abstract

Легкость генетических манипуляций и сильное эволюционное сохранение эукариотических клеточных машин в начинающих дрожжей Saccharomyces cerevisiae сделал его выдающимся генетическим моделью организма. Однако, поскольку эффективная белковая изоляция зависит от оптимального нарушения клеток, использование дрожжей для биохимического анализа клеточных белков затрудняется его клеточной стеной, которая дорого усваивается энзиматично (с помощью литиказы или зимолязы), и трудно нарушить механически (с помощью традиционного биение бисера, французский пресс или кофемолка), не вызывая нагрева образцов, что, в свою очередь, вызывает белок денатурации. Хотя ручная шлифовка дрожжевых клеток под жидким азотом (LN2) с использованием раствора и пестика позволяет избежать перегрева образцов, она является трудоемкой и подвержена изменчивости в клеточном лизе между операторами. На протяжении многих лет мы успешно готовим высококачественные дрожжевые экстракты с использованием криогринда клеток в автоматизированной морозильной фабрике. Температура -196 градусов по Цельсию, достигнутая с использованием LN2, защищает биологический материал от деградации протеазами и ядрами, позволяя извлекать нетронутые белки, нуклеиновые кислоты и другие макромолекулы. Здесь мы описываем этот метод подробно для начинающих дрожжевых клеток, который включает в себя первое замораживание суспензии клеток в буфере лиза через его капельное добавление в LN2 для генерации замороженных капель клеток, известных как "попкорн". Этот попкорн затем распыляется под LN 2 в морозильной камеремельницы для создания замороженных "порошкообразных" экстракт, который тает медленно и уточняется центрифугации для удаления нерастворимого мусора. Полученные экстракты готовы к применению ниже по течению, такие как очищение белка или нуклеиновой кислоты, протеомные анализы или исследования совместной иммунопреципиентации. Этот метод широко применим для подготовки клеточного экстракта из различных микроорганизмов, тканей растений и животных, морских образцов, включая кораллы, а также изоляции ДНК/РНК от судебно-медицинских и вечной мерзлоты ископаемых образцов.

Introduction

Дрожжи является популярной моделью организма для белковых исследований, так как это простой эукариотический организм с обилием генетических и биохимических инструментов, доступных дляисследователей 1. Из-за их прочной клеточной стенки, одна из проблем, с которыми сталкиваются исследователи, заключается в эффективном обливке клеток, не повреждая содержимое клеток. Различные методы доступны для получения белковых экстрактов путем нарушения дрожжевых клеток, которые включают в себя энзиматическийлиз (зимоляза)2,3,химическийлиз4,физическийлиз при замораживании оттепели5, давление на основе(французская пресса) 6,7 ,механические(стеклянные бусы, кофемолка)8,9, sonicationоснове 10 и криогенные2,11. Эффективность клеточного лиза и урожайность белка могут значительно варьироваться в зависимости от используемой техники, что влияет на конечный результат или пригодность для желаемого применения ниже по течению для лизата. При изучении нестабильных белков, которые имеют мимолетные посттрансляционные изменения или чувствительны к температуре, особенно важно использовать метод, который позволит свести к минимуму потерю или деградацию образца во время подготовки.

Техника приготовления экстракта Детали Преимущества Недостатки Анализ вниз по течению Ссылки
Французская пресса: Гомогенизатор высокого давления (он же Microfluidizer) с ферментативной предварительной обработкой с помощью зимолязы Зимоляза-20Т, микрофлюидизатор с высоким давлением гомогенизатора. Разрушитель состоит из насоса высокого давления, управляемого воздухом (коэффициент 1:250; требуемое давление воздуха 0,6 л MPa) и специальной камеры нарушения с дополнительным блоком давления спины. Для обработки требуется минимальный размер выборки 20 мл. Окончательное полное нарушение, полученное с помощью комбинированного протокола, приблизилось к 100% с 4 проходами под давлением 95 MPa, по сравнению с только 32% нарушением с 4 проходами на 95 MPa, используя только гомогенизацию без зимолязы. Не подходит для небольших приложений. Ферменты могут стать дорогими для крупномасштабных препаратов. Очищение белка 6
Бид заготовитель: ymolyase обработанные клетки lysed со стеклянными бусинками в fastprep инструмент Примерно равный объем холодных, сухих, промытых кислотой стеклянных бусинок калибра 0,5 мм добавляется к данному объему клеточных гранул в буфере лиза, а клетки нарушаются энергичным ручным возбуждением. Это особенно полезно при принятии экстрактов из различных малых культур дрожжей для анализа целей, а не для очистки белка. Во время процедуры стеклянной шарика, белки обрабатываются жестко вызывая обширную пену, ведущую к денатурации белка. Количество поломки клеток варьируется, в то время как протеолиза, а также модификации белков может возникнуть в результате нагрева экстракта выше 4 градусов по Цельсию во время механической поломки. Главным образом анализы дна и РНК, но также анализ протеина путем denaturing электрофеорез геля, или с или без западного blotting. 8
Лечение зимолязы с последующим лизом с использованием комбинации осмотического шока и гомогенизации Dounce После энзиматического пищеварения клеточных стенок, сферопласты лизаются от 15 до 20 ударов плотно облегающего пестика (клиренс от 1 до 3 мкм) в гомогенизаторе Dounce. Выгодно использовать штаммы с дефицитом протеазы, такие как BJ926 или EJ101. Это самый мягкий способ сломать дрожжевые клетки и, следовательно, он наиболее подходит для подготовки экстрактов, которые могут выполнять сложные энзиматические функции (например, перевод, транскрипция, репликация ДНК) и в которых целостность макромолекулярных структур (например, рибосомы, сращивания) должна быть сохранена. Он также полезен для изоляции нетронутых ядер, которые могут быть использованы для исследования хроматина (Bloom and Carbon, 1982) или для экстрактов ядерного белка (Lue and Kornberg, 1987). Основными недостатками процедуры лиза сферопласта являются то, что она является относительно утомительной и дорогостоящей, особенно для крупномасштабных препаратов (10 литров), а длительные инкубационые периоды могут привести к протеолизу или модификации белка.  Для препаратов хроматина, они, кажется, различного или более низкого качества, чем те, которые производятся дифференциальной центрифугации (на основе целостности нуклеосомной лестницы). Изоляция нетронутых ядер для исследований хроматина, экстракты, которые могут выполнять сложные энзиматические функции, экстракты, требующие целостности
макромолекулярные структуры, экстракты ядерного белка.		 2
Нарушение клеток флэш-замороженных клеток путем измельчения в жидком азоте с помощью раствора / пестика или блендера Клетки замораживаются сразу же в жидком азоте, а затем лися путем шлифования вручную в ступке с помощью пестика, или с помощью блендера Waring в присутствии жидкого азота. Протокол быстрый и простой. Он может вместить различное количество дрожжевых клеток, включая очень большие культуры. Его основным преимуществом является то, что клетки сразу же принимаются из активно растущего состояния в жидкий азот (196 градусов по Цельсию), уменьшая деградативную активность ферментов, таких как протеазы и нуклеазы, а также действия, которые изменяют белки (например, фосфаты и киназы). Он особенно подходит для изготовления цельноклеточных экстрактов из одной дрожжевой культуры для крупномасштабной очистки белка. Немного грязный и потенциально опасный для небрежного следователя. Небольшие образцы (т.е. от 10 до 100 мл дрожжевых культур) не легко обрабатываются, потому что не хватает массы замороженных клеточных комков, чтобы эффективно сломаться в блендере. Это занимает много времени для обработки отдельных образцов и очистки оборудования между использованиями. Цельноклеточные экстракты из одной дрожжевой культуры для крупномасштабной очистки белка. 2
Автолиз, бисероплетенка рН 5,0, 50 градусов по Цельсию, 24 ч, 200 об/мин / 0,5 мм, 5 × 3 мин/3 мин Быстрый и эффективныйлиз, особенно для мелкомасштабной подготовки экстракта Тепловая генерация приводит к денатурации и деградации макромолекул. Биб избиение оборудования требуется. Анализ малых масштабов. 10
Автолиз, Соникация рН 5,0, 50 градусов по Цельсию, 24 ч, 200 об/мин, 4 × 5 мин/2 мин, импульс 80%, мощность 80% Оборудование Sonication обычно доступно в большинстве учреждений. Тепловая генерация приводит к денатурации и деградации макромолекул. Требуется звуковое оборудование. Медленныйлиз может занять более 24 часов. Препараты дрожжевой клетки стенки.
Процесс кипения и замораживания оттепели Никакое специализированное оборудование не требуется, кроме стандартной морозильной камеры и отопительного блока или горячей водяной ванны. Эффективный, воспроизводимый, простой и недорогой. Тепловая генерация приводит к денатурации и деградации макромолекул. Анализ ДНК ПЦР. 5

Таблица 1: Сравнение методов, доступных для приготовления дрожжевых экстрактов.

Криогриндирование (также известное как криогенное измельчение/криогенное фрезерование) обычно используется для извлечения нуклеиновых кислот, белков или химических веществ из чувствительных к температуре образцов надежным образом для количественного или качественного анализа. Он успешно используется для различных применений в различных областях, включая биотехнологии, токсикологии,судебно-медицинской экспертизы 12,13, экологическая наука,биология растений 14 и пищевой науки. Изоляция нетронутых биологических макромолекул обычно критически зависит от температуры. Чрезвычайно низкие температуры гарантируют, что протеазы и нуклеазы остаются неактивными, что приводит к надежной изоляции нетронутых белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул для последующего анализа. Действительно, морозильная мельница обычно поддерживает температуру образца -196 градусов по Цельсию (точка кипения LN2), тем самым минимизируя ДНК/РНК или денатурацию и деградацию белка.

Морозильная мельница использует электромагнитную шлифовальную камеру, которая быстро перемещает твердый металлический бар или цилиндр туда и обратно в флаконе, содержащем образец, который будет распылен между пробками из нержавеющей стали. Инструмент создает и быстро меняет магнитное поле в шлифовальной камере. По мере того как магнитное поле смещает назад и вперед, магнит давит образец против штепсельной вилки таким образом достигая «криогриндировать» и pulverization попкорна. Морозильная мельница заменяет раствор и пестик и позволяет последовательной обработки нескольких образцов (или до 4 небольших образцов одновременно) с высокой воспроизводимости и позволяет избежать вариативности от пользователя к пользователю, связанные с ручной шлифовки. После обработки образцов экстракты клеток могут быть использованы для различных приложений ниже по течению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка дрожжевого попкорна

