Summary
Describimos un método confiable para la preparación de extractos de células enteras a partir de levadura u otras células utilizando un molino congelador criogénico que minimiza la degradación y desnaturalización de proteínas. Los extractos celulares son adecuados para la purificación de complejos proteómicos funcionales, análisis proteómicos, estudios de inmunoprocipitación y detección de modificaciones de proteínas lábiles.
Abstract
La facilidad de manipulación genética y la fuerte conservación evolutiva de la maquinaria celular eucariota en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae la ha convertido en un organismo modelo genético preeminente. Sin embargo, dado que el aislamiento eficiente de las proteínas depende de una interrupción óptima de las células, el uso de levadura para el análisis bioquímico de las proteínas celulares se ve obstaculizado por su pared celular, que es costosa de digerir enzimáticamente (usando lyticase o zymolyase), y difícil de interrumpir mecánicamente (usando un batidor de cuentas tradicional, una prensa francesa o una trituradora de café) sin causar calentamiento de muestras, lo que a su vez causa denatura y degradación de proteínas. Aunque la molienda manual de células de levadura bajo nitrógeno líquido (LN2) utilizando un mortero y un peste evita el sobrecalentamiento de las muestras, es intensiva en mano de obra y está sujeta a variabilidad en la lisis celular entre los operadores. Durante muchos años, hemos estado preparando con éxito extractos de levadura de alta calidad utilizando criogrinding de células en un molino congelador automatizado. La temperatura de -196 oC alcanzada con el uso de LN2 protege el material biológico de la degradación por proteasas y nucleasas, permitiendo la recuperación de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas. Aquí describimos esta técnica en detalle para las células de levadura en ciernes que implica primero congelar una suspensión de células en un tampón de lisis a través de su adición por gotas en LN2 para generar gotas congeladas de células conocidas como "palomitas de maíz". Estas palomitas de maíz se pulverizan bajo LN2 en un molino congelador para generar un extracto congelado "en polvo" que se descongela lentamente y se clarifica por centrifugación para eliminar los desechos insolubles. Los extractos resultantes están listos para aplicaciones posteriores, como purificación de proteínas o ácidos nucleicos, análisis proteómicos o estudios de inmunoprocipitación. Esta técnica es ampliamente aplicable para la preparación de extractos celulares de una variedad de microorganismos, tejidos vegetales y animales, especímenes marinos incluyendo corales, así como el aislamiento de ADN / ARN de especímenes fósiles forenses y permafrost.
Introduction
La levadura es un organismo modelo popular para los estudios de proteínas, ya que es un organismo eucariota simple con una abundancia de herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para los investigadores1. Debido a su robusta pared celular, un desafío que enfrentan los investigadores es en la eliminación eficiente de las células sin dañar el contenido celular. Se dispone de diferentes métodos para la obtención de extractos proteicos mediante la interrupción de las células de levadura que incluyen lisis enzimática (zymolyase)2,3, lisis química4, lisis física por congelación-descongelación5, a presión (prensa francesa)6,7, mecánica (perlas de vidrio, molinillo de café)8,9, basado en sonicación10 y criogénico2,11. La eficiencia de la lysis celular y el rendimiento proteico pueden variar considerablemente dependiendo de la técnica empleada, afectando así al resultado final o a la idoneidad para la aplicación posterior deseada para el alsate. Al estudiar proteínas que son inestables, tienen modificaciones posttranslacionales fugaces, o son sensibles a la temperatura, es particularmente importante utilizar un método que minimice la pérdida o degradación de la muestra durante la preparación.
