Summary
Nous décrivons une méthode fiable pour la préparation d’extraits de cellules entières de levure ou d’autres cellules à l’aide d’un moulin cryogénique qui minimise la dégradation et la dénaturation des protéines. Les extraits cellulaires conviennent à la purification des complexes protéiques fonctionnels, aux analyses protéomiques, aux études de co-immunoprécipitation et à la détection des modifications des protéines labiles.
Abstract
La facilité de la manipulation génétique et la forte conservation évolutive des machines cellulaires eucaryotes dans la levure naissante Saccharomyces cerevisiae en ont fait un organisme modèle génétique prééminent. Toutefois, comme l’isolement efficace des protéines dépend d’une perturbation optimale des cellules, l’utilisation de levure pour l’analyse biochimique des protéines cellulaires est entravée par sa paroi cellulaire qui est coûteuse à digérer enzymatiquement (à l’aide de lyticase ou de zymolyase), et difficile à perturber mécaniquement (à l’aide d’un batteur à perles traditionnel, d’une presse Français ou d’un moulin à café) sans provoquer de chauffage des échantillons, ce qui provoque à son tour la dénaturation et la dégradation des protéines. Bien que le broyage manuel des cellules de levure sous azote liquide (LN2)à l’aide d’un mortier et d’un pilon évite la surchauffe des échantillons, il est à forte intensité de main-d’œuvre et sujet à la variabilité de la lyse cellulaire entre les opérateurs. Pendant de nombreuses années, nous avons été avec succès la préparation d’extraits de levure de haute qualité en utilisant cryogrinding des cellules dans un moulin à congélateur automatisé. La température de -196 °C atteinte avec l’utilisation de LN2 protège le matériel biologique contre la dégradation par les protéases et les nucléases, permettant la récupération de protéines intactes, d’acides nucléiques et d’autres macromolécules. Ici, nous décrivons cette technique en détail pour les cellules de levure en herbe qui consiste d’abord à congeler une suspension des cellules dans un tampon de lyse par son ajout dropwise dans LN2 pour générer des gouttelettes congelées de cellules connues sous le nom de « pop-corn ». Ce maïs soufflé est ensuite pulvérisé sous LN2 dans un moulin à congélateur pour produire un extrait congelé « en poudre » qui est décongelé lentement et clarifié par centrifugation pour enlever les débris insolubles. Les extraits qui en résultent sont prêts pour des applications en aval, telles que la purification des protéines ou des acides nucléiques, les analyses protéomiques ou les études de co-immunoprécipitation. Cette technique est largement applicable pour la préparation de l’extrait cellulaire à partir d’une variété de micro-organismes, tissus végétaux et animaux, spécimens marins, y compris les coraux, ainsi que l’isolement de l’ADN / ARN à partir de spécimens fossiles médico-légaux et pergélisol.
Introduction
La levure est un organisme modèle populaire pour les études protéiques, car il s’agit d’un organisme eucaryotique simple avec une abondance d’outils génétiques et biochimiques disponibles pour leschercheurs 1. En raison de leur paroi cellulaire robuste, un défi auquel les chercheurs sont confrontés est de lyser efficacement les cellules sans endommager le contenu cellulaire. Différentes méthodes sont disponibles pour obtenir des extraits de protéines par la perturbation des cellules de levure qui comprennent la lyse enzymatique (zymolyase)2,3, lysechimique 4, lyse physique par gel-dégel5, à base de pression (Français presse)6,7, mécanique (perles de verre, moulin à café)8,9, sonication à base de10 et cryogénique2,11. L’efficacité de la lyse cellulaire et le rendement protéique peuvent varier considérablement selon la technique employée, affectant ainsi le résultat final ou l’adéquation pour l’application en aval désirée pour le lysate. Lorsque vous étudiez des protéines instables, qui ont des modifications posttranslationnelles fugaces ou qui sont sensibles à la température, il est particulièrement important d’utiliser une méthode qui minimisera la perte ou la dégradation de l’échantillon pendant la préparation.
| Technique de préparation d’extrait | Détails | Avantages | Inconvénients | Analyse en aval | Référence |
| Français presse: Homogénéiseur haute pression (aka Microfluidizer) avec prétraitement enzymatique à l’aide de Zymolyase | Zymolyase-20T, homogénéiseur haute pression Microfluidizer. Le perturbateur se compose d’une pompe à haute pression à conduite d’air (rapport 1:250; pression d’air requise de 0,6 l MPa) et d’une chambre de perturbation spéciale avec une unité de pression arrière supplémentaire. Une taille minimale d’échantillon de 20 mL est requise pour le traitement. | La perturbation totale finale obtenue à l’aide du protocole combiné a approché 100 % avec 4 passes à une pression de 95 MPa, contre seulement 32 % de perturbations avec 4 passes à 95 MPa utilisant uniquement l’homogénéisation sans la Zymolyase. | Pas approprié pour les applications à petite échelle. Les enzymes peuvent devenir coûteuses pour les préparations à grande échelle. | Purification des protéines | 6 |
| Batteur de perles: Zymolyase cellules traitées lysed avec des perles de verre dans un instrument fastprep | Un volume à peu près égal de perles de verre froides, sèches et lavées à l’acide de 0,5 mm est ajouté à un volume donné de granulés cellulaires dans le tampon de lyse et les cellules sont perturbées par une agitation manuelle vigoureuse. | Il est particulièrement utile lors de la fabrication d’extraits de nombreuses petites cultures de levure différentes à des fins d’analyse plutôt que pour la purification des protéines. | Pendant la procédure de perle de verre, les protéines sont traitées sévèrement causant la mousse étendue menant à la dénaturation de protéine. La quantité de rupture cellulaire varie, tandis que la protéolyse ainsi que la modification des protéines peuvent résulter du chauffage de l’extrait au-dessus de 4 °C pendant la rupture mécanique. | Principalement des analyses d’ADN et d’ARN, mais aussi l’analyse des protéines par électrophéorèse de gel dénaturant, avec ou sans ballonnement occidental. | 8 |
| Traitement de zymolyase suivi d’une lyse utilisant une combinaison de choc osmotique et d’homogénéisation de Dounce | Après digestion enzymatique des parois cellulaires, les sphéoplastes sont lysés avec 15 à 20 coups d’un pilon moulant (dégagement de 1 à 3 μm) dans un homogénéisateur Dounce. | Avantageux d’utiliser des souches déficientes en protéase telles que BJ926 ou EJ101. C’est la façon la plus douce de briser les cellules de levure et, par conséquent, il est le plus approprié pour la préparation d’extraits qui peuvent effectuer des fonctions enzymatiques complexes (par exemple, traduction, transcription, réplication de l’ADN) et dans lequel l’intégrité des structures macromoléculaires (par exemple, ribosomes, épissures) doit être maintenue. Il est également utile pour isoler les noyaux intacts qui peuvent être utilisés pour des études de chromatine (Bloom et Carbon, 1982) ou pour des extraits de protéines nucléaires (Lue et Kornberg, 1987). | Les principaux inconvénients de la procédure de lyse sphéroplaste sont qu’il est relativement fastidieux et coûteux, en particulier pour les préparations à grande échelle (>10 litres), et les longues périodes d’incubation peuvent conduire à la protéolyse ou la modification des protéines. Pour les préparations de chromatine, elles semblent être de qualité variable ou inférieure à celles produites par la centrifugation différentielle (basée sur l’intégrité de l’échelle nucléosome). | Isoler les noyaux intacts pour les études de chromatine, extraits qui peuvent effectuer des fonctions enzymatiques complexes, extraits nécessitant l’intégrité de structures macromoléculaires, extraits de protéines nucléaires. |
2 |
| Perturbation cellulaire des cellules congelées flash en broyant de l’azote liquide à l’aide d’un mortier ou d’un pilon ou d’un mélangeur | Les cellules sont congelées immédiatement dans de l’azote liquide, puis lysées en broyant manuellement dans un mortier à l’aide d’un pilon, ou à l’aide d’un mélangeur Waring en présence d’azote liquide. | Le protocole est rapide et facile. Il peut accueillir différentes quantités de cellules de levure, y compris de très grandes cultures. Son principal avantage est que les cellules sont prélevées immédiatement de l’état de croissance active dans l’azote liquide (−196 °C), diminuant les activités enzymatiques dégradantes telles que les protéases et les nucléases ainsi que les activités qui modifient les protéines (p. ex., phosphatases et kinases). Il est particulièrement adapté pour la fabrication d’extraits de cellules entières à partir d’une seule culture de levure pour la purification des protéines à grande échelle. | Un peu désordonné et potentiellement dangereux pour l’enquêteur négligent. Les petits échantillons (c.-à-d. les cultures de levure de 10 à 100 ml) ne sont pas faciles à traiter parce qu’il n’y a pas assez de masse de touffes de cellules congelées pour se fracturer efficacement dans le mélangeur. Il est long de traiter des échantillons individuels et de nettoyer l’équipement entre les utilisations. | Extraits de cellules entières d’une seule culture de levure pour la purification des protéines à grande échelle. | 2 |
| Autolyse, moulin à perles | pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min | Lyse rapide et efficace, en particulier pour la préparation d’extraits à petite échelle | La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. Équipement de battement de perle requis. | Analyses à petite échelle. | 10 |
| Autolyse, Sonication | pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, puissance 80% | L’équipement de sonication est habituellement disponible dans la plupart des institutions. | La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. Équipement de sonication requis. La lente lyse peut prendre plus de 24 heures. | Préparations de la paroi cellulaire de levure. | |
| Processus d’ébullition et de gel-dégel | Aucun équipement spécialisé n’était nécessaire autre qu’un congélateur standard et un bloc chauffant ou un bain d’eau chaude. | Efficace, reproductible, simple et peu coûteux. | La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. | Analyses ADN par PCR. | 5 |
Tableau 1 : Comparaison des méthodes disponibles pour la préparation des extraits de levure.
Le cryogrinding (aka cryogrinding(broyage cryogénique/fraisage cryogénique) est couramment utilisé pour récupérer les acides nucléiques, les protéines ou les produits chimiques à partir d’échantillons sensibles à la température d’une manière fiable pour des analyses quantitatives ou qualitatives. Il a été utilisé avec succès pour de multiples applications dans divers domaines, y compris la biotechnologie, la toxicologie, la médecinelégale 12,13, les sciences de l’environnement, la biologie végétale14 et les sciences alimentaires. L’isolement des macromolécules biologiques intactes dépend généralement de façon critique de la température. Des températures extrêmement basses garantissent que les protéases et les nucléases restent inactives, ce qui entraîne un isolement fiable des protéines intactes, des acides nucléiques et d’autres macromolécules pour des analyses ultérieures. En effet, un moulin à congélateur maintient généralement une température d’échantillon de -196 °C (le point d’ébullition du LN2),minimisant ainsi la dénaturation et la dégradation de l’ADN/ARN ou des protéines.
L’usine de congélation utilise une chambre de broyage électromagnétique qui déplace rapidement une barre métallique solide ou un cylindre dans un flacon contenant l’échantillon à pulvériser entre les bouchons d’extrémité en acier inoxydable. L’instrument crée et inverse rapidement un champ magnétique dans la chambre de broyage. Au fur et à mesure que le champ magnétique se déplace d’avant en arrière, l’aimant écrase l’échantillon contre les bouchons, réalisant ainsi la « cryogrinding » et la pulvérisation du maïs soufflé. L’usine de congélation remplace le mortier et le pilon et permet le traitement séquentiel de plusieurs échantillons (ou jusqu’à 4 échantillons plus petits simultanément) par une reproduction élevée et évite la variabilité utilisateur-utilisateur associée au broyage manuel. Une fois les échantillons traités, les extraits cellulaires peuvent être utilisés pour une variété d’applications en aval.
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Protocol
1. Préparation de maïs soufflé à levures
- Cultiver des cellules de levure dans 0,5 L de médias YPD à une densité de 1 x 107 cellules /mL. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur Coulter ou de tout autre moyen.
- Cellules centrifugeuses pendant 10 min à 2 400 g et 4 °C.
- Lavez chaque échantillon une fois avec 500 mL d’eau glacée déionisée de 18 méga Ohm Milli-Q.
- Resuspendez les granulés dans 15 mL de tampon de lyse glacée [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycérol, avec agent réducteur fraîchement ajouté 10 mM β-mercaptoethanol, cocktail inhibiteur de la protéase, inhibiteur du protéasome 10 μM MG-132, inhibiteur de la deacetylase de 1 mM inhibiteur du butyrate de sodium et inhibiteurs du phosphatase (vanadate de sodium de 1 mM, fluorure de sodium de 50 mM, β-glycérophosphate de sodium)]. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails. Gardez les cellules résuspendées sur la glace jusqu’à ce que les échantillons soient prêts pour la prochaine étape.
REMARQUE : Une grande variété de tampons de lyse contenant un certain nombre de détergents non ioniques peuvent être utilisés avec les échantillons et les inhibiteurs spécifiques qui y sont inclus en fonction de l’application en aval. L’inclusion de protéase et d’inhibiteurs protéasomal est cruciale pour prévenir la dégradation des protéines, en particulier une fois que les extraits sont décongelés. - Faire snap pop-corn de levure congelée en ajoutant lentement la suspension cellulaire une goutte à la fois à l’aide d’une pipette sérologique pré-réfrigérée dans un ou plusieurs tubes centrifugeuses de 50 mL conservés sur la glace sèche et remplis de LN2 jusqu’à ce que juste en dessous de la jante. Rechargez fréquemment l’azote liquide dans le tube pour compenser sa perte due à une évaporation rapide. Travaillez dans une zone bien ventilée pour éviter les dangers associés à l’asphyxie de l’azote.
- Au lieu d’un tube de 50 mL, utilisez plusieurs tubes de 50 mL attachés entre eux (ou tout récipient avec une grande bouche, comme une grande bouteille de centrifugeuse en plastique qui peut tolérer des températures cryogéniques) pour la préparation du maïs soufflé (figure 1A). Plus le récipient est grand et son ouverture, plus la préparation du maïs soufflé est facile, car cela empêche l’agglutination du maïs soufflé de former de gros agrégats. Une plage de taille de 0,3 à 0,5 cm pour le maïs soufflé est idéale pour obtenir un broyage/pulvérisation approprié à l’aide du moulin à congélateur (figure 1B).
- Assurez-vous que le LN2 s’est complètement évaporé des tubes contenant le maïs soufflé avant de les stocker à -80 °C. Il est possible de s’arrêter après la préparation du maïs soufflé levure car ils sont stables pendant plusieurs années lorsqu’ils sont maintenus à -80 °C.
Figure 1 :Préparation de maïs soufflé à levures. (A) Levure « pop-corn » est faite par la congélation dropwise de la suspension cellulaire dans LN2. Nous utilisons un à trois tubes de 50 mL maintenus ensemble avec un élastique et placés dans un seau à glace rempli de glace sèche. Les tubes sont remplis de LN2 jusqu’à ce que juste en dessous de leurs jantes et sont complétés avec de l’azote liquide fréquemment pour les garder presque plein jusqu’à ce que toute la suspension cellulaire avait été faite en maïs soufflé (B) La taille du maïs soufflé est un déterminant important de l’efficacité optimale de broyage. La portée du maïs soufflé doit être comprise entre 0,3 et 0,5 cm de diamètre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Cryogrinding
- Pour commencer, assurez-vous qu’il y a suffisamment de LN2 disponible pour refroidir l’usine de congélation, broyer les flacons, les fournitures et faire fonctionner la machine pour tous les échantillons. Pour moins de cinq échantillons, 30-35 L de LN2 devraient suffire. Remplissez la chambre de l’usine de congélation de LN2 jusqu’à la ligne de remplissage.
AVERTISSEMENT: Toutes les étapes impliquant le LN2 doivent être effectuées dans une zone bien ventilée et l’usine de congélation elle-même doit être située dans une telle zone afin d’éviter tout risque d’asphyxie. Portez de l’équipement de protection individuelle, y compris des chaussures appropriées, un manteau de laboratoire, des lunettes de sécurité, une couche de base de gants de nitrile, puis des gants thermiques, suivis d’une autre paire de gants de nitrile. Faire preuve d’une extrême prudence lors de la manipulation de LN2. - Fermez lentement le couvercle du moulin à congélateur, en évitant l’éclaboussure de LN2 et laissez quelques minutes pour que la machine refroidisse. Il peut être nécessaire de remplir la chambre de LN2 pour compenser la perte due à l’évaporation avant de passer à l’étape suivante.
REMARQUE : Remplissez LN2 au besoin uniquement jusqu’à la ligne de remplissage. Ne remplissez pas trop la chambre car cela peut être à la fois dangereux et préjudiciable à la machine. Des systèmes de recharge automatisés sont disponibles pour l’usine de congélation qui peut reconstituer le LN2 évaporant au besoin directement à partir d’un réservoir de stockage relié à l’usine de congélation. - Pré-refroidir les grandes fioles de broyage et la barre d’impacteur magnétique en les dunking dans LN2 conservés dans une petite dewar séparée. Décanter toute la LN2 lorsque le LN2 cesse de bouillonner. Ajouter ensuite le maïs soufflé échantillon/levure au flacon de broyage et sceller hermétiquement avec les deux bouchons d’extrémité en acier inoxydable.
- Ne remplissez pas plus d’un tiers du flacon de broyage avec l’échantillon, car cela peut réduire l’efficacité du broyage. Au lieu de cela, de plus gros échantillons peuvent être traités en les divisant en deux flacons ou plus et en les broyant séquentiellement. De plus petits flacons de broyage peuvent être utilisés pour des échantillons plus petits (jusqu’à 3 mL).
- Placez le flacon de broyage dans la chambre de l’usine de congélation et verrouillez-le en place. Fermez le couvercle.
- Pour la levure en herbe, moudre les échantillons pendant un total de trois cycles pendant 2 min/cycle (avec 2 minutes de pause pour le refroidissement entre les cycles) à un taux de concassage de 14. Lorsque la machine s’arrête après avoir terminé les cycles, ouvrez lentement et soigneusement le couvercle du moulin à congélateur avec le flacon avec le lysate de cellules congelées en poudre et retirez-le du moulin à congélateur. Si plusieurs petits flacons sont utilisés, travaillez rapidement pour enlever un flacon à la fois et les placer dans de la glace sèche.
REMARQUE : Il n’est généralement pas nécessaire d’ajuster les paramètres de broyage lors de l’utilisation de flacons de différentes tailles avec le même type d’échantillon. Toutefois, les paramètres de broyage tels que le nombre de cycles et le taux de broyage doivent être déterminés empiriquement pour différents types d’échantillons, selon la facilité avec laquelle ils lyse. La plupart des cellules mammifères et des tissus mous se lysent en 1-2 cycles à un taux écrasant de 10. Les échantillons plus difficiles à lyser comme les bactéries, les levures, les larves de mouches et les mouches des fruits adultes nécessitent de 3 à 6 cycles au rythme maximal, tandis que les tissus durs comme les os, les dents, etc. peuvent nécessiter jusqu’à 10 cycles. Un petit aliquot de l’échantillon décongelé peut être vu sous le microscope avant et après le broyage pour compter le nombre de cellules intactes et nonlysées pour déterminer l’efficacité de la lyse. Une excellente analyse de l’impact des paramètres cryogrinding sur la libération des protéines et de l’ADN de la levure naissante a été publiée précédemment15. - En travaillant rapidement afin de ne pas permettre à l’échantillon de décongeler, dévissez soigneusement l’une des pièces d’extrémité (choisissez celle qui semble être devenue un peu lâche pendant le broyage) à l’aide de l’outil d’ouverture. Ensuite, utilisez une paire de forceps longs (qui sont pré-refroidis dans un seau avec de la glace sèche) pour enlever la barre d’impacteur. Recueillir l’échantillon pulvérisé en inversant et en tapant le flacon de broyage sur un plat de pesage en polystyrène pré-réfrigéré avec du LN2 et conservé sur de la glace sèche.
- Une fois que tout le lysate de cellules congelées en poudre a été récupéré du flacon de broyage, versez le lysate en poudre du plat de pesage dans le tube de 50 mL et passez immédiatement à l’étape de décongélation lente décrite ensuite pour obtenir de meilleurs résultats. Sinon, conservez le lysate congelé en poudre toute la nuit à -80 °C, bien que cela puisse entraîner une certaine dégradation.
- Préparez un seau à glace avec une boue de glace et d’eau à 50 % et placez-le sur une plaque de remue-glace à l’aide d’un agitateur magnétique. Submergez une grille ou une autre grille appropriée dans le lisier de glace pour retenir les échantillons.
- Puis, décongelez lentement les échantillons sur un bain de boue de glace avec agitation constante du lisier à l’aide d’un agitateur magnétique. Ajouter plus de glace pour remplacer la fonte des glaces (il se peut qu’il soit nécessaire de jeter de l’eau pour empêcher le seau à glace de déborder). Étant donné que plusieurs inhibiteurs ont une courte demi-vie dans des tampons aqueux, ajouter un cocktail inhibiteur supplémentaire de la protéase (voir tableau des matériaux)et un inhibiteur du protéasome MG-132 de 10 μM au lysate une fois que les échantillons commencent à décongeler (après environ 30 min).
- Retirer la glace formée à l’extérieur des tubes toutes les 5 minutes pour accélérer le processus de décongélation. Notez que le dégel rapide des échantillons à température ambiante ou plus élevée peut entraîner une dégradation significative.
- Une fois que les échantillons ont complètement décongelé (cela peut prendre plus d’une heure selon la quantité d’échantillon), centrifugeuse du lysate à ~3 220 g pendant 20 min dans une centrifugeuse réfrigérée à table à 4 °C pour enlever la majeure partie des débris cellulaires du lysate.
- Transférer le supernatant dans des tubes de centrifugeuse en polycarbonate de 50 mL qui ont été pré-refroidis sur la glace et centrifuger les échantillons à 16 000 g pendant 20 min à 4 °C (voir tableau des matériaux).
- Transférez seulement le supernatant clair composé de l’extrait entier clarifié de cellules du centre de la colonne liquide dans le tube très lentement et soigneusement, sans déranger la couche nuageuse de lipide (figure 2), dans un tube refroidi de 15 mL utilisant des pipettes sérologiques pré-refroidies. Évitez d’enlever tout le lysate dans le tube de centrifugeuse pour empêcher le report des lipides et des débris. Les restes de lysate dans le tube de centrifugeuse peuvent être centrifugés plusieurs fois pour récupérer de petites quantités d’extrait après chaque tour.
REMARQUE : Les lipides ainsi que toutes les protéines dénaturées semblent nuageux/laitux et sont situés au sommet de l’interface liquide/air, et parfois au-dessus de la pastille elle-même qui se compose de débris cellulaires insolubles (figure 2).
Figure 2 :Extraire les couches dans un tube de centrifugeuse. Les principales caractéristiques visibles de l’extrait cellulaire entier dans un tube après centrifugation à 16.000 g pendant 20 min sont indiquées. L’abondance relative de chaque entité dépend du type d’échantillon, de la phase de croissance des cellules (exponentielle par rapport stationnaire), de la quantité de tampon de lyse utilisée pour résuspendre les cellules et de l’efficacité de la lyse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Centrifugeuse tout lysate restant pendant 5 min pour récupérer plus de l’extrait. Répétez cette centrifugation de 5 min plusieurs fois si nécessaire pour récupérer autant d’extrait clair que possible. Jetez le lysate nuageux contenant des lipides près du fond du tube près de la pastille.
- Utilisez ces extraits pour des applications en aval telles que la purification complexe protéique, l’immunoprécipitation et l’analyse protéomique.
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Representative Results
Nous avons comparé deux méthodes différentes pour la lyse cellulaire de levure, à savoir le mouture de perle de verre à 4 °C et une méthode automatisée de cryogrinding à -196 °C, pour évaluer les protéines relatives de récupération dans les extraits cellulaires préparés avec les deux méthodes. Pour cette étude, nous avons choisi d’utiliser une souche de levure en herbe YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi 3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 portant un plasmide à copie élevée exprimant un tandem HIS-MYC marqué Ubiquitine (HIS-MYC-Ub) afin que nous puissions évaluer l’efficacité de la récupération des protéines ubiquitinées étiquetées à partir d’extraits suivant la purification de l’affinité.
Nous avons testé un protocole rapide qui utilise le mouture de perles de verre pour lyse cellulesde levure 9 à 4 °C et la méthode cryogrinding en utilisant des cellules de levure congelées (pop-corn levure) et les broyer dans LN2 dans un moulin à congélateur. Nous rapportons une différence claire avec les deux méthodes de préparation d’extrait.
Dans la figure 3A, nous démontrons que nous pouvons obtenir un rendement protéique total nettement plus élevé à partir d’extraits de cellules entières (WCE) préparés à l’aide du broyage du congélateur tel que déterminé par ponceau S colorant après chargement des quantités équivalentes de WCE préparées à partir du même nombre de cellules en utilisant les deux méthodes de préparation d’extrait différentes. De plus, la figure 3B montre une récupération plus élevée des protéines ubiquitylated étiquetées HIS-MYC après avoir tiré vers le bas à l’aide de perles Talon du WCE préparées par cryogrinding, par rapport au WCE préparé à l’aide du batteur de perles, malgré l’utilisation d’extraits préparés à partir du même nombre de cellules dans les deux cas.
Figure 3: La cryogrinding entraîne des rendements totaux plus élevés en protéines dans les extraits cellulaires et une meilleure récupération des protéines étiquetées à la suite de l’extraction des protéines de ces extraits. (A) Des extraits de cellules entières (WCE) ont été préparés comme décrit dans ce protocole pour le cryogrinding ou comme décrit précédemment pour la méthode de mouture des perles. 9 Cinq cents mL de la souche de levure transportant HIS-MYC-Ub a été cultivé à la densité de 107 cellules/mL. Ensuite, 250 mL de la culture a été utilisé en parallèle pour préparer des extraits par chaque méthode. Des quantités équivalentes de WCE ont été préparées à partir du même nombre de cellules en utilisant les deux méthodes différentes. Ses protéines étiquetées HIS ont ensuite été retirées à l’aide de perles Talon (IP) de la même quantité de chaque extrait. Enfin, ces protéines purifiées d’affinité ont été comparées en les résolvant sur un gel de polyacrylamide dénaturant et en transférant à une membrane de nitrocellulose suivie de la coloration avec Ponceau S. Remarquez la coloration plus forte dans toute la voie contenant WCE préparée à l’aide de la méthode de broyage du congélateur. (B) La membrane de nitrocellulose tachée Ponceau S montrée dans (A) a ensuite été traitée pour le ballonnement occidental utilisant des anticorps d’étiquette de HIS pour comparer les quantités des protéines étiquetées HIS-Ub tirées vers le bas des quantités égales d’extrait préparées par les deux méthodes. Plusieurs bandes ont été clairement surreprésentées dans le retrait à l’aide du WCE préparé par cryogrinding (indiqué par les flèches rouges), tandis que les bandes correspondantes dans le retrait à l’aide de WCE préparé par des battements de perles étaient soit considérablement plus faibles en intensité, soit indétectables. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dans l’ensemble, les résultats représentatifs montrent que la cryogrinding du maïs soufflé à levures conduit à des rendements plus élevés et l’isolement des protéines supérieures basé sur les bandes de protéines tachées Ponceau S plus forte dans le WCE préparé par cryogrinding (Figure 3A). Ceci est probablement dû à une lyse plus efficace et à une dégradation limitée des protéines dans l’extrait préparé par cryogrinding, comme l’indique la présence de bandes plus fortes dans la voie de tache occidentale montrant des protéines étiquetées HIS tirées vers le bas (IP) de l’extrait cryogénique (figure 3B). Bien que le protocole de mouture des perles de verre soit plus rapide et moins laborieux, il peut ne pas convenir aux protéines sensibles à la température ou très instables. Nous constatons également que l’isolement des modifications posttranslationnelles telles que les protéines polyubiquitines est plus efficace avec le protocole cryogrinding16,17,18.
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Discussion
Une limitation de l’étude des protéines indigènes de la levure est la lyse inefficace des cellules de levure en raison de leur paroi cellulaire dure. Bien que plusieurs méthodes aient été développées, la méthode la plus cohérente et efficace dans nos mains est le cryogrinding des cellules de levure flash congelés comme pop-corn. Cette méthode permet la préparation fiable d’extraits de cellules entières de haute qualité de levure en herbe par rapport à d’autres méthodes de lyse. Les résultats représentatifs ont démontré que le cryogrinding est supérieur à une méthode mécanique populaire pour la lyse de levure qui emploie la mouture de perle à 4 °C (figure 3A et 3B). Cryogrinding lyses efficacement cellules de levure tandis que les échantillons sont traités à une température de -196 °C dans un bain LN2, maintenant ainsi l’intégrité des protéines en limitant considérablement la dénaturation et la dégradation des protéines induites par la chaleur qui se produit avec de nombreuses autres méthodes de préparation d’extrait. Cela permet l’analyse de macromolécules très labile dans les échantillons et permet la purification des complexes protéiques fonctionnels. En outre, l’utilisation de l’usine de congélation remplace également le broyage manuel traditionnel très laborieux du maïs soufflé à levures par un mortier, permettant un traitement plus rapide et efficace de l’échantillon. Enfin, la réalisation de la lyse cellulaire de levure sans l’utilisation d’enzymes coûteuses prévoit des économies significatives à long terme.
Le principal inconvénient d’une usine de congélation est le coût initial de l’achat de l’équipement, ainsi que les coûts minimes d’entretien et de fonctionnement (c.-à-d. de grandes quantités d’azote liquide) en cause. Il nécessite également une manipulation attentive de LN2 potentiellement dangereux à la fois pour la préparation du maïs soufflé à levures et les étapes cryogrinding. Les échantillons plus gros doivent être traités individuellement, ce qui peut prendre beaucoup de temps si plusieurs échantillons doivent être traités. De plus, lors du traitement de plusieurs échantillons, les flacons de broyage, les bouchons et les barres d’impacteur doivent être correctement lavés et nettoyés avant d’être réutilisés (alternativement, plusieurs ensembles d’accessoires de rechange doivent être entretenus).
Le protocole démontré ici est précieux pour la préparation d’échantillons de protéines de levure pour la purification de l’affinité protéique, les études d’immunoprécipitation, la préparation d’échantillons pour les ballonnements occidentaux pour les protéines labiles ou leurs modifications, ou pour les analyses protéomiques16,19. En outre, le cryogrinding du maïs soufflé de levure peut également être utilisé pour l’ADN génomique cisaillé13,20,21 ouARN22,23 isolementtouten minimisant l’activité de nucléase, assurant ainsi la conservation d’échantillon24. Cette méthode polyvalente peut être utilisée comme c’est le cas pour la plupart des micro-organismes tels queles bactéries 21,22 et les levures 15, et peut être rapidement adaptée pour les cellules mammifères, plantes25 et animaux26 tissus, produits alimentaires27, spécimens marins21 , 28dont les coraux23, échantillons médico-légaux20 dontles cheveux 29 et même fossiles30 ainsi que les restes de formes de vie éteintes congelées dans le pergélisol31.
En conclusion, le cryogrinding dans un moulin de congélateur est une méthode efficace pour l’isolement de protéine et d’autres macromolécules d’une série d’échantillons dérivés de diverses sources pour des applications biochimiques en aval multiples.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La recherche dans le laboratoire Gunjan est soutenue par le financement des National Institutes of Health, de la National Science Foundation et du Florida Department of Health. Nous remercions John Parker, étudiant de premier cycle, pour son assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
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