  1. Выращиваем дрожжевые клетки в 0,5 л YPD-медиа с плотностью 1 х 107 клеток/мл. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика Коултера или любых других средств.
  2. Центрифуги клетки в течение 10 мин при 2400 г и 4 градусов по Цельсию.
  3. Вымойте каждый образец один раз с 500 мл ледяной деионизированной 18 мега Ohm Милли-З воды.
  4. Resuspend гранулы в 15 мл ледяного Lysis Buffer No 20 мМ HEPES-KOH рН 7,5, 110 мМ ККл, 0,1% Tween, 10% глицерол, со свежеприложенным уменьшая агентом 10 мМ β-меркаптоэтанол, ингибитор протеазы коктейль, 10 ингибитор протеасомы МК-132, 1 мМ деацетилаза ингибитор ингибитора натрия бутират и ингибиторы фосфатазы (1 мМ натрия ванадат, 50 мМ фторид натрия, 50 мМ натрия β-глицерофосфат) . Дополнительную информацию можно посмотреть в таблице материалов. Храните повторно натучные ячейки на льду до тех пор, пока образцы не будут готовы к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Широкий спектр буферов лиза, содержащих ряд неионных моющих средств, может быть использован с образцами и конкретными ингибиторами, включенными в него на основе применения ниже по течению. Включение протеазы и протеасомных ингибиторов имеет решающее значение для предотвращения деградации белка, особенно после размораживания экстрактов.
  5. Сделать оснастки замороженных дрожжей попкорн, медленно добавляя клеточной подвески одну каплю за один раз с помощью предварительно охлажденной серологической пипетки в один или несколько 50 мл центрифуги трубки хранятся на сухом льду и заполнены LN2 до чуть ниже обода. Пополнить жидкий азот в трубке часто, чтобы компенсировать его потери из-за быстрого испарения. Работайте в хорошо проветриваемом помещении, чтобы избежать опасностей, связанных с удушьем азота.
    1. Вместо 50 мл трубки, использовать несколько 50 мл трубки связаны друг с другом (или любой контейнер с большим ртом, таких как большая пластиковая бутылка центрифуги, которые могут терпеть криогенные температуры) для поп-кукурузы подготовки (Рисунок 1A). Чем больше контейнер и его открытие, тем легче подготовка попкорна, так как это предотвращает слипание попкорна, чтобы сформировать большие агрегаты. Диапазон размеров 0,3-0,5 см для попкорна идеально подходит для достижения надлежащего измельчения / пульверизации с помощью морозильной мельницы (рисунок 1B).
    2. Убедитесь, что LN2 полностью испарился из трубок, содержащих попкорн до хранения их при -80 градусов по Цельсию. Можно остановиться после приготовления дрожжевого попкорна, так как они стабильны в течение нескольких лет при поддержке при -80 градусов по Цельсию.

Figure 1
Рисунок 1: Приготовление дрожжевого попкорна. (A) Дрожжи "попкорн" делается путем dropwise замораживания подвески клетки в LN2. Мы используем от одного до трех 50 мл труб, удерживаемых вместе с резинкой и помещенных в ведро со льдом, наполненное сухим льдом. Трубки заполнены LN2 до чуть ниже их диски и пополнен жидким азотом часто держать их почти полным, пока все ячейки подвески были сделаны в попкорн (B) Размер попкорна является важным фактором, определяющим оптимальную эффективность шлифования. Диапазон размеров попкорна должен быть от 0,3 до 0,5 см в диаметре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Криогриндирование