| Técnica de preparación de extractos | Detalles | Ventajas | Desventajas | Análisis descendente | Referencia |
| Prensa francesa: Homogeneizador de alta presión (también conocido como Microfluidizer) con pretratamiento enzimático con Zymolyase | Zymolyase-20T, un homogeneizador de alta presión Microfluidizer. El disruptor consiste en una bomba de alta presión accionada por aire (relación 1:250; presión de aire requerida 0,6-l MPa) y una cámara de interrupción especial con una unidad de contrapresión adicional. Se requiere un tamaño mínimo de muestra de 20 ml para el procesamiento. | La interrupción total final obtenida con el protocolo combinado se acercó al 100 % con 4 pasadas a una presión de 95 MPa, en comparación con sólo una interrupción del 32 % con 4 pasadas a 95 MPa utilizando sólo homogeneización sin la Zymolyase. | No es adecuado para aplicaciones a pequeña escala. Las enzimas pueden ser costosas para preparaciones a gran escala. | Purificación de proteínas | 6 |
| Batidor de cuentas: Zymolyase células tratadas con dosel con cuentas de vidrio en un instrumento fastprep | Aproximadamente, se añade un volumen igual de cuentas de vidrio frías, secas y lavadas con ácido de 0,5 mm a un volumen determinado de pellet celular en el tampón de la lysis y las células se interrumpen por agitación manual vigorosa. | Es particularmente útil cuando se producen extractos de muchos cultivos de levadura pequeñas diferentes para fines de ensayo en lugar de para la purificación de proteínas. | Durante el procedimiento de perlas de vidrio, las proteínas se tratan duramente causando una espuma extensa que conduce a la desnaturalización de proteínas. La cantidad de rotura celular varía, mientras que la proteólisis, así como la modificación de las proteínas pueden resultar del calentamiento del extracto por encima de 4oC durante la rotura mecánica. | Principalmente análisis de ADN y ARN, pero también análisis de proteínas mediante la desnaturalización de gel electropheoresis, ya sea con o sin hinchazón occidental. | 8 |
| Tratamiento con zymolyase seguido de lelisis mediante una combinación de shock osmótico y homogeneización de Dounce | Después de la digestión enzimática de las paredes celulares, los esferoplastos se liszan con 15 a 20 golpes de un pestillo ajustado (despeje de 1 a 3 m) en un homogeneizador dounce. | Ventajoso para usar cepas deficientes en proteasa como BJ926 o EJ101. Esta es la forma más suave de romper las células de levadura y por lo tanto es más adecuado para la preparación de extractos que pueden llevar a cabo funciones enzimáticas complejas (por ejemplo, traducción, transcripción, replicación del ADN) y en las que se debe mantener la integridad de las estructuras macromoleculares (por ejemplo, ribosomas, empalmes). También es útil para aislar núcleos intactos que se pueden utilizar para estudios de cromatina (Bloom y Carbon, 1982) o para extractos de proteínas nucleares (Lue y Kornberg, 1987). | Las principales desventajas del procedimiento de lysis esferoplastia son que es relativamente tedioso y caro, especialmente para preparaciones a gran escala (>10 litros), y los largos períodos de incubación pueden conducir a la proteólisis o modificación de proteínas. Para las preparaciones de cromatina, parecen ser de diferente o menor calidad que las producidas por la centrifugación diferencial (basada en la integridad de la escalera nucleosoma). | Aislamiento de núcleos intactos para estudios de cromatina, extractos que pueden llevar a cabo funciones enzimáticas complejas, extractos que requieren la integridad de macromoleculares, extractos de proteínas nucleares. |
2 |
| Interrupción celular de las células congeladas parpadeantes mediante la molienda de nitrógeno líquido utilizando un mortero/pestle o una licuadora | Las células se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se aleban moliendo manualmente en un mortero usando un pestillo, o usando una licuadora Waring en presencia de nitrógeno líquido. | El protocolo es rápido y fácil. Puede acomodar diferentes cantidades de células de levadura incluyendo cultivos muy grandes. Su principal ventaja es que las células se toman inmediatamente del estado de crecimiento activo en nitrógeno líquido (-196 oC), disminuyendo las actividades enzimáticas degradativas como proteasas y nucleasas, así como actividades que modifican proteínas (por ejemplo, fosfatasas y quinasas). Es especialmente adecuado para la fabricación de extractos de células enteras de un solo cultivo de levadura para la purificación de proteínas a gran escala. | Un poco desordenado y potencialmente peligroso para el investigador descuidado. Las muestras pequeñas (es decir, cultivos de levadura de 10 a 100 ml) no se procesan fácilmente porque no hay suficiente masa de grumos de células congeladas para fracturarse eficazmente en la licuadora. Es lento procesar muestras individuales y limpiar el equipo entre usos. | Extractos de células enteras de un solo cultivo de levadura para la purificación de proteínas a gran escala. | 2 |
| Autolisis, Molino de cuentas | pH 5,0, 50 oC, 24 h, 200 rpm / 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min | La lelisis rápida y eficiente, especialmente para la preparación de extractos a pequeña escala | La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. Se requiere equipo de batido de cuentas. | Análisis a pequeña escala. | 10 |
| Autolisis, Sonicación | pH 5,0, 50 oC, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulsador 80%, potencia 80% | Los equipos de sonicación suelen estar disponibles en la mayoría de las instituciones. | La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. Se requiere equipo de sonicación. La lelisis lenta puede tardar más de 24 horas. | Preparaciones de la pared celular de levadura. | |
| Proceso de ebullición y congelación | No se necesita ningún equipo especializado que no sea un congelador estándar y un bloque de calefacción o baño de agua caliente. | Eficiente, reproducible, sencillo y barato. | La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. | Análisis de ADN por PCR. | 5 |
Tabla 1: Comparación de los métodos disponibles para la preparación de extractos de levadura.
La criogrinding (también conocida como molienda criogénica/fresado criogénico) se emplea comúnmente para recuperar ácidos nucleicos, proteínas o productos químicos de muestras sensibles a la temperatura de una manera confiable para análisis cuantitativos o cualitativos. Se ha utilizado con éxito para múltiples aplicaciones en diversos campos incluyendo biotecnología, toxicología, ciencias forenses12,13, ciencia ambiental, biología vegetal14 y ciencia de los alimentos. El aislamiento de macromoléculas biológicas intactas suele depender críticamente de la temperatura. Las temperaturas extremadamente bajas aseguran que las proteasas y nucleasas permanezcan inactivas, lo que resulta en un aislamiento confiable de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas para análisis posteriores. De hecho, un molino de congelador normalmente mantiene una temperatura de la muestra de -196 oC (el punto de ebullición de LN2),minimizando así la desnaturalización y degradación del ADN/ARN o de las proteínas.
El molino congelador emplea una cámara de molienda electromagnética que mueve rápidamente una barra de metal sólido o cilindro de ida y vuelta dentro de un vial que contiene la muestra para pulverizar entre tapones de acero inoxidable. El instrumento crea y invierte rápidamente un campo magnético dentro de la cámara de molienda. A medida que el campo magnético se desplaza hacia adelante y hacia atrás, el imán aplasta la muestra contra los enchufes logrando así el "criogrinding" y la pulverización de las palomitas de maíz. El molino congelador reemplaza el mortero y el pestillo y permite el procesamiento secuencial de múltiples muestras (o hasta 4 muestras más pequeñas simultáneamente) con alta reproducibilidad y evita la variabilidad de usuario a usuario asociada con la molienda manual. Una vez procesadas las muestras, los extractos de celdas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores.
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Protocol
1. Preparación de palomitas de maíz de levadura
- Cultivar células de levadura en 0,5 L de medios YPD a una densidad de 1 x 107 células/ml. Cuente las células utilizando un contador coulter o cualquier otro medio.
- Células centrífugas durante 10 min a 2.400 g y 4oC.
- Lave cada muestra una vez con 500 ml de agua desionizada en frío de 18 mega Ohm Milli-Q.
- Pellets de resuspendición en 15 mL de tampón de lisis helada [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% Tween, 10% glicerol, con agente reductor 10 mM 10 mM β-mercaptoetanol, cóctel inhibidor de la proteasa, inhibidor de 10 M de inhibidor de proteasoma MG-132, inhibidor de la deacetilasa de 1 mM de butirato sódico e inhibidores de la fosfatasa (1 mM de vanadato de sodio, fluoruro de sodio de 50 mM, 50 mM de sodio β glucerofosfato)]. Consulte la Tabla de materiales para obtener más información. Mantenga las células resuspendidas sobre hielo hasta que las muestras estén listas para el siguiente paso.
NOTA: Se puede utilizar una amplia variedad de tampones de lysis que contienen una serie de detergentes no iónicos con las muestras e inhibidores específicos incluidos en él en función de la aplicación posterior. La inclusión de inhibidores proteasas y proteasomales es crucial para prevenir la degradación de las proteínas, especialmente una vez que los extractos se descongelan. - Haga palomitas de maíz de levadura congeladas agregando lentamente la suspensión celular una gota a la vez usando una pipeta serológica preenfriada en uno o más tubos centrífugos de 50 ml mantenidos en hielo seco y llenos de LN2 hasta justo debajo del borde. Rebane el nitrógeno líquido en el tubo con frecuencia para compensar su pérdida debido a la rápida evaporación. Trabajar en un área bien ventilada para evitar los peligros asociados con la asfixia de nitrógeno.
- En lugar de un tubo de 50 ml, utilice varios tubos de 50 ml atados entre sí (o cualquier recipiente con una boca grande, como una botella de centrífuga de plástico grande que pueda tolerar temperaturas criogénicas) para la preparación de maíz pop(Figura 1A). Cuanto mayor sea el recipiente y su apertura, más fácil será la preparación de palomitas de maíz, ya que esto evita que las palomitas de maíz formen grandes agregados. Un rango de tamaño de 0,3-0,5 cm para las palomitas de maíz es ideal para lograr una molienda/pulverización adecuada utilizando el molino del congelador (Figura 1B).
- Asegúrese de que el LN2 se ha evaporado completamente de los tubos que contienen las palomitas de maíz antes de almacenarlas a -80 oC. Es posible detenerse después de preparar las palomitas de maíz de levadura, ya que son estables durante varios años cuando se mantienen a -80 oC.
Figura 1: Preparación de palomitas de maíz de levadura. (A) La levadura "popcorn" se hace por la congelación por gota de la suspensión celular en LN2. Utilizamos tubos de uno a tres tubos de 50 ml unidos con una banda de goma y colocados en un cubo de hielo lleno de hielo seco. Los tubos se llenan con LN2 hasta justo debajo de sus llantas y se rema con nitrógeno líquido con frecuencia para mantenerlos casi llenos hasta que toda la suspensión celular se había convertido en palomitas de maíz (B) El tamaño de las palomitas de maíz es un determinante importante de la eficiencia óptima de molienda. El rango de tamaño de las palomitas de maíz debe estar entre 0,3 y 0,5 cm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Criogrinding
- Para empezar, asegúrese de que hay suficiente LN2 disponible para enfriar el molino del congelador, moler viales, suministros y para operar la máquina para todas las muestras. Para menos de cinco muestras, 30-35 L de LN2 debe ser suficiente. Llene la cámara del molino del congelador con LN2 hasta la línea de llenado.
ADVERTENCIA: Todos los pasos que impliquen LN2 deben realizarse en un área bien ventilada y el molino congelador en sí debe estar situado en dicha zona para evitar el riesgo de asfixia. Use equipo de protección personal que incluya calzado adecuado, abrigo de laboratorio, gafas de seguridad, una capa base de guantes de nitrilo, luego guantes térmicos, seguidos de otro par de guantes de nitrilo. Tenga mucho cuidado al manipular LN2. - Cierre lentamente la tapa del molino del congelador, evitando el chapoteo de LN2 y espere unos minutos para que la máquina se enfríe. Puede ser necesario rellenar la cámara con LN2 para compensar la pérdida debida a la evaporación antes de pasar al siguiente paso.
NOTA: Rellene LN2 según sea necesario solo hasta la línea de llenado. No llene demasiado la cámara, ya que esto puede ser peligroso y perjudicial para la máquina. Los sistemas de recarga automatizados están disponibles para el molino congelador que puede reponer el LN2 evaporador según sea necesario directamente desde un tanque de almacenamiento conectado al molino del congelador. - Pre-enfriar los grandes viales de molienda y la barra del impactador magnético sumergiéndolos en LN2 mantenidos en una pequeña dewar separada. Decantar todo el LN2 cuando el LN2 deja de burbujear. A continuación, agregue las palomitas de maíz de muestra/levadura al vial de molienda y séllela firmemente con los dos tapones de acero inoxidable.
- No llene más de un tercio del vial de molienda con la muestra, ya que puede reducir la eficiencia de la molienda. En su lugar, las muestras más grandes se pueden procesar dividiéndolas en dos o más viales y moliéndolas secuencialmente. Los viales de molienda más pequeños se pueden utilizar para muestras más pequeñas (hasta 3 ml).
- Coloque el vial de molienda en la cámara del molino del congelador y ciérralo en su lugar. Cierre la tapa.
- Para la levadura en ciernes, moler las muestras para un total de tres ciclos durante 2 minutos/ciclo (con 2 min de descanso para enfriar entre ciclos) a una tasa de trituración de 14. Cuando la máquina se detenga después de completar los ciclos, abra lentamente la tapa del molino del congelador y desbloquee cuidadosamente el vial con el lito de celda congelada en polvo y retírelo del molino del congelador. Si se utilizan varios viales pequeños, trabaje rápidamente para extraer un vial a la vez y colocarlos en hielo seco.
NOTA: Por lo general, no es necesario ajustar los parámetros de molienda cuando se utilizan viales de diferentes tamaños con el mismo tipo de muestra. Sin embargo, los parámetros de molienda, como el número de ciclos y la velocidad de molienda, deben determinarse empíricamente para diferentes tipos de muestras, dependiendo de la facilidad con la que se licen. La mayoría de las células de mamíferos y tejidos blandos se licen en 1-2 ciclos a una tasa de aplastamiento de 10. Las muestras más difíciles de allicer como bacterias, levaduras, larvas de mosca y moscas de la fruta adulta requieren 3-6 ciclos a la velocidad máxima, mientras que los tejidos duros como huesos, dientes, etc. pueden requerir hasta 10 ciclos. Una pequeña alícuota de la muestra descongelada se puede ver bajo el microscopio antes y después de la molienda para contar el número de células intactas no alicenciadas para determinar la eficiencia de la lysis. Se ha publicado anteriormente un excelente análisis del impacto de los parámetros de criogrinding en la liberación de proteínas y ADN de levadura en ciernes15. - Trabajando rápidamente para no permitir que la muestra se descongele, desenrosque cuidadosamente una de las piezas finales (seleccione la que parece haberse soltado un poco durante la molienda) utilizando la herramienta de apertura. Luego, usa un par de fórceps largos (que están pre-enfriados en un cubo con hielo seco) para eliminar la barra del impactador. Recoger la muestra pulverizada invirtiendo y tocando el vial de molienda en un plato de pesaje de poliestireno pre-enfriado con LN2 y mantenido en hielo seco.
- Una vez que todo el lesato de célula congelada en polvo se ha recuperado del vial de molienda, verter el lesate en polvo de la placa de pesaje de nuevo en el tubo de 50 ml y proceder inmediatamente al paso de descongelación lento descrito a continuación para obtener mejores resultados. Alternativamente, almacene el izado en polvo congelado durante la noche a -80 oC, aunque esto puede resultar en cierta degradación.
- Prepare un cubo de hielo con un 50% de purines de hielo y agua y colóquelo en una placa de agitación con un agitador magnético. Sumerja una rejilla de alambre u otro estante adecuado en la suspensión de hielo para sujetar las muestras.
- Luego, descongela lentamente las muestras en un baño de lodo de hielo con agitación constante de la suspensión usando un agitador magnético. Agregue más hielo para reemplazar el hielo derretido (es posible que sea necesario desechar algo de agua para evitar que el cubo de hielo se desborde). Dado que varios inhibidores tienen una vida media corta en tampones acuosos, agregue un cóctel inhibidor de la proteasa adicional (ver Tabla de materiales)y un inhibidor del proteasoma MG-132 de 10 M al lisosato una vez que las muestras comiencen a descongelarse (después de aproximadamente 30 minutos).
- Retire el hielo formado en el exterior de los tubos cada 5 minutos para acelerar el proceso de descongelación. Tenga en cuenta que la rápida descongelación de las muestras a temperatura ambiente o superior puede conducir a una degradación significativa.
- Después de que las muestras se hayan descongelado por completo (puede tardar más de una hora dependiendo de la cantidad de muestra), centrifugar el izado a 3.220 g durante 20 minutos en una centrífuga de mesa refrigerada a 4 oC para eliminar la mayor parte de los desechos celulares del principio.
- Transfiera el sobrenadante a tubos centrífugos de policarbonato de 50 ml que hayan sido pre-enfriados sobre hielo y centrifugar las muestras a 16.000 g durante 20 min a 4oC (ver Tabla de Materiales).
- Transfiera sólo el sobrenadante transparente que consiste en el extracto de célula entera clarificada del centro de la columna líquida en el tubo muy lentamente y con cuidado, sin alterar la capa lipídica turbia (Figura 2), en un tubo refrigerado de 15 ml utilizando pipetas serológicas pre-refrigeradas. Evite eliminar todo el izado en el tubo de la centrífuga para evitar el arrastre de lípidos y desechos. El sobrante de izado en el tubo centrífugo se puede centrifugar varias veces para recuperar pequeñas cantidades de extracto después de cada giro.
NOTA: Los lípidos junto con las proteínas desnaturaladas parecen turbios/lechosos y se encuentran en la parte superior de la interfaz líquido/aire, y ocasionalmente por encima del propio pellet que consiste en residuos celulares insolubles (Figura 2).
Figura 2: Extraer capas en un tubo centrífugo. Se indican las principales características visibles de todo el extracto de célula en un tubo después de la centrifugación a 16.000 g durante 20 min. La abundancia relativa de cada entidad depende del tipo de muestra, la fase de crecimiento de las células (exponencial frente a estacionaria), la cantidad de búfer de lelisis utilizado para resuspend células y la eficiencia de la lysis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Centrifugar cualquier lysate restante durante 5 minutos para recuperar más del extracto. Repita esta centrifugación de 5 minutos varias veces si es necesario para recuperar la mayor cantidad de extracto transparente posible. Deseche el izado turbio que contiene lípidos cerca de la parte inferior del tubo cerca del pellet.
- Utilice estos extractos para aplicaciones posteriores como purificación compleja de proteínas, inmunoprecipitación y análisis proteómico.
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Representative Results
Comparamos dos métodos diferentes para la lelisis de células de levadura, a saber, el fresado de cuentas de vidrio a 4 oC y un método automatizado de criogrinding a -196 oC, para evaluar las proteínas de recuperación relativa en los extractos celulares preparados con ambos métodos. Para este estudio, elegimos usar una cepa de levadura en ciernes YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1::TRP1 ubi-2::ura3 1ubi3-Uub-2 ubi4-2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 llevando un plásmido de copia alta que expresa un tándem HIS-MYC etiquetado Ubiquitin (HIS-MYC-Ub) para que podamos evaluar la eficiencia de la recuperación de proteínas ubiquitinadas etiquetadas de extractos después de la purificación.
Probamos un protocolo rápido que utiliza el fresado de granos de vidrio para anegón de las células de levadura9 a 4 oC y el método de criogrinding utilizando células de levadura congeladas (palomitas de maíz de levadura) y moliéndolos en LN2 en un molino de congelación. Informamos de una clara diferencia con los dos métodos de preparación de extractos.
En la Figura 3A demostramos que podemos lograr un rendimiento total de proteína decididamente mayor de extractos de células enteras (WCE) preparados utilizando la molienda de congelador según lo determinado por la tinción de Ponceau S después de cargar cantidades equivalentes de WCE preparadas a partir del mismo número de células utilizando los dos métodos diferentes de preparación de extractos. Además, la Figura 3B muestra una mayor recuperación de las proteínas ubiquitylated etiquetadas HIS-MYC después de tirar hacia abajo usando cuentas de Talon del WCE preparadas por criogrinding, en comparación con el WCE preparado usando el batidor de cuentas, a pesar de usar extractos preparados a partir del mismo número de células en ambos casos.
Figura 3: La criogrinding conduce a mayores rendimientos totales de proteínas en extractos celulares y una mejor recuperación de proteínas etiquetadas después de la extracción de proteínas de estos extractos. (A) Extractos de células enteras (WCE) se prepararon como se describe en este protocolo para la criogriding o como se describió anteriormente para el método de molienda de cuentas. 9 Quinientos mL de la cepa de levadura que transporta HIS-MYC-Ub se cultiva a una densidad de 107 células/ml. Luego se utilizaron 250 ml del cultivo en paralelo para preparar extractos por cada método. Se prepararon cantidades equivalentes de WCE a partir del mismo número de células utilizando los dos métodos diferentes. Sus proteínas etiquetadas fueron retiradas usando perlas de Talon (IP) de la misma cantidad de cada extracto. Finalmente, estas proteínas purificadas de afinidad se compararon resolviéndolas en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y transfiriendo a una membrana de nitrocelulosa seguida de tinción con Ponceau S. Observe la tinción más fuerte en todo el carril que contiene WCE preparado utilizando el método de molienda del congelador. (B) La membrana de nitrocelulosa teñida de Ponceau que se muestra en (A) se procesó para la hinchazón occidental utilizando anticuerpos de etiqueta HIS para comparar las cantidades de proteínas etiquetadas HIS-Ub extraídas de cantidades iguales de extracto preparadas por los dos métodos. Varias bandas fueron claramente sobrerrepresentadas en el desplegable usando el WCE preparado por criogrinding (indicado por las flechas rojas), mientras que las bandas correspondientes en el desplegable usando WCE preparado por batido de cuentas eran considerablemente más débiles en intensidad, o indetectables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En general, los resultados representativos muestran que la criogrinding de palomitas de maíz de levadura conduce a mayores rendimientos y un aislamiento proteico superior basado en las bandas de proteínas teñidas De Ponceau S más fuertes en el WCE preparadas por criogrinding (Figura 3A). Esto es probablemente debido a la lysis más eficiente y la degradación limitada de las proteínas en el extracto preparado por criogrinding, como lo indica la presencia de bandas más fuertes en el carril de la mancha occidental que muestran proteínas etiquetadas his (IP) del extracto criogénico (Figura 3B). Si bien el protocolo de fresado de cuentas de vidrio es más rápido y menos laborioso, puede que no sea adecuado para proteínas sensibles a la temperatura o altamente inestables. También encontramos que el aislamiento de modificaciones posttrastacionales como las proteínas poliubiquitinadas es más eficiente con el protocolo de criogrinding16,17,18.
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Discussion
Una limitación del estudio de las proteínas nativas de la levadura es la lisis ineficiente de las células de levadura debido a su pared celular resistente. Aunque se han desarrollado varios métodos, el método más consistente y eficiente en nuestras manos es el criogrinding de las células de levadura flash congelado como palomitas de maíz. Este método permite la preparación confiable de extractos de células enteras de alta calidad de levadura en ciernes en comparación con otros métodos de lysis. Los resultados representativos demostraron que la criogrinding es superior a un método mecánico popular para la lelisis de levadura que emplea el fresado de cuentas a 4 oC(Figura 3A y 3B). El criogrinding elimina eficientemente las células de levadura mientras las muestras se procesan a una temperatura de -196 oC en un baño LN2, por lo que se mantiene la integridad de las proteínas al limitar en gran medida la desnaturalización y degradación de la proteína inducida por el calor que se produce con muchos otros métodos de preparación de extractos. Esto permite el análisis de macromoléculas altamente lábilesas en las muestras y permite la purificación de complejos proteicos funcionales. Además, el uso del molino congelador también reemplaza la molienda manual tradicional altamente intensiva en mano de obra de palomitas de maíz de levadura con un mortero, lo que permite un procesamiento de muestras más rápido y eficiente. Por último, el logro de la lelisis de células de levadura sin el uso de enzimas costosas proporciona ahorros significativos a largo plazo.
La principal desventaja de un molino de congelador es el costo inicial involucrado en la compra del equipo, así como los costos mínimos de mantenimiento y funcionamiento (es decir, grandes cantidades de nitrógeno líquido) involucrados. También requiere un manejo cuidadoso de LN2 potencialmente peligroso para la preparación de palomitas de maíz de levadura y los pasos criogrindantes. Las muestras más grandes deben procesarse individualmente, lo que puede llevar mucho tiempo si es necesario procesar varias muestras. Además, al procesar varias muestras, los viales de molienda, las tapas y las barras del impactador deben lavarse y limpiarse adecuadamente antes de volver a utilizarlas (alternativamente, se deben mantener varios juegos de accesorios de repuesto).
El protocolo que se ha demostrado aquí es valioso para la preparación de muestras de proteínas de levadura para la purificación de la afinidad de proteínas, estudios de inmunoprecipitación, preparación de muestras para la hinchazón occidental para proteínas lá biliares o sus modificaciones, o para análisis proteómicos16,19. Además, la criogrinding de las palomitas de maíz de levadura también se puede utilizar para el ADN genómico cizallado13,20,21 o ARN22,23 aislamiento mientras se minimiza la actividad de la nucleasa, asegurando así la preservación de la muestra24. Este método versátil se puede utilizar tal cual para la mayoría de los microorganismos como las bacterias21,22 y levaduras15,y se puede adaptar rápidamente para las células de los mamíferos, tanto planta25 como animal26 tejidos, productos alimenticios27, especímenes marinos21,28 incluyendo corales23,muestras forenses20 incluyendo pelo29 e incluso fósiles30, así como los restos de formas de vida extintas congeladas en permafrost31.
En conclusión, la criogrinding en un molino congelador es un método eficiente para el aislamiento de proteínas y otras macromoléculas de una variedad de muestras derivadas de diversas fuentes para múltiples aplicaciones bioquímicas aguas abajo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación en el laboratorio de Gunjan es apoyada por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Nacional de Ciencias y el Departamento de Salud de Florida. Agradecemos al estudiante de pregrado John Parker por la asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
References
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