Summary
אנו מתארים שיטה אמינה להכנת תמציות תאים שלמים שמרים או תאים אחרים באמצעות טחנת מקפיא cryogenic הממזערת השפלה והשפלה של חלבונים. תמציות התא מתאימות לטיהור של תסביכי חלבון פונקציונליים, ניתוחים פרוטאומיים, מחקרים לפירוק חיסוני וזיהוי שינויים בחלבון labile.
Abstract
הקלות של מניפולציה גנטית ושימור אבולוציוני חזק של מכונות תאיות אאוקריוטיות שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae הפך אותו אורגניזם מודל גנטי טרום תוה. עם זאת, מכיוון שבידוד חלבון יעיל תלוי בשיבוש אופטימלי של תאים, השימוש ב שמרים לניתוח ביוכימי של חלבונים תאיים נפגע על ידי קיר התא שלו שהוא יקר לעיכול אנזימטי (באמצעות lyticase או zymolyase), וקשה לשבש מכנית (באמצעות מקף חרוזים מסורתי, עיתונות צרפתית או מטחנת קפה) מבלי לגרום לחימום של דגימות, אשר בתורו גורם לפירוק חלבון והשפלה. למרות שחיקה ידנית של תאי שמרים תחת חנקן נוזלי (LN2) באמצעות מרגמהועלי מונע התחממות יתר של דגימות, זה עבודה אינטנסיבית וכפוף לשונות בתא lysis בין המפעילים. במשך שנים רבות, אנחנו כבר בהצלחה הכנת תמציות שמרים באיכות גבוהה באמצעות cryogrinding של תאים במפעל מקפיא אוטומטי. הטמפרטורה של -196 °C שהושגה עם השימוש LN2 מגן על החומר הביולוגי מפני השפלה על ידי פרוטאזים וגרעין, המאפשר אחזור של חלבונים שלמים, חומצות גרעין ומקרומולקולות אחרות. כאן אנו מתארים טכניקה זו בפירוט עבור תאי שמרים ניצנים אשר כרוך הראשון הקפאת השעיה של תאים במאגר lysis דרך תוספת dropwiseשלה לתוך LN 2 כדי ליצור טיפות קפואות של תאים המכונה "פופקורן". פופקורן זה הוא מרוסק לאחר מכן תחת LN2 במפעל מקפיא כדי ליצור קפוא "אבקה" לחלץ אשר מופשר לאט והבהיר על ידי צנטריפוגה כדי להסיר פסולת מסיסה. תמציות וכתוצאה מכך מוכנים ליישומים במורד הזרם, כגון טיהור חלבון או חומצה נוקלית, ניתוחים פרוטאומיים, או מחקרים שיתוף ערך חיסוני. טכניקה זו ישימה באופן נרחב להכנת תמצית תאים ממגוון של מיקרואורגניזמים, רקמות צמחים ובעלי חיים, דגימות ימיות כולל אלמוגים, כמו גם בידוד DNA/RNA מדגימות מאובנים משפטיות ואדמה.
Introduction
שמרים הוא אורגניזם מודל פופולרי עבור מחקרי חלבון, כפי שהוא אורגניזם אאוקריוטי פשוט עם שפע של כלים גנטיים וביוכימיים זמינים עבורחוקרים 1. בשל קיר התאים היתון שלהם, אחד האתגרים העומדים בפני החוקרים הוא בהתפלה יעילה של התאים מבלי לפגוע בתכולת התא. שיטות שונות זמינות לקבלת תמציות חלבון באמצעות שיבוש של תאי שמרים הכוללים אנזימה (zymolyase)2,3, ליזיסכימי 4, ליזיס פיזי על ידי הקפאתהפשרה 5, מבוסס לחץ(עיתונותצרפתית) 6,7 ,מכני (חרוזיזכוכית, מטחנתקפה) 8,9, sonication מבוסס10 ו cryogenic2,11. היעילות של ליזיס התא ותפוקת החלבון יכולה להשתנות במידה ניכרת בהתאם לטכניקה המועסקת, ובכך להשפיע על התוצאה הסופית או על התאמת היישום במורד הזרם הרצוי עבור lysate. כאשר לומדים חלבונים לא יציבים, יש שינויים לאחר התרגום חולף, או רגישים לטמפרטורה, חשוב במיוחד להשתמש בשיטה שתמזער אובדן או ירידה במדגמים במהלך ההכנה.
| טכניקת הכנת חילוץ | פרטים | יתרונות | חסרונות | ניתוח במורד הזרם | הפניה |
| עיתונות צרפתית: הומוגניזר בלחץ גבוה (aka Microfluidizer) עם טיפול נזימטי באמצעות Zymolyase | זימוליז-20T, הומוגניזר מיקרופלוייזר בלחץ גבוה. המשבש מורכב משאבה אוויר מונחה, בלחץ גבוה (יחס 1:250; נדרש לחץ אוויר 0.6-l MPa) ותא שיבוש מיוחד עם יחידת לחץ גב נוספת. גודל מדגם מינימלי של 20 מ"ל נדרש לעיבוד. | השיבוש הכולל הסופי שהושג באמצעות הפרוטוקול המשולב התקרב 100 % עם 4 עובר בלחץ של 95 MPa, לעומת רק 32 % שיבוש עם 4 עובר ב 95 MPa באמצעות הומוגניזציה בלבד ללא Zymolyase. | אינו מתאים ליישומים בקנה מידה קטן. האנזימים יכולים להיות יקרים להכנות בקנה מידה גדול. | טיהור חלבונים | 6 |
| מכה חרוז: תאים שטופלו Zymolyase lysed עם חרוזי זכוכית במכשיר fastprep | בערך נפח שווה של קר, יבש, חומצה שטף 0.5 מ"מ זכוכית חרוזים מתווסף נפח נתון של כדורי תא במאגר lysis ואת התאים משובשים על ידי תסיסה ידנית נמרצת. | זה שימושי במיוחד בעת ביצוע תמציות מתרבויות שמרים קטנות רבות ושונות למטרות ציון ולא לטיהור חלבונים. | במהלך הליך חרוז זכוכית, חלבונים מטופלים בחומרה גרימת קצף נרחב המוביל denaturation חלבון. כמות שבירה תאים משתנה, בעוד proteolysis, כמו גם שינוי של החלבונים עשויים לנבוע חימום של התמצית מעל 4 מעלות צלזיוס במהלך השבירה מכנית. | בעיקר DNA & RNA מנתח, אבל גם ניתוח חלבון על ידי denaturing ג'ל electropheoresis, עם או בלי כתמים מערביים. | 8 |
| טיפול Zymolyase ואחריו lysis באמצעות שילוב של הלם אוסמוטי הומוגניזציה Dounce | לאחר עיכול אנזימטי של קירות התא, spheroplasts הם lysed עם 15 כדי 20 משיכות של עלי הדוק (סיווג 1 עד 3 μm) ב homogenizer Dounce. | יתרון לשימוש זנים protease לקוי כגון BJ926 או EJ101. זוהי הדרך העדינה ביותר לשבור תאי שמרים ולכן היא מתאימה ביותר להכנת תמציות שיכולות לבצע פונקציות אנזימטיות מורכבות (למשל, תרגום, שעתוק, שכפול DNA) ולכן יש לשמור על שלמות המבנים המקרומולקולריים (למשל, ריבוזומים, חביות). זה גם שימושי לבידוד גרעינים שלמים שניתן להשתמש בהם עבור מחקרי כרומטין (בלום ופחמן, 1982) או עבור תמציות חלבון גרעיני (לו וקורנברג, 1987). | החסרונות העיקריים של הליך הליזה spheroplast הם שזה מיגע ויקר יחסית, במיוחד עבור הכנות בקנה מידה גדול (>10 ליטר), ותקופות הדגירה הארוכות יכול להוביל פרוטאוליזה או שינוי חלבון. עבור תכשירים כרומטין, הם נראים באיכות משתנה או נמוכה יותר מאלה המיוצרים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית (מבוסס על שלמות סולם נוקלאוזום). | בידוד גרעינים שלמים עבור מחקרי כרומטין, תמציות שיכולות לבצע פונקציות אנזימטיות מורכבות, תמציות הדורשות את שלמות מבנים מקרומולקולריים, תמציות חלבון גרעיני. |
2 |
| שיבוש תאים של תאים קפואים פלאש על ידי שחיקה חנקן נוזלי באמצעות מרגמה / עלי או בלנדר | תאים קפואים מיד בחנקן נוזלי ולאחר מכן lysed על ידי שחיקה ידנית במרגמה באמצעות עלי, או באמצעות בלנדר Waring בנוכחות חנקן נוזלי. | הפרוטוקול מהיר וקל. זה יכול להכיל כמויות שונות של תאי שמרים כולל תרבויות גדולות מאוד. היתרון העיקרי שלה הוא כי תאים נלקחים באופן מיידי מהמדינה הגדלה באופן פעיל לתוך חנקן נוזלי (-196 ° C), הפחתת פעילויות אנזימים משפילים כגון פרוטאזים וגרעין, כמו גם פעילויות לשנות חלבונים (למשל, פוספטאזים וkinases). הוא מתאים במיוחד להכנת תמציות תאים שלמים מתרבות שמרים אחת לטיהור חלבונים בקנה מידה גדול. | קצת מבולגן ועלול להיות מסוכן לחוקר רשלני. דגימות קטנות (כלומר, 10- עד 100 מ"ל שמרים תרביות) אינן מעובדות בקלות כי אין מספיק מסה של גושי תאים קפואים כדי לשבור ביעילות בבלנדר. זה זמן רב כדי לעבד דגימות בודדות ולנקות את הציוד בין שימושים. | תמציות תאים שלמים מתרבות שמרים אחת לטיהור חלבונים בקנה מידה גדול. | 2 |
| תסיסה אוטומטית, טחנת חרוזים | pH 5.0, 50 °C, 24 שעות, 200 סל"ד / Ø 0.5 מ"מ, 5 × 3 דקות/3 דקות | תמצית מהירה ויעילה, במיוחד להכנת תמצית בקנה מידה קטן | יצירת חום מובילה לפירוק והשפלה של מקרומולקולות. נדרש ציוד מכות חרוזים. | ניתוחים בקנה מידה קטן. | 10 |
| אוטוליזה, Sonication | pH 5.0, 50°C, 24 שעות, 200 סל"ד, 4 × 5 דקות/2 דקות, פולס 80%, הספק 80% | ציוד Sonication זמין בדרך כלל ברוב המוסדות. | יצירת חום מובילה לפירוק והשפלה של מקרומולקולות. נדרש ציוד Sonication. האטה איטית יכולה להימשך יותר מ-24 שעות. | הכנות קיר תא שמרים. | |
| תהליך הרתיחה והקפאת ההפשרה | אין צורך בציוד מיוחד מלבד מקפיא סטנדרטי ובלוק חימום או אמבט מים חמים. | יעיל, ניתן לשחזור, פשוט ולא יקר. | יצירת חום מובילה לפירוק והשפלה של מקרומולקולות. | ניתוחי די.אן.איי על ידי פי.סי.איי. | 5 |
טבלה 1: השוואת שיטות זמינות להכנת תמציות שמרים.
Cryogrinding (aka טחינה cryogenic / כרסום cryogenic) מועסק בדרך כלל כדי לאחזר חומצות גרעין, חלבונים או כימיקלים מדגימות רגישות לטמפרטורה באופן אמין לניתוחים כמותיים או איכותיים. הוא שימש בהצלחה עבור יישומים מרובים בתחומים מגוונים כולל ביוטכנולוגיה, טוקסיקולוגיה,מדע זיהוי פלילי 12,13, מדעי הסביבה, ביולוגיה צמח14 ומדעי המזון. בידוד של מקרומולקולות ביולוגיות שלמות תלוי בדרך כלל באופן קריטי בטמפרטורה. טמפרטורות נמוכות מאוד להבטיח כי proteases ו nucleases להישאר פעיל, וכתוצאה מכך בידוד אמין של חלבונים שלמים, חומצות גרעין ומקרומולקולות אחרות לניתוחים הבאים. אכן, טחנת מקפיא בדרך כלל שומרת על טמפרטורת מדגם של -196 °C (נקודת הרתיחה של LN2),ובכך למזער DNA / RNA או ירידה בחלבון והשפלה.
טחנת המקפיא משתמשת בתא שחיקה אלקטרומגנטי שמזיז במהירות מוט מתכת מוצק או גליל הלוך ושוב בתוך בקבוקון המכיל את הדגימה כדי להיות מרוסק בין אטמי קצה נירוסטה. המכשיר יוצר והופך במהירות שדה מגנטי בתוך תא הטחינה. כאשר השדה המגנטי נע הלוך ושוב, המגנט מוחץ את הדגימה כנגד התקעים ובכך משיג את ה"קריוגרינדינג" ואת הריסת הפופקורן. טחנת המקפיא מחליפה את המרגמה והעלי ומאפשרת עיבוד רציפה של דגימות מרובות (או עד 4 דגימות קטנות יותר בו-זמנית) עם יכולת רבייה גבוהה ומומנעת את השונות של המשתמש למשתמש הקשורה לטחינה ידנית. לאחר עיבוד הדגימות, ניתן להשתמש בתמציות התא עבור מגוון יישומים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פופקורן שמרים
- לגדל תאי שמרים ב 0.5 L של מדיה YPD לצפיפות של 1 x 107 תאים / מ"ל. ספירת תאים באמצעות מונה קולטר או בכל אמצעי אחר.
- תאי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב- 2,400 גרם ו- 4°C.
- לשטוף כל דגימה פעם אחת עם 500 מ"ל של מים 18 מגה אום מילי-קיו.
- כדורי תפנס ב-15 מ"ל של מאגר ליסיס קר כקרח [20 מ"מ HEPES-KOH pH 7.5, 110 מ"מ KCl, 0.1% טווין, 10% גליסרול, עם סוכן הפחתת נוסף טרי 10 מ"מ β-mercaptoethanol, קוקטייל מעכב פרוטאז, 10 מעכב פרוטאזום μM MG-132, 1 mM מעכב deacetylase נתרן butyrate ומעכבי פוספטאז (1 mM נתרן ונדאט, 50 mM נתרן פלואוריד, 50 m נתרן β-גליצרופוספט)]. לקבלת פרטים נוספים, עיין בטבלת החומרים. שמור תאים מחדש על קרח עד שהדגימות יהיו מוכנות לשלב הבא.
הערה: ניתן להשתמש במגוון רחב של מאגרי ליזה המכילים מספר חומרי ניקוי שאינם יוניים עם הדגימות ומעכבים ספציפיים הכלולים בו בהתבסס על יישום במורד הזרם. הכללה של מעכבי פרוטאז ופרוטאסומאל הם קריטיים למניעת השפלה של חלבון, במיוחד לאחר תמציות מופשרים. - להפוך פופקורן שמרים קפואים הצמד על ידי הוספת מתלה התא לאט טיפה אחת בכל פעם באמצעות פיפטה סרולוגית צונן מראש לתוך אחד או יותר 50 מ"ל צנטריפוגות צינורות נשמר על קרח יבש מלא IN2 עד ממש מתחת למסגרת. למעלה חנקן נוזלי בצינור לעתים קרובות כדי לפצות על אובדנו עקב אידוי מהיר. לעבוד באזור מאוורר היטב כדי למנוע את הסכנות הקשורות לחנק חנקן.
- במקום צינור 50 מ"ל, להשתמש מספר צינורות 50 מ"ל קשורים יחד (או כל מיכל עם פה גדול, כגון בקבוק צנטריפוגה פלסטיק גדול שיכול לסבול טמפרטורות קריוגנית) להכנתפופ-תירס (איור 1A). ככל שהמכל גדול יותר ופתחו, כך קל יותר להתכונן הפופקורן, כי זה מונע גיה"ש של הפופקורן כדי ליצור אגרגטים גדולים. טווח גודל של 0.3-0.5 ס"מ עבור הפופקורן הוא אידיאלי להשגת שחיקה נכונה / pulverization באמצעות טחנת המקפיא(איור 1B).
- ודא כי LN2 התאדה לחלוטין מן הצינורות המכילים את הפופקורן לפני אחסון אותם ב -80 °C. ניתן להפסיק לאחר הכנת פופקורן שמרים כפי שהם יציבים במשך כמה שנים כאשר מתוחזקים ב -80 ° C.
איור 1:הכנת פופקורן שמרים. (א) שמרים "פופקורן" נעשה על ידי הקפאה dropwise של מתלה התא ב LN2. אנו משתמשים בצינורות 50 מ"ל המוחזקים יחד עם גומייה ומונחים בדלי קרח מלא בקרח יבש. הצינורות מלאים ב LN2 עד ממש מתחת למסגרת שלהם הם עטופים חנקן נוזלי לעתים קרובות כדי לשמור אותם כמעט מלא עד כל מתלי התא נעשה פופקורן(ב) הגודל של הפופקורן הוא קובע חשוב של יעילות שחיקה אופטימלית. טווח הגודל של הפופקורן צריך להיות בקוטר של בין 0.3 ל-0.5 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
2. קריוגרינדינג
- כדי להתחיל, ודא שיש מספיק LN2 זמין כדי לצנן את טחנת המקפיא, לטחון בקבוקונים, אספקה ולהפעיל את המכונה עבור כל הדגימות. עבור פחות מחמש דגימות, 30-35 L של LN2 אמור להספיק. מלאו את תא טחנת המקפיאב-LN 2 עד לקו המילוי.
אזהרה: כל הצעדים הכרוכים LN2 צריך להתבצע באזור מאוורר היטב ואת טחנת המקפיא עצמה צריך להיות ממוקם באזור כזה כדי למנוע סיכון של חנק. ללבוש ציוד מגן אישי כולל הנעלה נכונה, חלוק מעבדה, משקפי בטיחות, שכבת בסיס של כפפות ניטריל, אז כפפות תרמיות, ואחריו זוג נוסף של כפפות ניטריל. נקוט זהירות רבה בעת טיפול ב- LN2. - סגור את מכסה טחנת המקפיא לאט, הימנעות התזה של LN2 ולאפשר כמה דקות עבור המכשיר להתקרר. ייתכן שיהיה צורך למלא את התא עם LN2 כדי לפצות על ההפסד עקב אידוי לפני שתמשיך לשלב הבא.
הערה: מלא מחדש LN2 לפי הצורך רק עד לקו המילוי. אל תחפו את התא, כי זה יכול להיות גם מסוכן וגם מזיק למכונה. מערכות מילוי אוטומטיות זמינות עבור טחנת מקפיא שיכולה לחדש את ה-LN2 התאדה כצורך ישירות ממכל אחסון המחובר לטחנת המקפיא. - טרום לצנן את בקבוקונים שחיקה גדולים ואת בר impactor מגנטי על ידי הטבעתם ב LN2 נשמר dewar קטן נפרד. תשמיד את כל ה-LN2 כאשר ה-LN2 יפסיק לבעבע. לאחר מכן מוסיפים את הפופקורן לדוגמה/שמרים למבחנה השוחקת ולאטום אותו בחוזקה עם שני תקעי קצה נירוסטה.
- אין למלא יותר משליש ממבחנה הטחינה עם המדגם כפי שיכול להפחית את היעילות של שחיקה. במקום זאת, ניתן לעבד דגימות גדולות יותר על-ידי חלוקתן לשני בקבוקונים או יותר וטחינתן באופן רציף. בקבוקונים שחיקה קטנים יותר יכול לשמש עבור דגימות קטנות יותר (עד 3 מ"ל).
- מניחים את בקבוקון הטחינה בתא טחנת המקפיא ונעלו אותה במקומה. סגור את המכסה.
- עבור שמרים ניצנים, לטחון את הדגימות עבור סך של שלושה מחזורים עבור 2 דקות / מחזור (עם 2 דקות הפסקה לקירור בין מחזורים) בקצב ריסוק של 14. כאשר המכשיר מפסיק לאחר השלמת המחזורים, לפתוח את מכסה טחנת המקפיא לאט ובזהירות לפתוח את הבקבוקון עם התא הקפוא אבקה lysate ולהסיר אותו מטחנת המקפיא. אם נעשה שימוש בקבוקונים קטנים מרובים, עבוד במהירות כדי להסיר בקבוקון אחד בכל פעם ולמקם אותם בקרח יבש.
הערה: בדרך כלל אין צורך להתאים את פרמטרי הטחינה בעת שימוש בקבוקונים בגדלים שונים עם אותו סוג של מדגם. עם זאת, הפרמטרים שחיקה כגון מספר המחזורים וקצב שחיקה צריך להיות נקבע אמפירי עבור סוגי מדגם שונים, בהתאם לקלות שבה הם lyse. רוב התאים היונקים והרקמות הרכות יתכוונו ב-1-2 מחזורים בקצב ריסוק של 10. קשה יותר לריס דגימות כגון חיידקים, שמרים, זחלי זבובים וזבובי פירות בוגרים דורשים 3-6 מחזורים בקצב המרבי, בעוד רקמות קשות כגון עצם, שיניים, וכו 'עשוי לדרוש עד 10 מחזורים. aliquot קטן של מדגם הפשרה ניתן לראות תחת המיקרוסקופ לפני ואחרי שחיקה לספור את מספר שלמים, תאים unlysed כדי לקבוע את יעילות lysis. ניתוח מצוין של ההשפעה של פרמטרים cryogrinding על שחרור חלבונים ו-DNA שמרים ניצנים פורסם בעבר15. - עובד במהירות כדי לא לאפשר את המדגם להפשיר, בזהירות לפתוח את אחד החלקים הסופיים (לבחור את אחד שנראה להיות רופף במקצת במהלך השחיקה) באמצעות כלי הפתיחה. לאחר מכן, השתמשו בזוג מפסים ארוכים (שמצוננים מראש בדלי עם קרח יבש) כדי להסיר את סרגל המשפיעים. לאסוף את הדגימה מרוסקת על ידי היפוך והקשה על בקבוקון שחיקה על צלחת פוליסטירן במשקל מקורר מראש עם LN2 ונותר על קרח יבש.
- לאחר שכל התא הקפוא אבקת lysate כבר התאושש בקבוקון שחיקה, לשפוך את אבקת lysate מן הצלחת שקילה בחזרה לתוך צינור 50 מ"ל ולהמשיך מיד לשלב הפשרה האיטי המתואר הבא לקבלת התוצאות הטובות ביותר. לחלופין, יש לאחסן את האבקה הקפואה הלת-מקפיאה למשך הלילה ב-80 מעלות צלזיוס, אם כי הדבר עלול לגרום להשפלה מסוימת.
- מכינים דלי קרח עם 50% של קרח ומים ומים ומניחים אותו על צלחת ערבוב עם ערבוב מגנטי. לשקוע מתלה תיל או מתלה מתאים אחר בהבלל קרח להחזיק את הדגימות.
- לאחר מכן, להפשיר לאט את הדגימות על אמבט slurry קרח עם תסיסה מתמדת של slurry באמצעות ערבוב מגנטי. הוסף קרח נוסף כדי להחליף את הקרח הנמס (ייתכן שיהיה צורך להשליך מים מסוימים כדי למנוע את הצפת דלי הקרח). מאז כמה מעכבים יש מחצית חיים קצרים במאגרים מים, להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז נוסף (ראה טבלת חומרים)ו 10 מעכב פרוטאזום μM MG-132 כדי lysate ברגע הדגימות להתחיל להפשיר (לאחר כ 30 דקות).
- הסר קרח שנוצר מחוץ לצינורות כל 5 דקות כדי לזרז את תהליך ההפשרה. שים לב כי הפשרה מהירה של הדגימות בטמפרטורת החדר ומעלה עלולה להוביל לירידה משמעותית.
- לאחר הדגימות הפשירו לחלוטין (זה עשוי לקחת הרבה יותר משעה בהתאם לכמות המדגם), צנטריפוגה lysate ב ~ 3,220 גרם במשך 20 דקות צנטריפוגה שולחן קירור ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את החלק הארי של פסולת התא מן lysate.
- מעבירים את הסופרנט ל-50 מ"ל צינורות צנטריפוגות פוליקרבונט שצינן מראש על קרח וצנטריפוגות הדגימות ב-16,000 גרם למשך 20 דקות ב-4°C (ראה טבלת חומרים).
- מעבירים רק את הסופרנט הברור המורכב מתמצית התא כולו המובהרת ממרכז העמודה הנוזלית בצינור לאט ובזהירות רבה, מבלי להפריע לשכבת הליפידיםהמעורפלת (איור 2), לצינורמקורר של 15 מ"ל באמצעות פיפטות סרולוגיות צוננות מראש. הימנע מהסרת כל lysate בצינור הצנטריפוגה כדי למנוע נשיאה של שומנים ופסולת. שאריות lysate בצינור צנטריפוגה ניתן צנטריפוגה מספר פעמים כדי לשחזר כמויות קטנות של תמצית לאחר כל סיבוב.
הערה: שומנים יחד עם כל חלבונים denatured יופיע מעונן / חלבי ממוקמים בראש ממשק נוזלי / אוויר, ומדי פעם מעל הגלולה עצמה המורכב פסולת תאית מסיסה(איור 2).
איור 2: לחלץ שכבות בצינור צנטריפוגה. התכונות הגלויות העיקריות של תמצית התא כולו בצינור בעקבות צנטריפוגציה ב 16,000 גרם עבור 20 דקות מצוינים. השפע היחסי של כל תכונה תלוי בסוג המדגם, שלב הצמיחה של התאים (מעריכי לעומת נייח), כמות מאגר הליזה המשמש לשימוש חוזר בתאים ויעילות הליזה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
- צנטריפוגה כל ליאז הנותרים במשך 5 דקות כדי לשחזר יותר של התמצית. חזור על זה 5 דקות צנטריפוגציה מספר פעמים במידת הצורך כדי לשחזר כמה שיותר תמצית ברורה ככל האפשר. השליכו את הליזיט מעונן המכיל שומנים קרוב לתחתית הצינור ליד הגלולה.
- השתמש בתמציות אלה עבור יישומים במורד הזרם כגון טיהור מורכב חלבון, פירוק מערכת החיסון וניתוח פרוטאומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השווינו שתי שיטות שונות לליזיס תאי שמרים, כל כך כרסום חרוזי זכוכית ב-4°C ושיטת קריוגרינה אוטומטית ב-196°C, כדי להעריך את חלבוני ההחלמה היחסית בתמציות התא שהוכנו בשתי השיטות. עבור מחקר זה, בחרנו להשתמש בזן שמרים ניצנים YAG 1177 (MAT lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Υ 200 trp1-1[am] ubi1-1::TRP1 ubi2-Υ2::ura3 ubi3-ura3-ubi3-ura316 נושאת פלסמיד בעל עותק גבוה המבטא טנדם HIS-MYC מתויג Ubiquitin (HIS-MYC-Ub) כדי שנוכל להעריך את היעילות של שחזור של חלבונים מתויגים בכל מקום מתמציות בעקבות טיהור הזיקה.
בדקנו פרוטוקול מהיר המשתמש כרסום חרוז זכוכית כדי לריס שמריםתאים 9 ב 4 ° C ואת שיטת cryogrinding באמצעות תאי שמרים קפואים (פופקורן שמרים) וטחינתם LN2 במפעל מקפיא. אנו מדווחים על הבדל ברור עם שתי שיטות הכנת תמצית.
באיור 3א אנו מדגימים כי אנו יכולים להשיג תשואה מלאה יותר של חלבון מתמציות תאים שלמים (WCE) שהוכנו באמצעות שחיקה מקפיא כפי שנקבע על ידי Ponceau S כתם לאחר טעינת כמויות שוות ערך של WCE מוכן מאותו מספר תאים באמצעות שתי שיטות הכנת לחלץ שונות. יתר על כן, איור 3B מראה התאוששות גבוהה יותר של חלבונים HIS-MYC מתויג בכל מקום לאחר למשוך למטה באמצעות חרוזי טאלון מ WCE מוכן על ידי cryogrinding, בהשוואה WCE מוכן באמצעות מקף חרוז, למרות שימוש בתמציות שהוכנו מאותו מספר תאים בשני המקרים.
איור 3: Cryogrinding מוביל לתפוקות חלבון כוללות גבוהות יותר בתמציות תאים ושחזור טוב יותר של חלבונים מתויגים לאחר משיכה של חלבונים מתמציות אלה. (א) תמציות תאים שלמים (WCE) הוכנו כמתואר בפרוטוקול זה עבור cryogrinding או כפי שתואר בעבר עבור שיטת כרסום חרוז. 9 500 מ"ל של זן שמרים נושא HIS-MYC-Ub גדל לצפיפות של 107 תאים / מ"ל. לאחר מכן 250 מ"ל של התרבות שימש במקביל להכנת תמציות על ידי כל שיטה. כמויות שוות ערך של WCE הוכנו מאותו מספר תאים באמצעות שתי השיטות השונות. החלבונים מתויגים שלו נשלפו לאחר מכן באמצעות חרוזי Talon (IP) מאותה כמות של כל תמצית. לבסוף, חלבונים מטוהרים זיקה אלה הושוו על ידי פתרון אותם על ג'ל polyacrylamide denaturing והעברה לקרום nitrocellulose ואחריו הכתמה עם Ponceau S. שים לב הכתמים חזקים יותר ברחבי הנתיב המכיל WCE מוכן באמצעות שיטת שחיקה מקפיא. (ב) קרום הניטרוצלולוז המוכתם Ponceau S המוצג (א) היה מעובד לאחר מכן עבור כתמים מערביים באמצעות נוגדני תג HIS כדי להשוות את הכמויות של חלבונים מתויגים HIS-Ub משך למטה מכמויות שוות של תמצית שהוכן על ידי שתי השיטות. מספר להקות היו מיוצגות יתר על המידה בנסיגה באמצעות WCE שהוכן על ידי cryogrinding (המצוין על ידי החצים האדומים), בעוד הלהקות המתאימות בנסיגה באמצעות WCE שהוכן על ידי מכות חרוזים היו גם חלשים באופן משמעותי בעוצמה, או בלתי ניתנים לגילוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
בסך הכל, התוצאות המייצגות מראות כי קריוגרינה של פופקורן שמרים מובילה לתפוקות גבוהות יותר ובידוד חלבון מעולה המבוסס על רצועות חלבון מוכתמות Ponceau S חזק יותר ב WCE מוכן על ידי cryogrinding (איור 3A). זאת, ככל הנראה בשל פירוק יעיל יותר והשפלה מוגבלת של חלבון בתמצית שהוכנה על ידי קריוגנית, כפי שמעיד הנוכחות של להקות חזקות יותר בנתיב הכתמים המערבי המציגים חלבונים מתויגים של HIS שנשלפו (IP) מתמצית ההקפאה(איור 3B). בעוד פרוטוקול כרסום חרוז זכוכית הוא מהיר יותר ופחות עבודה אינטנסיבית, זה לא יכול להיות מתאים חלבונים רגישים לטמפרטורה או מאוד לא יציב. כמו כן, אנו מוצאים כי הבידוד של שינויים לאחר התרגום כגון חלבונים polyubiquitinated הוא יעיל יותר עם פרוטוקול cryogrinding16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מגבלה של לימוד חלבונים מקומיים שמרים היא התסיסה הלא יעילה של תאי שמרים בשל קיר התא הקשה שלהם. למרות שפותחו מספר שיטות, השיטה העקבית והיעילה ביותר בידיים שלנו היא cryogrinding של תאי שמרים פלאש קפוא כמו פופקורן. שיטה זו מאפשרת הכנה אמינה של תמציות תאים שלמים באיכות גבוהה שמרים ניצנים בהשוואה לשיטות ליזיס אחרות. התוצאות המייצגות הראו כי קריוגרינדה עדיפה על שיטה מכנית פופולרית לליזיס שמרים המעסיקה כרסום חרוזים ב-4°C (איור 3A ו-3B). Cryogrinding ביעילות lysses תאי שמרים בעוד הדגימות מעובדות בטמפרטורה של -196 °C באמבט LN2, ולכן שמירה על שלמות החלבון על ידי הגבלת חום המושרה חלבון denaturation והשפלה המתרחשת עם שיטות רבות אחרות של הכנת תמצית. זה מאפשר ניתוח של מקרומולקולות מאוד labile בדגימות ומאפשר טיהור של מתחמי חלבון פונקציונליים. יתר על כן, השימוש במפעל המקפיא מחליף גם את הטחינה הידנית המסורתית עתירת העבודה של פופקורן שמרים עם מרגמה, ומאפשר עיבוד מדגם מהיר ויעיל יותר. לבסוף, ההישג של תאי שמרים ללא שימוש באנזימים יקרים מספק חיסכון משמעותי בטווח הארוך.
החסרונות העיקריים של טחנת מקפיא היא העלות מראש הכרוכה ברכישת הציוד, כמו גם עלויות תחזוקה ותפעול מינימליות (כלומר, כמויות גדולות של חנקן נוזלי) מעורב. זה גם דורש טיפול זהיר של LN2 מסוכן פוטנציאלית הן להכנת פופקורן שמרים ואת צעדי cryogrinding. יש לעבד דגימות גדולות יותר בנפרד, מה שעשוי להגיע לזמן רב אם יש לעבד דגימות מרובות. בנוסף, בעת עיבוד דגימות מרובות, בקבוקונים שחיקה, כמוסות ופסים impactor חייב להיות שטף כראוי ונמחה נקי לפני שימוש חוזר (לחלופין, כמה קבוצות של אביזרים רזרביים יש לשמור).
הפרוטוקול שהוכח כאן הוא בעל ערך להכנת דגימות חלבון שמרים לטיהור זיקה לחלבון, מחקרי פירוק חיסוני, הכנת מדגם לכתמים מערביים עבור חלבונים labile או השינויים שלהם, או לניתוחים פרוטאומיים16,19. בנוסף, cryogrinding של פופקורן שמרים יכול לשמש גם עבור DNA גנומיגנובה 13,20,21 אוRNA22,23 בידוד תוך מזעור פעילות גרעין, ובכך להבטיח שימור מדגם24. שיטה רב-תכליתית זו יכולה לשמש כמו ברוב המיקרואורגניזמיםכגון חיידקים 21,22 ושמרים 15, ותופשר להתאים במהירות לתאים יונקים, שתי צמח25 ובעליחיים 26 טישו, מוצרי מזון27,דגימות ימיות 21,28 כוללאלמוגים 23,דגימות זיהוי פלילי 20 כוללשיער 29 ואפילו מאובנים 30, כמו גם שרידים של צורות חיים נכחדוקפואים קפואים קפואים 31.
לסיכום, קריוג'רינדר במפעל מקפיא היא שיטה יעילה לחלבון ובידוד מקרומולקולה אחר ממגוון דגימות הנגזרות ממקורות שונים עבור יישומים ביוכימיים רבים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר במעבדת Gunjan נתמך על ידי מימון של המכונים הלאומיים לבריאות, הקרן הלאומית למדע ומשרד הבריאות של פלורידה. אנו מודים לסטודנט לתואר ראשון ג'ון פרקר על הסיוע הטכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
References
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
- Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
- Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
- Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
- Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).
- Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
- Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
- Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
- Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).
- Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
- Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
- Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
- Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).
- Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).
- Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
- Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
- Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
- Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
- da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
- Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
- Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
- Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).