  1. Для начала убедитесь, что существует достаточно LN2 доступны для охлаждения морозильной мельницы, шлифовальные флаконы, материалы и для работы машины для всех образцов. Менее чем для пяти образцов, 30-35 L LN2 должно быть достаточно. Заполните морозильную камеру мельницыс LN 2 до заполнения линии.
    ВНИМАНИЕ: Все шаги с участием LN2 должны быть выполнены в хорошо проветриваемой области и морозильная мельница сама должна быть расположена в такой области, чтобы избежать риска удушья. Носите средства индивидуальной защиты, включая правильную обувь, лабораторное пальто, защитные очки, базовый слой нитриальных перчаток, затем тепловые перчатки, а затем еще пару нитриальных перчаток. Используйте крайнюю осторожность при обработке LN2.
  2. Закройте крышку морозильной камеры мельницы медленно, избегая всплескаLN 2 и дайте несколько минут для машины, чтобы остыть. Возможно, необходимо пополнить камеру LN2, чтобы компенсировать потери из-за испарения, прежде чем приступить к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пополнить LN2 по мере необходимости только до заполнения линии. Не переполнять камеру, так как это может быть как опасным, так и вредным для машины. Автоматизированные системы заправки доступны для морозильной мельницы, которая может пополнить испаряющиеся LN2 по мере необходимости непосредственно из резервуара для хранения, подключенного к морозильной мельнице.
  3. Предварительно охладить большие шлифовальные флаконы и магнитный ударный бар, dunking их в LN2 хранится в отдельной небольшой dewar. Decant все LN2, когда LN2 останавливается восходящей. Затем добавьте образец / дрожжевой попкорн в шлифовальный флакон и запечатать его плотно с двумя пробками конца из нержавеющей стали.
    1. Не заполнять более одной трети шлифовального флакона с образцом, так как это может снизить эффективность шлифования. Вместо этого, большие образцы могут быть обработаны путем деления их на два или более флаконов и шлифовальные их последовательно. Меньшие шлифовальные флаконы можно использовать для небольших образцов (до 3 мл).
  4. Поместите шлифовальный флакон в морозильную камеру мельницы и заблокив его на месте. Закройте крышку.
  5. Для начинающих дрожжей, молоть образцы в общей сложности три цикла в течение 2 мин / цикл (с 2 мин перерыва для охлаждения между циклами) с дробления скорость 14. Когда машина останавливается после завершения циклов, открыть крышку морозильной камеры мельницы медленно и тщательно разблокировать флакон с порошкообразной замороженной ячейки лизолировать и удалить его из морозильной камеры мельницы. Если используется несколько небольших флаконов, работайте быстро, чтобы удалить один флакон за один раз и поместить их в сухой лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно нет необходимости корректировать параметры шлифования при использовании флаконов разных размеров с одним и тем же типом образца. Тем не менее, параметры шлифования, такие как количество циклов и скорость шлифования должны быть эмпирически определены для различных типов образцов, в зависимости от легкости, с которой они лиза. Большинство клеток млекопитающих и мягких тканей будут лизировать в 1-2 циклов с дробильной скоростью 10. Труднее лизировать образцы, такие как бактерии, дрожжи, личинки мух и взрослых плодовых мушек требуют 3-6 циклов с максимальной скоростью, в то время как твердые ткани, такие как кости, зубы и т.д. может потребоваться до 10 циклов. Небольшую алициту разморожевания образца можно просмотреть под микроскопом до и после измельчения, чтобы подсчитать количество нетронутых, неподозренных клеток для определения эффективности лиза. Отличный анализ влияния криогриндных параметров на высвобождение белков и ДНК из начинающих дрожжей был опубликован ранее15.
  6. Работая быстро, чтобы не позволить образцу оттаять, тщательно отвинтить один из конечных частей (выбрать тот, который, как представляется, стали несколько свободно во время шлифования) с помощью инструмента открытия. Затем используйте пару длинных типсов (которые предварительно охлаждаются в ведро с сухим льдом), чтобы удалить ударный бар. Соберите распыленный образец путем инвертирования и нажав шлифовальный флакон на полистирол весом блюдо предварительно охлажденный с LN2 и хранится на сухом льду.
  7. После того, как все порошкообразные замороженные клетки ликат был извлечен из шлифовального флакона, залить порошкообразный лизат из взвешивания блюдо обратно в 50 мл трубки и немедленно приступить к медленной оттаивания шаг описан следующий для лучших результатов. Кроме того, хранить замороженные порошкообразные лисировать на ночь при -80 градусов по Цельсию, хотя это может привести к некоторой деградации.
  8. Приготовьте ведро со льдом с 50% суспензией льда и воды и поместите его на тарелку с магнитным мешалки. Погрузите проволочную стойку или другую подходящую стойку в ледяную суспензию, чтобы держать образцы.
    1. Затем медленно оттаивать образцы на ледяной ванне суспензии с постоянным возбуждением суспензии с помощью магнитного мешалки. Добавить больше льда, чтобы заменить таяние льда (некоторые воды, возможно, потребуется отказаться, чтобы предотвратить лед ведро от переполнения). Так как несколько ингибиторов имеют короткую половину жизни в аквеозных буферах, добавьте дополнительный ингибитор протеазы коктейль (см. Таблица материалов)и 10 МК протеасомный ингибитор MG-132 к лизате, как только образцы начинают оттаивать (примерно через 30 мин).
    2. Удалите лед, образоваваемый на внешней стороне труб каждые 5 минут, чтобы ускорить процесс оттаивания. Обратите внимание, что быстрое оттаивание образцов при комнатной температуре или выше может привести к значительной деградации.
  9. После того, как образцы полностью разморозятся (это может занять более часа в зависимости от количества образца), центрифуга лизатата на 3220 г в течение 20 мин в рефрижераторной центрифуге столешницы при 4 градусов по Цельсию, чтобы удалить большую часть клеточного мусора из лизата.
  10. Перенесите супернатант на поликарбонатные центрифуги 50 мл, предварительно охлажденные на льду, и центрифугировать образцы при 16 000 г в течение 20 мин при 4 градусах по Цельсию (см. таблицу материалов).
  11. Передача только ясного супернатанта, состоящего из очищенного экстракта всей клетки из центра жидкой колонки в трубке очень медленно и осторожно, не нарушая мутный липидныйслой (рисунок 2), в охлажденную трубку 15 мл с использованием предварительно охлажденных серологических пипеток. Избегайте удаления всех лисят в центрифуге трубки для предотвращения переноски липидов и мусора. Оставшийся лисат в центрифуге трубки может быть центрифугирован несколько раз, чтобы восстановить небольшое количество экстракта после каждого спина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Липиды вместе с любыми денатурированными белками будут казаться облачными/молочными и расположены в верхней части жидко-воздушного интерфейса, а иногда и над самой гранулой, которая состоит из нерастворимого клеточногомусора (рисунок 2).

Figure 2
Рисунок 2: Экстракт слоев в центрифуге трубки. Показаны основные видимые особенности экстракта всей клетки в трубке после центрифугации в 16 000 г в течение 20 мин. Относительное изобилие каждой функции зависит от типа выборки, фазы роста ячеек (экспоненциальной по сравнению со стационарной), количества буфера лиза, используемого для повторного использования ячеек, и эффективности лиза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Центрифуга любого оставшегося лизата в течение 5 минут, чтобы восстановить больше экстракта. Повторите это 5 мин центрифугации несколько раз, если это необходимо, чтобы восстановить как можно больше четкого экстракта, как это возможно. Отбросьте облачный лисат, содержащий липиды, близко к нижней части трубки рядом с гранулами.
  2. Используйте эти экстракты для нисходящего применения, таких как белковая комплексная очистка, иммунопреципиентация и протеомный анализ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы сравнили два различных метода для лиза дрожжевых клеток, а именно стеклянный бисер фрезерования при 4 градусов по Цельсию и автоматизированный метод криогринда при -196 градусов по Цельсию, чтобы оценить относительное восстановление белков в клеточных экстрактов, подготовленных с обоих методов. Для этого исследования мы решили использовать начинающий штамм дрожжей YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-200 trp1-1-am ubi1-1:TRP1 ubi2-No2::ura3 ubi 3-Зуб-2 ubi4-No2::LEU2 (pUB39) »pUB221»)16 с высокой плазмидной копией, выражаюющей тандем HIS-MYC с пометкой Убиквитин (HIS-MYC-Ub), чтобы мы могли оценить эффективность восстановления помеченных убиквитинированных белков из экстрактов после очищения сродства.

Мы протестировали быстрый протокол, который использует стеклянный бисер фрезерования для лиза дрожжевыхклеток 9 при 4 градусов по Цельсию и криогриндирования метод с использованием замороженных дрожжевых клеток (дрожжи попкорн) и шлифовальные их в LN2 в морозильной камере мельницы. Мы сообщаем о явной разнице с двумя методами подготовки экстракта.

На рисунке 3A мы демонстрируем, что мы можем достичь явно более высокого общего урожая белка из экстрактов целых клеток (WCE), подготовленных с использованием морозильной камеры шлифования, как это определено Ponceau S окрашивания после загрузки эквивалентное количество WCE подготовлен из того же количества клеток, используя два различных методов подготовки экстракта. Кроме того, рисунок 3B показывает более высокое восстановление HIS-MYC помечены вездесущие белки после стащить вниз с помощью talon бисером из WCE подготовлены криогринда, по сравнению с WCE подготовлены с использованием бисера колотящего, несмотря на использование экстрактов, подготовленных из того же количества клеток в обоих случаях.

Figure 3
Рисунок 3: Cryogrinding приводит к более высокой общей урожайности белка в клеточных экстрактах и лучшего восстановления помеченных белков после стягивания белков из этих экстрактов. (A) Экстракты целых клеток (WCE) были подготовлены, как описано в этом протоколе для криогринирования или, как описано ранее для метода фрезерования бисера. 9 Пятьсот мл штамма дрожжей, несущих HIS-MYC-Ub, были выращены до плотности 107 клеток/мл. Затем параллельно для подготовки экстрактов каждым методом использовалось 250 мл культуры. Эквивалентное количество WCE было подготовлено из одного и того же количества ячеек с использованием двух различных методов. Его помеченные белки были затем снесены с помощью бисера Talon (IP) из того же количества каждого экстракта. Наконец, эти сродства очищенных белков были сравнены путем их решения на денатурации полиакриламинид гель и передачи в нитроцеллюлозы мембраны следуют окрашивания с Ponceau S. Обратите внимание на сильное окрашивание по всей полосе, содержащей WCE подготовлены с помощью морозильника шлифовальный метод. (B) Ponceau S окрашенных нитроцеллюлозы мембраны показано в (A) затем был обработан для западного blotting использованием его теги антител для сравнения количества HIS-Ub помечены белки снесены из равного количества экстракта, подготовленного двумя методами. Несколько полос были явно перепредставлены в стягивание с использованием WCE подготовлены криогриндирования (указывается красными стрелками), в то время как соответствующие полосы в стягивания с использованием WCE подготовлены бида избиения были либо значительно слабее по интенсивности, или обнаружить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

В целом, репрезентативные результаты показывают, что криогринирование дрожжевого попкорна приводит к более высоким урожаям и превосходной белковой изоляции на основе более сильных окрашенных белковых полос Ponceau S в WCE, подготовленных криогриндином(рисунок 3A). Это, вероятно, из-за более эффективного лиза и ограниченной деградации белка в экстракте, подготовленном криогриндированием, о чем свидетельствует наличие более сильных полос в западной полосе помарки, показывающей, что белки с тегами HIS снесены (IP) из криогенного экстракта(рисунок 3B). В то время как протокол фрезерования стеклянной шарика быстрее и менее трудоемкий, он не может быть подходящим для белков, чувствительных к температуре или очень нестабильных. Мы также находим, что изоляция посттрансляционных модификаций, таких как полиубикитинированные белки является более эффективным с криогриндированияпротокол 16,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ограничением изучения местных белков из дрожжей является неэффективныйлиз дрожжевых клеток из-за их жесткой клеточной стенки. Хотя несколько методов были разработаны, наиболее последовательным и эффективным методом в наших руках является криогринирование дрожжевых клеток вспышки замороженных как попкорн. Этот метод позволяет надежно готовить высококачественные экстракты целых клеток из начинающих дрожжей по сравнению с другими методами лиза. Репрезентативные результаты показали, что криогринирование превосходит популярный механический метод дрожжевого лиза, который использует фрезерование бисера при 4 градусов по Цельсию(рисунок 3A и 3B). Криогринирование эффективно лизирует дрожжевые клетки, в то время как образцы обрабатываются при температуре -196 градусов по Цельсию в ванне LN2, поэтому поддержание целостности белка, значительно ограничивая тепло индуцированной денатурации белка и деградации, что происходит со многими другими методами подготовки экстракта. Это позволяет проводить анализ высоколабильных макромолекул в образцах и позволяет очищать функциональные белковые комплексы. Кроме того, использование морозильной мельницы также заменяет высоко трудоемкую традиционную ручную шлифовку дрожжевого попкорна раствором, что позволяет быстрее и эффективнее обрабатывать образцы. Наконец, достижение лиза дрожжевых клеток без использования каких-либо дорогих ферментов обеспечивает значительную экономию в долгосрочной перспективе.

Основным недостатком морозильной мельницы являются первоначальные расходы, связанные с приобретением оборудования, а также минимальные эксплуатационные расходы (т.е. большое количество жидкого азота). Это также требует тщательного обращения с потенциально опасными LN2 как для подготовки дрожжевого попкорна и криогринирования шаги. Большие образцы должны обрабатываться индивидуально, что может занять много времени, если необходимо обработать несколько образцов. Кроме того, при обработке нескольких образцов, шлифовальные флаконы, колпачки и ударные батончики должны быть должным образом вымыты и вытерты перед повторной использованием (альтернативно, несколько комплектов запасных аксессуаров должны быть сохранены).

Протокол, продемонстрированные здесь, ценен для подготовки образцов дрожжевого белка для очищения сродства белка, иммунопреципиентных исследований, подготовки образца для западного blotting для половых белков или их модификаций, или для протеомныханализов 16,19. Кроме того, криогринирование дрожжевого попкорна также может быть использовано для стрижки геномнойДНК 13,20,21 или РНК22, 23изоляции приминимизации активности нуклеазы, обеспечивая тем самым сохранениеобразца 24. Этот универсальный метод может быть использован как для большинства микроорганизмов, таких как бактерии21,22 идрожжи 15, и может быть быстро адаптирована для клеток млекопитающих, как растение25 и животных 26 тканей, пищевые продукты 27,морские образцы 21,28 в том числекораллов 23,судебно-медицинских образцов 20 в том числе волосы 29 и даже окаменелости 30, а также остатки вымерших форм жизни заморожены в вечноймерзлоте 31.

В заключение, криогринирование в морозильной камере мельницы является эффективным методом для белка и других макромолекул изоляции от различных образцов, полученных из различных источников для нескольких вниз по течению биохимических приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследования в лаборатории Гунджана поддерживаются за счет средств Национальных институтов здравоохранения, Национального научного фонда и Департамента здравоохранения Флориды. Мы благодарим студента Джона Паркера за техническую помощь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL polycarbonate tubes with screw caps Beckman 357002 Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone BD Biosiences 211677 Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract BD Biosiences 212750 Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge Beckman B38624 High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000 Beckman 366754 Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous MP Biomedicals 901521 Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44 Eppendorf 22637461 Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R Eppendorf 22625101 Refrigerated centrifuge
Glycerol SIGMA-ALDRICH G5150-1GA Volume excluder and cryoprotectant
HEPES FisherBiotech BP310-100 Buffer
HIS6 antibody Novagen 70796 Antibody for HIS tag
KCl SIGMA-ALDRICH P9541-1KG Salt for maintaining ionic strength
MG-132 CALBIOCHEM 474790 Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32957 Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S SIGMA P7170-1L Protein Stain
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32963 Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500 Beckman JLA 25.500 Rotor
Sodium Butyrate EM Science BX2165-1 Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S6521 Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate MP Biomedicals 159664 Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar 13408-09-8 Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill SPEX Sample Prep 6850 Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin BD Biosiences 635502 For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20 VWR International VW1521-07 Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol AMRESCO M131-250ML Reducing agent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  2. Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
  3. Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
  4. Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
  5. Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
  6. Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
  9. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  10. Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  12. Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
  13. Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
  14. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).
  15. Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
  16. Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
  17. Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
  18. Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).
  19. Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
  20. Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
  21. Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
  22. Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).
  23. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).
  24. Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
  25. Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
  26. Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
  27. Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
  28. da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
  29. Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
  30. Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
  31. Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).

Tags

Биология Выпуск 167 Морозильная мельница криогринирование криогенная шлифовка морозильник шлифовка фрезерование морозильной камеры криомиллирование очищение белка экстракт целых клеток клеточный лизат дрожжевой экстракт дрожжевой попкорн жидкий азот (LN2) иммунопреципиент судебно-медицинская экспертиза останки ископаемые вымершие форма жизни вечная мерзлота археологические
Подготовка клеточных экстрактов cryogrinding в автоматизированной морозильной мельницы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, E. O. N., Giovinazzi, S.,… More

Phillips, E. O. N., Giovinazzi, S., Menz, S. L., Son, Y., Gunjan, A. Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill. J. Vis. Exp. (167), e61164, doi:10.3791/61164 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter