在自动冷冻机中冷冻处理细胞提取物的制备

Summary

我们描述了一种可靠的方法，使用低温冷冻机制备酵母或其他细胞的整细胞提取物，从而最大限度地减少蛋白质的降解和变性。细胞提取物适用于功能性蛋白质复合物的纯化、蛋白质组分析、共免疫沉淀研究和实验室蛋白修饰的检测。

Abstract

基因操纵的易用性以及真核细胞机械在萌芽酵母糖精中强大的进化 保护 ，使得它成为杰出的基因模型生物体。然而，由于有效的蛋白质分离取决于细胞的最佳干扰，因此，使用酵母对细胞蛋白进行生化分析受到细胞壁的阻碍，因为细胞壁酶（使用溶酶或酶）消化成本高昂，而且难以机械地（使用传统的珠子打手、法国压机或咖啡研磨机）进行分解，而不会导致样品加热，进而导致蛋白质变性和降解。虽然在液氮（LN 2）下对酵母细胞进行人工研磨（LN_2）避免了样品过热，但经过人工密集，且受操作者之间细胞解法的变异性影响。多年来，我们已经成功地制备了高品质的酵母提取物，使用细胞在自动冷冻机中的冷冻。使用 LN₂ 可达到 -196 °C 的温度，可保护生物材料免受蛋白酶和核酸酶降解的影响，从而检索到完整的蛋白质、核酸和其他大分子。在这里，我们详细描述这种技术，为萌芽酵母细胞，其中涉及首先冻结细胞悬浮液在解解缓冲，通过其滴入LN₂ 产生冷冻滴细胞称为"爆米花"。然后，在冷冻机的LN_2下粉碎 爆米花，产生冷冻的"粉状"提取物，通过离心缓慢解冻并澄清，以去除不溶性碎屑。所得提取物可用于下游应用，如蛋白质或核酸纯化、蛋白质细胞分析或联合免疫沉淀研究。该技术广泛适用于各种微生物、植物和动物组织、海洋标本（包括珊瑚）的细胞提取制备，以及从法医和永久rost化石标本中分离DNA/RNA。

Introduction

酵母是蛋白质研究的流行模型生物体，因为它是一个简单的真核生物，有大量的遗传和生化工具可供研究人员^使用。由于其坚固的细胞壁，研究人员面临的一个挑战是有效地细胞，而不会损害细胞内容。不同的方法可用于通过破坏酵母细胞获得蛋白质提取物，其中包括酶溶酶（酶酶^）2，3，化学溶^解4，物理溶解^{通过冷冻解冻5，}基于压力（法国压榨机^）6，7，机械（玻璃珠，咖啡研磨机^）8，9，基于声波^{为基础的10}和低温^2，11。细胞分解和蛋白质产量的效率可能因所采用的技术而有很大差异，从而影响最终结果或对解酶所需的下游应用的适用性。当研究不稳定的蛋白质，有转瞬即逝的后翻译，或对温度敏感，这是特别重要的，使用的方法，将尽量减少样品损失或降解在制备期间。

提取制备技术	细节	优势	缺点	下游分析	参考
法国媒体：高压均质器（又名微流体），使用酶酶进行酶预处理	Zymolyase-20T，一种微流体高压均质器。干扰器包括一个空气驱动高压泵（比率为 1：250;所需气压 0.6-l MPa）和一个带附加背压单元的特殊干扰室。处理需要最小样品大小为 20 mL。	使用组合协议获得的最终总中断接近 100%，4 次传球压力为 95 MPa，相比之下，只有 32% 的中断，在 95 MPa 时获得的 4 次中断仅使用均质化，无需 Zymolyase。	不适合小规模应用。酶可以变得昂贵的大规模制剂。	蛋白质纯化	6
珠子打手：用玻璃珠在快速准备仪器中用玻璃珠的酶处理细胞	在解解缓冲液中，大约将相同体积的冷、干、酸洗的 0.5 mm 玻璃珠添加到给定体积的细胞颗粒中，并且细胞被剧烈的手动搅拌破坏。	当从许多不同的小酵母培养物中提取提取物用于测定目的，而不是蛋白质纯化时，它特别有用。	在玻璃珠过程中，蛋白质受到严厉处理，导致大量发泡，导致蛋白质变性。细胞破裂量变化，而蛋白质的蛋白质解和修饰可能是由于在机械破损期间加热高于4°C的提取物。	主要是DNA和RNA分析，但也蛋白质分析通过变性凝胶电磷，无论是有或没有西方印迹。	8
使用渗透性休克和 Dounce 均质化的组合进行齐莫解酶治疗，然后进行解解	在细胞壁的酶消化后，在Dounce均质器中用15至20次紧贴的纠缠（间隙1至3μm）来乳化。	有利于使用蛋白酶缺乏菌株，如BJ926或EJ101。这是打破酵母细胞的最温和的方法，因此它最适合制备可以执行复杂酶功能的提取物（如翻译、转录、DNA复制），其中必须保持大分子结构（如核糖体、拼接体）的完整性。它还可用于分离可用于染色质研究（Bloom和 Carbon，1982 年）或核蛋白提取物（Lue 和 Kornberg，1987 年）的完整核。	球状解解程序的主要缺点是，它相对乏味和昂贵，特别是对于大规模制剂（>10升），和较长的潜伏期可能导致蛋白解或蛋白质修饰。 对于染色质制剂，它们的质量似乎不同或低于微分离心（基于核体梯完整性）产生的质量。	分离完整的核用于染色质研究，可执行复杂酶函数的提取物，需要完整性的提取物 大分子结构，核蛋白提取物。	2
使用砂浆/聚剂在液氮中研磨，对闪冻细胞进行细胞破坏	细胞立即在液氮中冷冻，然后用砂浆中手动研磨，或在液氮存在的情况下使用沃林搅拌机进行搅拌。	该协议是快速和容易的。它可以容纳不同数量的酵母细胞，包括非常大的培养物。它的主要优点是细胞立即从积极生长状态取到液氮（+196°C），减少降解酶活性，如蛋白酶和核酸酶，以及改变蛋白质（如磷酸盐和激酶）的活动。它特别适合从单一酵母培养物中制造全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。	有点乱，对粗心的调查员有潜在危险。小样品（即10-100毫升酵母培养物）不容易加工，因为没有足够的冷冻细胞团在搅拌机中有效断裂。处理单个样品并在使用之间清洁设备非常耗时。	从单一酵母培养物中提取全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。	2
自动解，珠磨机	pH 5.0， 50 °C， 24 小时， 200 rpm / Φ 0.5 毫米， 5 × 3 分钟/3 分钟	快速高效的解解，特别是用于小规模萃取制备	热生成导致大分子变性和退化。需要打珠设备。	小规模分析。	10
自动分析，声波化	pH 5.0， 50 °C， 24 小时， 200 rpm， 4 × 5 分钟/2 分钟， 脉冲器 80%， 功率 80%	声波设备通常在大多数机构中可用。	热生成导致大分子变性和退化。需要声波设备。慢解可能需要超过 24 小时。	酵母细胞壁制剂。
煮沸和冷冻解冻过程	除标准冰柜、加热块或热水浴浴（其他设备）以外的不需要专用设备。	高效、可重复、简单且价格低廉。	热生成导致大分子变性和退化。	由 PCR 进行 DNA 分析。	5

表1：用于制备酵母提取物的方法的比较。

低温研磨（又名低温研磨/低温铣削）通常用于以可靠的方式从温度敏感样品中检索核酸、蛋白质或化学品，进行定量或定性分析。它已成功应用于生物技术、毒理学、法医学^{、12、13、}环境科学、植物生物学^{14和食品科学等}多个应用。分离完整的生物大分子通常严格取决于温度。极低的温度确保蛋白酶和核酸酶保持不活动状态，从而可靠地分离完整的蛋白质、核酸和其他大分子，以便随后进行分析。事实上，冷冻机通常保持-196°C的样品温度（LN₂的沸点），从而最大限度地减少DNA/RNA或蛋白质变性和降解。

冷冻机采用电磁磨床，在装有样品的小瓶内快速移动实心金属棒或圆柱体，在不锈钢端塞之间粉碎。仪器在磨削室内产生并快速反转磁场。当磁场来回移动时，磁铁将样品压在插头上，从而实现爆米花的"冷冻"和粉碎。冷冻机取代了砂浆和砂浆，允许对多个样品（或同时最多 4 个较小的样品）进行连续处理，具有很高的可重复性，并避免了与手动磨削相关的用户对用户的变异性。处理样品后，细胞提取可用于各种下游应用。

Protocol

1. 酵母爆米花的制备

1. 在0.5L的YPD培养木中生长酵母细胞，密度为1 x 10⁷ 细胞/mL。使用库尔特计数器或任何其他方法计算单元格。
2. 在2，400克和4°C下进行10分钟的离心细胞。
3. 用 500 mL 的冰冷除去 18 兆欧姆美尔 Q 水洗一次每个样品。
4. 在 15 mL 的冰冷的乳酸缓冲液中重新消耗颗粒 [20 mM HEPES-KOH pH 7.5， 110 mM KCl， 0.1% Tween， 10% 甘油醇，新添加的还原剂 10 mM β-墨卡普托乙醇， 蛋白酶抑制剂鸡尾酒，10μM蛋白酶体抑制剂MG-132，1mM脱乙酰酶抑制剂钠甲酸酯和磷酸酶抑制剂（1mM瓦纳酸钠，50mM氟化钠，50mM钠β-糖磷酸盐）]。有关其他详细信息，请参阅材料表。将重新暂停的细胞留在冰上，直到样品准备好执行下一步。
   注：含有多种非离子洗涤剂的多种解液缓冲液可与其包含的样品和特定抑制剂一起使用，这些样品和特定抑制剂基于下游应用。包括蛋白酶和蛋白酶抑制剂是防止蛋白质降解的关键，尤其是在提取物解冻后。
5. 使用预冷冻血清移液器将细胞悬浮液缓慢地加入一滴，使冷冻酵母爆米花在干冰上保持并充满LN_2， 直到边缘下方。经常对管子中的液氮进行充固，以弥补其因快速蒸发而损失的损失。在通风良好的区域工作，以避免与氮气窒息相关的危害。
   1. 而不是50毫升管，使用多个50毫升管绑在一起（或任何容器与一个大嘴，如大型塑料离心机瓶，可以容忍低温）的流行玉米制备（图1A）。容器越大，其开口就越容易是爆米花的制备，因为这样可以防止爆米花的聚集形成大的聚合体。爆米花的尺寸范围为 0.3-0.5 厘米，是使用冷冻机实现正确研磨/粉碎的理想之选（图1B）。
   2. 在将爆米花储存在-80°C之前，确保LN₂ 从含有爆米花的管子中完全蒸发。 在准备酵母爆米花后，可以停止，因为它们在-80°C时保持稳定数年。

图1：酵母爆米花制备。（A）酵母"爆米花"是由LN 2中细胞悬浮液的滴滴_{冻结产生的}。我们使用一到三个50 mL管与橡皮筋一起，放在装满干冰的冰桶里。管子充满LN_2，直到其边缘以下，并经常加满液氮，以保持他们几乎满，直到所有的细胞悬浮液都做成爆米花（B）爆米花的大小是最佳研磨效率的一个重要决定因素。爆米花的尺寸范围应在直径0.3至0.5厘米之间。请单击此处查看此图的较大版本。

2. 冷冻

1. 首先，确保有足够的 LN₂可用于冷却冷冻机、研磨小瓶、供应和操作机器的所有样品。对于少于五个样本，LN₂的 30-35 L 就足够了。将 LN 2 填充到灌装线，使冷冻磨机室充满 LN_2。
   警告：所有涉及 LN₂ 的步骤都应在通风良好的区域执行，而冷冻机本身应位于该区域，以避免窒息风险。佩戴个人防护装备，包括合适的鞋类、实验室外套、安全眼镜、底层硝基手套，然后是热手套，然后是另一副硝基手套。处理 LN_{2 时，请格外小心}。
2. 缓慢关闭冷冻机盖，避免 LN₂ 的飞溅，让机器冷却几分钟。可能需要用 LN₂ 重新填充腔室，以补偿蒸发造成的损失，然后再继续下一步。
   注：根据需要重新填充 LN_2， 仅到填充行。不要过度填充腔室，因为这可能既危险又对机器有害。自动灌装系统可用于冷冻机，可根据需要直接从连接到冷冻机的储罐中补充蒸发的 LN2。
3. 预冷大磨瓶和磁冲击棒，在LN₂ 中灌篮，保存在一个单独的小德瓦尔。当 LN_{2 停止冒泡} 时，将所有 LN₂ 去损。然后将样品/酵母爆米花加入研磨小瓶，然后用两个不锈钢端塞将其密封。
   1. 不要用样品填充超过三分之一的磨削小瓶，因为这样会降低磨削效率。相反，较大的样品可以通过将它们分成两个或两个多瓶并按顺序研磨来处理。较小的磨削小瓶可用于较小的样品（高达 3 mL）。
4. 将研磨瓶放在冷冻磨机室中，并锁定到位。合上盖子。
5. 对于发芽酵母，以 14 的粉碎率将样品研磨三个周期，共 2 分钟/周期（循环间冷却 2 分钟）。当机器在完成循环后停止时，缓慢地打开冷冻机盖，用粉末冷冻电池将小瓶小心地解锁，然后将其从冷冻机中取出。如果使用多个小瓶，请快速取出一个小瓶，并将其放在干冰中。
   注：使用相同类型样品的不同尺寸小瓶时，通常无需调整磨削参数。但是，磨削参数（如循环次数和磨削速率）需要根据不同样品类型进行实证确定，具体取决于它们 lyse 的易用性。大多数哺乳动物细胞和软组织将在1-2个周期内以10的粉碎率进行。难以对细菌、酵母、苍蝇幼虫和成年果蝇等样品进行磨蚀，需要以最大速率进行3-6个周期，而硬组织（如骨骼、牙齿等）可能需要长达10个周期。在研磨之前和之后，可以在显微镜下查看解冻样品的一小部分，以计算完整、未解合的细胞数量，以确定解合效率。先前15日发表了一份对冷冻蛋白参数对萌芽酵母中蛋白质和DNA释放^{的影响的出色分析}。
6. 快速工作，使样品不解冻，使用开口工具小心地拧开其中一个端片（挑选在磨削过程中似乎变得有些松动的末端片件）。然后，使用一对长钳子（在带干冰的桶中预冷却）拆下冲击杆。通过倒置和敲击研磨小瓶，将粉碎样品用 LN₂ 预冷并放在干冰上，收集粉碎样品。
7. 一旦从研磨小瓶中回收所有粉末冷冻细胞回盐，将粉状利酸盐从称重盘中倒回 50 mL 管中，然后立即进入下一步描述的缓慢解冻步骤，以获得最佳效果。或者，将冷冻的糖酸盐在-80°C下过夜，尽管这可能会导致一些降解。
8. 用 50% 的冰和水的泥浆准备冰桶，用磁力搅拌器放在搅拌板上。将电线架或其他合适的机架淹没在冰浆中，以保存样品。
   1. 然后，使用磁力搅拌器在冰浆浴上缓慢解冻样品，并不断搅拌泥浆。添加更多的冰来代替融化的冰（可能需要丢弃一些水，以防止冰桶溢出）。由于几种抑制剂在水缓冲液中具有短暂的半生命，因此在样品开始解冻后（约30分钟后 ），在酸盐中加入额外的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（见材料表）和10μM蛋白酶体抑制剂MG-132。
   2. 每 5 分钟清除一次管外形成的冰，以加快解冻过程。请注意，在室温或更高温度下快速解冻样品可导致显著降解。
9. 样品完全解冻后（根据样品数量可能需要一个多小时），将 lysate 在 +3，220 g 的冷冻桌面离心机中离心 20 分钟，在 4 °C 的冷冻桌面离心机中清除从酸盐中清除大部分细胞碎屑。
10. 将上流液转移到在冰上预冷却的50 mL聚碳酸酯离心管中，并在4°C下以16，000克离心样品，20分钟（ 见材料表）。
11. 仅将由澄清全细胞提取物组成的透明上清液从管中的液体柱中心非常缓慢和小心地转移，而不干扰多云脂层（图2），使用预冷冻血清移液器将15 mL的冷却管转移到冷却的15 mL管中。避免去除离心管中的所有酸盐，以防止脂质和碎屑结转。离心管中剩余的裂解可以多次离心，每次旋转后回收少量提取物。
    注：脂质以及任何变性蛋白质会出现浑浊/乳白色，位于液体/空气界面的顶部，偶尔位于由不溶性细胞碎片组成的颗粒本身上方（图2）。

图2：在离心管中提取层。在16，000g的离心20分钟内，整个细胞提取物在管中的主要可见特征。每个特征的相对丰度取决于样本类型、细胞的生长阶段（指数与固定）、用于重新暂停细胞的解解缓冲液量和解解效率。请单击此处查看此图的较大版本。

12. 将剩余的落酸离心5分钟，以回收更多提取物。如果需要恢复尽可能多的透明提取物，请多次重复此 5 分钟离心。丢弃靠近颗粒管底的含有脂质的多云利盐。
13. 使用这些提取物用于下游应用，如蛋白质复合纯化、免疫沉淀和蛋白质分析。

Representative Results

我们比较了酵母细胞解解的两种不同方法，即在4°C的玻璃珠铣削和-196°C的自动冷冻方法，以评估用这两种方法准备的细胞提取物的相对恢复蛋白。对于本研究，我们选择使用萌芽酵母菌株 YAG 1177 （MAT a lys2-810 leu2-3，-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1：TRP1 ubi2-2：：ura3 ubi3-μub-2 ubi4-2：：LEU2 [pUB39] [pUB221]）¹⁶ 携带高拷贝质粒，表达串联 HIS-MYC 标记的泛素 （HIS-MYC-Ub），因此我们可以评估在亲和力纯化后从提取物中提取标记的泛素蛋白的回收效率。

我们测试了一种快速协议，使用玻璃珠铣削在4°C^下对酵 母细胞9进行溶酶，并使用冷冻酵母细胞（酵母爆米花）的冷冻方法，在冷冻机的LN₂ 中研磨它们。我们报告与两种提取制备方法有明显区别。

在 图3A中， 我们证明，我们可以通过使用Ponceau S染色确定的冷冻研磨从全细胞提取物（WCE）中实现高得多的总蛋白质产量，使用两种不同的提取物制备方法，从相同数量的细胞中制备的等量的WCE。此外， 图3B 显示，与使用珠子打手准备的WCE相比，使用冷冻剂从WCE提取的Talon珠子后，HIS-MYC标记的泛基蛋白的恢复率更高，尽管使用两种情况下从相同数量的细胞中准备的提取物。

图3：冷冻蛋白导致细胞提取物中总蛋白质产量提高，并在从这些提取物中提取蛋白质后更好地回收标记蛋白。 （A） 全细胞提取物（WCE）按照本协议中所述为冷冻，或如前所述，用于珠铣削方法。⁹携带 HIS-MYC-Ub 的酵母菌株的 500 mL 生长到 10^{7 个}细胞/mL 的密度。然后，250 mL的培养被并行用于准备提取的每种方法。使用两种不同方法从相同数量的单元格中准备的等效数量的 WCE。然后，他标记的蛋白质使用Talon珠（IP）从相同量的每个提取物中拉下。最后，通过用变性多丙烯酰胺凝胶将其解析并转移到硝基纤维素膜上，然后用庞塞奥 S. 注意使用冷冻研磨方法准备的含有 WCE 的通道中含有 WCE 的强染色，对它们进行了比较。（B） （A） 所示的庞塞奥 S 染色硝基纤维素膜随后被处理为西方印迹，使用 HISTAG 抗体比较从两种方法准备的等量提取物中提取的 HIS-Ub 标记蛋白的量。使用哭闹（用红色箭头表示）准备的 WCE 在下拉中明显代表人数过多，而使用珠子跳动准备的 WCE 下拉的相应波段的强度明显较弱，或者检测不到。请单击此处查看此图的较大版本。

总的来说，代表性的结果表明，酵母爆米花的冷冻导致更高的产量和优越的蛋白质分离基于在WCE中由冷冻蛋白准备的更强庞塞奥S染色蛋白带（图3A）。这可能是由于通过冷冻剂准备的提取物中更有效的分解和有限的蛋白质降解，如在西方印迹通道中存在更强带，显示从低温提取物中拉下的 HIS 标记蛋白质 （IP） （图 3B） 所示。虽然玻璃珠铣削方案更快，劳动密集程度更低，但它可能不适合温度敏感或高度不稳定的蛋白质。我们还发现，分离后翻译修饰，如多泛蛋白是更有效的与冷冻治疗协议16，17，18。

Discussion

研究酵母中原生蛋白质的一个限制是酵母细胞由于其坚固的细胞壁而低效的分解。虽然已经开发出几种方法，但我们手中最一致、最有效的方法是将酵母细胞的冷冻蛋白像爆米花一样冷冻。与其他溶菌方法相比，此方法允许可靠制备来自萌芽酵母的高质量全细胞提取物。代表性的结果表明，在4°C下采用珠铣削的酵母解化机械方法优于一种流行的机械方法（图3A和3B）。在LN₂浴池中，当样品在-196°C的温度下处理时，可以有效地对酵母细胞进行冷冻，从而通过极大地限制热诱导蛋白变性和降解来保持蛋白质的完整性，而许多其他的提取物制备方法则能保持蛋白质的完整性。这允许分析样品中高度实验室大分子，并允许功能性蛋白质复合物的纯化。此外，使用冷冻机还用砂浆取代了高度劳动密集型的传统酵母爆米花手工研磨，从而能够更快、更高效地进行样品加工。最后，在不使用任何昂贵的酶的情况下实现酵母细胞解，从长远来看可以节省大量成本。

冷冻机的主要缺点是购买设备涉及的前期成本，以及涉及的最小维护和运行成本（即大量的液氮）。它还需要仔细处理潜在的危险LN₂ 的制备酵母爆米花和冷冻步骤。较大的样品需要单独处理，如果需要处理多个样本，可能会非常耗时。此外，在处理多个样品时，在重新使用之前，必须正确清洗和擦拭磨削小瓶、盖和冲击杆（或者，必须保持几套备用附件）。

这里演示的协议对于制备酵母蛋白样品进行蛋白质亲和力纯化、免疫沉淀研究、为实验室蛋白的西印样品或其修饰，或用于蛋白质^{组分析16，19，具有价值}。此外，酵母爆米花的冷冻也可用于剪切基因组^{DNA13、20、21}或^RNA22、23分离，同时尽量减少核酸酶活性，从而确保^{样品保存24。}这种多功能方法可用于大多数微生物，如^{细菌21，22}和酵母^15，并可以快速适应哺乳动物细胞， 植物^{25个和动物26}个组织^{，食品27个，}海洋标本^21个，28个包括^珊瑚23个^{，法医样本20}包括^头发29个^{，甚至化石30个，以及在}永久冻土中冷冻的灭绝生命形态^{的遗骸31个}。

总之，冷冻机中的冷冻是一种从不同来源获得的各种样品中分离蛋白质和其他大分子的高效方法，用于多种下游生化应用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent