Préparation d’extraits cellulaires par cryogrinding dans un moulin à congélateur automatisé

Summary

Nous décrivons une méthode fiable pour la préparation d’extraits de cellules entières de levure ou d’autres cellules à l’aide d’un moulin cryogénique qui minimise la dégradation et la dénaturation des protéines. Les extraits cellulaires conviennent à la purification des complexes protéiques fonctionnels, aux analyses protéomiques, aux études de co-immunoprécipitation et à la détection des modifications des protéines labiles.

Abstract

La facilité de la manipulation génétique et la forte conservation évolutive des machines cellulaires eucaryotes dans la levure naissante Saccharomyces cerevisiae en ont fait un organisme modèle génétique prééminent. Toutefois, comme l’isolement efficace des protéines dépend d’une perturbation optimale des cellules, l’utilisation de levure pour l’analyse biochimique des protéines cellulaires est entravée par sa paroi cellulaire qui est coûteuse à digérer enzymatiquement (à l’aide de lyticase ou de zymolyase), et difficile à perturber mécaniquement (à l’aide d’un batteur à perles traditionnel, d’une presse Français ou d’un moulin à café) sans provoquer de chauffage des échantillons, ce qui provoque à son tour la dénaturation et la dégradation des protéines. Bien que le broyage manuel des cellules de levure sous azote liquide (LN₂₎à l’aide d’un mortier et d’un pilon évite la surchauffe des échantillons, il est à forte intensité de main-d’œuvre et sujet à la variabilité de la lyse cellulaire entre les opérateurs. Pendant de nombreuses années, nous avons été avec succès la préparation d’extraits de levure de haute qualité en utilisant cryogrinding des cellules dans un moulin à congélateur automatisé. La température de -196 °C atteinte avec l’utilisation de LN₂ protège le matériel biologique contre la dégradation par les protéases et les nucléases, permettant la récupération de protéines intactes, d’acides nucléiques et d’autres macromolécules. Ici, nous décrivons cette technique en détail pour les cellules de levure en herbe qui consiste d’abord à congeler une suspension des cellules dans un tampon de lyse par son ajout dropwise dans LN_{2 pour} générer des gouttelettes congelées de cellules connues sous le nom de « pop-corn ». Ce maïs soufflé est ensuite pulvérisé sous LN₂ dans un moulin à congélateur pour produire un extrait congelé « en poudre » qui est décongelé lentement et clarifié par centrifugation pour enlever les débris insolubles. Les extraits qui en résultent sont prêts pour des applications en aval, telles que la purification des protéines ou des acides nucléiques, les analyses protéomiques ou les études de co-immunoprécipitation. Cette technique est largement applicable pour la préparation de l’extrait cellulaire à partir d’une variété de micro-organismes, tissus végétaux et animaux, spécimens marins, y compris les coraux, ainsi que l’isolement de l’ADN / ARN à partir de spécimens fossiles médico-légaux et pergélisol.

Introduction

La levure est un organisme modèle populaire pour les études protéiques, car il s’agit d’un organisme eucaryotique simple avec une abondance d’outils génétiques et biochimiques disponibles pour les^{chercheurs 1}. En raison de leur paroi cellulaire robuste, un défi auquel les chercheurs sont confrontés est de lyser efficacement les cellules sans endommager le contenu cellulaire. Différentes méthodes sont disponibles pour obtenir des extraits de protéines par la perturbation des cellules de levure qui comprennent la lyse enzymatique (zymolyase)^2,3, lyse^{chimique 4}, lys....

Protocol

1. Préparation de maïs soufflé à levures

1. Cultiver des cellules de levure dans 0,5 L de médias YPD à une densité de 1 x 10⁷ cellules /mL. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur Coulter ou de tout autre moyen.
2. Cellules centrifugeuses pendant 10 min à 2 400 g et 4 °C.
3. Lavez chaque échantillon une fois avec 500 mL d’eau glacée déionisée de 18 méga Ohm Milli-Q.
4. Resuspendez les granulés dans 15 mL de tampon de lyse glacée [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycérol, avec agent réducteur fraîchement ajouté 10 mM β-mercaptoethanol, cocktail inhibiteur de la protéase, inhibiteur du protéasome 10 μM MG-13....

Results

Nous avons comparé deux méthodes différentes pour la lyse cellulaire de levure, à savoir le mouture de perle de verre à 4 °C et une méthode automatisée de cryogrinding à -196 °C, pour évaluer les protéines relatives de récupération dans les extraits cellulaires préparés avec les deux méthodes. Pour cette étude, nous avons choisi d’utiliser une souche de levure en herbe YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi 3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [.......

Discussion

Une limitation de l’étude des protéines indigènes de la levure est la lyse inefficace des cellules de levure en raison de leur paroi cellulaire dure. Bien que plusieurs méthodes aient été développées, la méthode la plus cohérente et efficace dans nos mains est le cryogrinding des cellules de levure flash congelés comme pop-corn. Cette méthode permet la préparation fiable d’extraits de cellules entières de haute qualité de levure en herbe par rapport à d’autres méthodes de lyse. Les résultats représentatifs ont démontré q.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes en polycarbonate de 50 mL avec bouchons à vis	Beckman	357002	Tubes à centrifuger
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Levure YPD Composant de milieu
BD Extrait de levure Bacto	BD Biosiences	212750	Levure YPD Composant de média
Beckman Avanti centrifugeuse	Beckman	B38624	Centrifugeuse à grande vitesse
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydre	MP Biomedicals	901521	Levure Composant de milieu YPD
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Rotor à godets oscillants
Centrifugeuse réfrigérée Eppendorf 5810 R	Eppendorf	22625101	Centrifugeuse réfrigérée
Glycérol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Excluseur de volume et cryoprotecteur
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Tampon
HIS6 Anticorps	Novagen	70796	Anticorps pour HIS
tag KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Sel pour le maintien de la force ionique
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Inhibiteur de protéasome
Cocktail inhibiteur de la phosphatase	ThermoFisher Scientific	A32957	Cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Cocktail d’inhibiteurs
protéase	ThermoFisher Scientific	A32963	Cocktail d’inhibiteurs de protéase
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Butyrate de sodium	EM Science	BX2165-1	Inhibiteur de l’histone désacétylase
Fluorure de sodium	Sigma-Aldrich	S6521	Inhibiteur de phosphatase
Vanadate de sodium	MP Biomedicals	159664	Inhibiteur de la phosphatase
Sodium &beta ;-glycérophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Inhibiteur de phosphatase
Spex Certiprep 6850 Congélateur	SPEX Sample Prep	6850	Congélateur
TALON Metal Affinity Résine	BD Biosiences	635502	Pour abattre HIS Protéines étiquetées
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Détergent non ionique
&beta ;-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Agent réducteur