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Biology

एक स्वचालित फ्रीजर मिल में क्रायोग्रिंडिंग द्वारा सेल अर्क की तैयारी

Published: January 29, 2021 doi: 10.3791/61164
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम एक क्रायोजेनिक फ्रीजर मिल का उपयोग करके खमीर या अन्य कोशिकाओं से पूरे सेल अर्क की तैयारी के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं जो प्रोटीन के क्षरण और विकृति को कम करता है। सेल अर्क कार्यात्मक प्रोटीन परिसरों, प्रोटेओमिक विश्लेषण, सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययन और लैबिल प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने के शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

आनुवंशिक हेरफेर की आसानी और नवोदित खमीर सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में यूकेरियोटिक सेलुलर मशीनरी के मजबूत विकासवादी संरक्षण ने इसे एक पूर्व प्रख्यात आनुवंशिक मॉडल जीव बना दिया है। हालांकि, चूंकि कुशल प्रोटीन अलगाव कोशिकाओं के इष्टतम व्यवधान पर निर्भर करता है, इसलिए सेलुलर प्रोटीन के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए खमीर का उपयोग इसकी सेल दीवार से बाधित होता है जो एंजाइमेटिक रूप से पचाने के लिए महंगा होता है (लिटिकेस या ज़िमोलीज़ का उपयोग करके), और यांत्रिक रूप से बाधित करना मुश्किल (पारंपरिक बीड बीटर, एक फ्रांसीसी प्रेस या कॉफी ग्राइंडर का उपयोग करना) नमूनों के हीटिंग के कारण बिना, जो बदले में प्रोटीन डिजन्चर और गिरावट का कारण बनता है। हालांकि तरल नाइट्रोजन (एलएन2)के तहत खमीर कोशिकाओं के मैनुअल पीसने एक मोर्टार और मूसल का उपयोग कर नमूनों के ओवरहीटिंग से बचा जाता है, यह श्रम गहन है और ऑपरेटरों के बीच सेल लाइसिस में परिवर्तनशीलता के अधीन है । कई वर्षों के लिए, हम सफलतापूर्वक एक स्वचालित फ्रीजर मिल में कोशिकाओं के cryogrinding का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता खमीर अर्क तैयार किया गया है । एलएन2 के उपयोग के साथ हासिल -196 डिग्री सेल्सियस का तापमान जैविक सामग्री को प्रोटीज और न्यूक्लियस द्वारा गिरावट से बचाता है, जिससे बरकरार प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अन्य मैक्रोमॉलिक्यूल्स की प्राप्ति होती है। यहां हम नवोदित खमीर कोशिकाओं के लिए विस्तार से इस तकनीक का वर्णन करते हैं जिसमें पहले एलएन2 में अपनी ड्रॉपवाइज अतिरिक्त के माध्यम से लाइसिस बफर में कोशिकाओं के निलंबन को ठंडा करना शामिल है ताकि "पॉपकॉर्न" के रूप में जानी जाने वाली कोशिकाओं की जमे हुए बूंदों को उत्पन्न किया जा सके। इस पॉपकॉर्न तो एक फ्रीजर मिल में एलएन 2 के तहत pulverized है एक जमेहुए "पाउडर" निकालने जो धीरे से गल गया है और अघुलनशील मलबे को दूर करने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा स्पष्ट उत्पन्न करते हैं । परिणामस्वरूप अर्क डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं, जैसे प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण, प्रोटेओमिक विश्लेषण, या सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययन। यह तकनीक विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों, पौधों और पशु ऊतकों, कोरल सहित समुद्री नमूनों के साथ-साथ फोरेंसिक और पर्माफ्रॉस्ट जीवाश्म नमूनों से डीएनए/आरएनए को अलग-थलग करने से सेल निकालने की तैयारी के लिए व्यापक रूप से लागू होती है ।

Introduction

खमीर प्रोटीन अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव है, क्योंकि यह एक सरल यूकेरियोटिक जीव है जिसमें शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध आनुवंशिक और जैव रासायनिक उपकरणों की बहुतायत है1। उनकी मजबूत कोशिका दीवार के कारण, शोधकर्ताओं का सामना करने वाली एक चुनौती सेलुलर सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक lysing में है । खमीर कोशिकाओं के व्यवधान के माध्यम से प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीके उपलब्ध हैं जिनमें एंजाइमेटिक लाइसिस (zymolyase)2,3,रासायनिक लाइसिस4,फ्रीज-गलद्वाराशारीरिक रूप से लाइसिस, दबाव आधारित (फ्रेंच प्रेस)6,7,मैकेनिकल (ग्लास मोतियों, कॉफी ग्राइंडर)8,9,सोनीशन आधारित10 औरक्रायोजेनिक2,11शामिल हैं। नियोजित तकनीक के आधार पर सेल लाइसिस और प्रोटीन यील्ड की दक्षता काफी भिन्न हो सकती है, इस प्रकार लाइसेट के लिए वांछित डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए अंतिम परिणाम या उपयुक्तता को प्रभावित करती है। अस्थिर प्रोटीन का अध्ययन करते समय, क्षणभंगुर पोस्टट्रानलेशनल संशोधन होते हैं, या तापमान संवेदनशील होते हैं, विशेष रूप से एक विधि का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो तैयारी के दौरान नमूना हानि या गिरावट को कम करेगा।

तैयारी तकनीक निकालें विवरण लाभ नुकसान डाउनस्ट्रीम विश्लेषण हवाला
फ्रेंच प्रेस: ज़िमोलिज़ का उपयोग करके एंजाइमेटिक प्रीट्रीटमेंट के साथ उच्च दबाव वाले समरूप (उर्फ माइक्रोफ्लुइडाइजर) Zymolyase-20T, एक माइक्रोफ्लुइडाइजर उच्च दबाव समरूप। बाधित एक हवा संचालित, उच्च दबाव पंप (अनुपात 1:250; आवश्यक हवा दबाव 0.6-एल MPa) और एक अतिरिक्त वापस दबाव इकाई के साथ एक विशेष व्यवधान कक्ष के होते हैं । प्रसंस्करण के लिए 20 एमएल का न्यूनतम नमूना आकार आवश्यक है। संयुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त अंतिम कुल व्यवधान 95 एमपीए के दबाव में 4 पास के साथ 100% से संपर्क किया, जबकि 95 एमपीए पर 4 पास के साथ केवल 32% व्यवधान की तुलना में ज़ाइमोलिज के बिना केवल समरूपता का उपयोग किया गया। छोटे पैमाने पर आवेदनों के लिए उपयुक्त नहीं है। एंजाइम बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए महंगे हो सकते हैं। प्रोटीन शुद्धि 6
मनका डिब्बा: Zymolyase इलाज कोशिकाओं को एक fastprep साधन में कांच के मोतियों के साथ lysed मोटे तौर पर ठंड, सूखी, एसिड से धोया 0.5 मिमी कांच मोती की एक समान मात्रा लाइसिस बफर में सेल गोली की एक दी गई मात्रा में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को जोरदार मैनुअल आंदोलन द्वारा बाधित कर रहे हैं। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब प्रोटीन शुद्धिकरण के बजाय परख प्रयोजनों के लिए कई अलग अलग छोटे खमीर संस्कृतियों से अर्क बनाने । ग्लास मनका प्रक्रिया के दौरान, प्रोटीन का कठोरता से इलाज किया जाता है जिससे व्यापक फोमिंग होती है जिससे प्रोटीन डेनैचुरेशन होता है। सेल टूटना की मात्रा भिन्न होती है, जबकि प्रोटियोलिसिस के साथ-साथ प्रोटीन के संशोधन के परिणामस्वरूप यांत्रिक टूटना के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के अर्क को गर्म किया जा सकता है। ज्यादातर डीएनए और आरएनए विश्लेषण करता है, लेकिन पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ या उसके बिना जेल इलेक्ट्रोफेओरेसिस को विकृत करके प्रोटीन विश्लेषण भी करता है। 8
Zymolyase उपचार के बाद लाइसिस द्वारा ओस्मोटिक शॉक और Dounce समरूपता के संयोजन का उपयोग कर कोशिका दीवारों के एंजाइमेटिक पाचन के बाद, एक डोनेस होमोजेनाइजर में एक तंग फिटिंग मूसल (निकासी 1 से 3 माइक्रोन) के 15 से 20 स्ट्रोक के साथ गोलाकारों को lysed किया जाता है। BJ926 या EJ101 जैसे प्रोटीज़-कमी वाले उपभेदों का उपयोग करने के लिए लाभप्रद। यह खमीर कोशिकाओं को तोड़ने का सबसे सज्जन तरीका है और इसलिए यह उन अर्कों को तैयार करने के लिए सबसे उपयुक्त है जो जटिल एंजाइमेटिक कार्यों (जैसे, अनुवाद, प्रतिलेखन, डीएनए प्रतिकृति) को पूरा कर सकते हैं और जिसमें मैक्रोमॉलिकुलर संरचनाओं (जैसे, राइबोसोम्स, स्प्लिससोम) की अखंडता को बनाए रखा जाना चाहिए। यह अक्षुण्ण नाभिक को अलग करने के लिए भी उपयोगी है जिसका उपयोग क्रोमेटिन अध्ययन (ब्लूम एंड कार्बन, 1 9 82) या परमाणु प्रोटीन अर्क (ल्यू और कोर्नबर्ग, 1 9 87) के लिए किया जा सकता है। स्पेरोप्लास्ट लाइसिस प्रक्रिया के प्रमुख नुकसान यह हैं कि यह अपेक्षाकृत थकाऊ और महंगा है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर तैयारी (>10 लीटर) के लिए, और लंबे समय तक इनक्यूबेशन अवधि प्रोटियोलिसिस या प्रोटीन संशोधन का कारण बन सकती है।  क्रोमेटिन की तैयारी के लिए, वे अंतर अपकेंद्रित्र (न्यूकोसोम सीढ़ी अखंडता के आधार पर) द्वारा उत्पादित लोगों की तुलना में अलग या कम गुणवत्ता के प्रतीत होते हैं। क्रोमेटिन अध्ययन के लिए अक्षुण्ण नाभिक को अलग करना, ऐसे अर्क जो जटिल एंजाइमैटिक कार्यों को पूरा कर सकते हैं, अर्क की अखंडता की आवश्यकता होती है
मैक्रोमॉलिकुलर संरचनाएं, परमाणु प्रोटीन अर्क।		 2
मोर्टार/मूसल या ब्लेंडर का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन में पीसकर फ्लैश फ्रोजन कोशिकाओं का सेल व्यवधान कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में तुरंत जमे हुए हैं और फिर मूसल का उपयोग करके मोर्टार में मैन्युअल रूप से पीसकर, या तरल नाइट्रोजन की उपस्थिति में वारिंग ब्लेंडर का उपयोग करके lysed किया जाता है। प्रोटोकॉल त्वरित और आसान है। यह बहुत बड़ी संस्कृतियों सहित खमीर कोशिकाओं की अलग-अलग मात्रा को समायोजित कर सकता है। इसका मुख्य लाभ यह है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से बढ़ते राज्य से तरल नाइट्रोजन (−196 डिग्री सेल्सियस) में तुरंत लिया जाता है, जो प्रोटीज और नाभिक जैसी डिग्रेडिव एंजाइम गतिविधियों को कम करता है और साथ ही प्रोटीन (जैसे, फॉस्फेट और किनेस) को संशोधित करने वाली गतिविधियों को कम करता है। यह विशेष रूप से बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए एक खमीर संस्कृति से पूरे सेल अर्क बनाने के लिए अनुकूल है। थोड़ा गन्दा और लापरवाह अन्वेषक के लिए संभावित रूप से खतरनाक। छोटे नमूने (यानी, 10 से 100 मिलीलीटर खमीर संस्कृतियों) आसानी से संसाधित नहीं किए जाते हैं क्योंकि ब्लेंडर में प्रभावी रूप से फ्रैक्चर करने के लिए जमे हुए सेल झुरमुटों का पर्याप्त द्रव्यमान नहीं होता है। यह व्यक्तिगत नमूनों को संसाधित करने और उपयोगों के बीच उपकरणों को साफ करने के लिए समय लेने वाली है। बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए एक खमीर संस्कृति से पूरे सेल अर्क। 2
ऑटोलिसिस, मनका मिल पीएच 5.0, 50 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे, 200 आरपीएम / Ø 0.5 मिमी, 5 × 3 मिनट/3 मिनट विशेष रूप से छोटे पैमाने पर निकालने की तैयारी के लिए त्वरित और कुशल लाइसिस गर्मी पैदा करने से मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विकृति और क्षरण होता है। मनका पिटाई उपकरण की आवश्यकता है। छोटे पैमाने पर विश्लेषण। 10
ऑटोलिसिस, सोनिकेशन पीएच 5.0, 50 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे, 200 आरपीएम, 4 × 5 मिनट/2 मिनट, दाल 80%, बिजली 80% सोनीशन उपकरण आमतौर पर अधिकांश संस्थानों में उपलब्ध है। गर्मी पैदा करने से मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विकृति और क्षरण होता है। सोनीशन उपकरण की आवश्यकता है। स्लो लाइसिस में 24 घंटे से ज्यादा का समय लग सकता है। खमीर सेल दीवार की तैयारी।
उबलते और फ्रीज-गल प्रक्रिया कोई विशेष उपकरण एक मानक फ्रीजर और एक हीटिंग ब्लॉक या गर्म पानी स्नान के अलावा अंय की जरूरत है । कुशल, प्रजनन योग्य, सरल और सस्ती। गर्मी पैदा करने से मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विकृति और क्षरण होता है। पीसीआर द्वारा डीएनए विश्लेषण। 5

तालिका 1: खमीर अर्क की तैयारी के लिए उपलब्ध तरीकों की तुलना।

क्रायोग्रिन्डिंग (उर्फ क्रायोजेनिक पीस/क्रायोजेनिक मिलिंग) आमतौर पर मात्रात्मक या गुणात्मक विश्लेषण के लिए विश्वसनीय तरीके से तापमान संवेदनशील नमूनों से न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन या रसायनों को पुनः प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जाता है । इसका उपयोग जैव प्रौद्योगिकी, विष विज्ञान, फोरेंसिक विज्ञान12, 13,पर्यावरण विज्ञान, पादप जीव विज्ञान14 और खाद्य विज्ञान सहित विविध क्षेत्रों में कई अनुप्रयोगों के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। अक्षुण्ण जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स का अलगाव आमतौर पर तापमान पर गंभीर रूप से निर्भर करता है। बेहद कम तापमान यह सुनिश्चित करते हैं कि प्रोटीज और न्यूक्लियस निष्क्रिय रहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बाद के विश्लेषणों के लिए बरकरार प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अन्य मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विश्वसनीय अलगाव होता है। दरअसल, एक फ्रीजर मिल आम तौर पर -196 डिग्री सेल्सियस (एलएन2के उबलते बिंदु) के एक नमूना तापमान रखता है, इस प्रकार डीएनए/आरएनए या प्रोटीन विकृति और गिरावट को कम करने ।

फ्रीजर मिल एक विद्युत चुम्बकीय पीसने वाले कक्ष को नियोजित करती है जो तेजी से एक ठोस धातु बार या सिलेंडर को एक शीशी के भीतर आगे और पीछे ले जाती है जिसमें नमूना होता है ताकि स्टेनलेस स्टील एंड प्लग के बीच स्पंदित किया जा सके। उपकरण पीसने वाले कक्ष के भीतर एक चुंबकीय क्षेत्र बनाता है और तेजी से उलट जाता है। जैसे ही चुंबकीय क्षेत्र आगे-पीछे शिफ्ट होता है, चुंबक प्लग के खिलाफ नमूने को कुचल देता है इस प्रकार 'क्रायोग्र्रिंडिंग' और पॉपकॉर्न के स्पंदन को प्राप्त करता है। फ्रीजर मिल मोर्टार और मूसल की जगह लेता है और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ कई नमूनों (या 4 छोटे नमूनों तक) के अनुक्रमिक प्रसंस्करण की अनुमति देता है और मैनुअल पीसने से जुड़े उपयोगकर्ता-से-उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता से बचता है। एक बार नमूनों की कार्रवाई कर रहे हैं, सेल अर्क डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. खमीर पॉपकॉर्न की तैयारी

  1. 1 x 10 7 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के लिए YPD मीडिया के0.5 एल में खमीर कोशिकाओं को विकसित करें। कल्टर काउंटर या किसी अन्य साधन का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  2. 2,400 ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
  3. प्रत्येक नमूने को एक बार बर्फ-ठंडे डिएकोनाइज्ड 18 मेगा ओम मिल्ली-क्यू पानी के 500 एमएल के साथ धोएं।
  4. बर्फ के 15 एमएल में रेशों-ठंडे लाइसिस बफर [20 m M HEPES-KOH पीएच 7.5, 110 mM KCL, 0.1% ट्वीन, 10% ग्लाइसेरोल, हौसले से जोड़ा एजेंट 10 mm β-mercapto, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, 10 माइक्रोन प्रोटेसोम अवरोधक एमजी-132, 1 एमएम डेसिटिलीज अवरोधक सोडियम ब्यूटारेट और फॉस्फेट अवरोधक (1 एमएम सोडियम वैनाटेटे, 50 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 50 एमएम सोडियम β-ग्लीसेरोफोस्फेट)]। अतिरिक्त विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। बर्फ पर पुनर्संपित कोशिकाओं को तब तक रखें जब तक कि नमूने अगले चरण के लिए तैयार न हों।
    नोट: डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर इसमें शामिल नमूनों और विशिष्ट अवरोधकों के साथ कई गैर-आयनिक डिटर्जेंट वाले लाइसिस बफ़र्स की एक विस्तृत विविधता का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए प्रोटीज और प्रोटेस्टोमल अवरोधकों को शामिल करना महत्वपूर्ण है, खासकर एक बार अर्क गल जाता है।
  5. एक समय में सेल निलंबन को एक बूंद जोड़कर स्नैप फ्रोजन यीस्ट पॉपकॉर्न बनाएं, जो एक पूर्व-ठंडा सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सूखी बर्फ पर रखा जाता है और रिम के ठीक नीचे तक एलएन2 से भरा होता है। तेजी से वाष्पीकरण के कारण इसके नुकसान की भरपाई के लिए अक्सर ट्यूब में तरल नाइट्रोजन को ऊपर करें। नाइट्रोजन एस्फिक्सेशन से जुड़े खतरों से बचने के लिए एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में काम करें।
    1. 50 एमएल ट्यूब के बजाय, पॉप-कॉर्न तैयार करने(चित्रा 1A)के लिए एक साथ बंधे कई 50 एमएल ट्यूब (या बड़े मुंह वाले किसी भी कंटेनर, जैसे कि एक बड़ी प्लास्टिक अपकेंद्रित्र बोतल जो क्रायोजेनिक तापमान बर्दाश्त कर सकती है) का उपयोग करें। कंटेनर और इसके उद्घाटन जितना बड़ा होता है, पॉपकॉर्न की तैयारी उतनी ही आसान होती है क्योंकि यह पॉपकॉर्न के झुरमुट को बड़े समुच्चय बनाने से रोकता है। पॉपकॉर्न के लिए 0.3-0.5 सेमी की आकार सीमा फ्रीजर मिल(चित्रा 1B)का उपयोग करके उचित पीसने/पल्वराइजेशन प्राप्त करने के लिए आदर्श है।
    2. सुनिश्चित करें कि एलएन2 -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले पॉपकॉर्न युक्त ट्यूबों से पूरी तरह से सुखाया गया है। खमीर पॉपकॉर्न तैयार करने के बाद रोकना संभव है क्योंकि वे -80 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने पर कई वर्षों तक स्थिर होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:खमीर पॉपकॉर्न तैयारी। (क) खमीर "पॉपकॉर्न" एलएन2में सेल निलंबन की ड्रॉपवाइज ठंड से बना है । हम एक से तीन 50 एमएल ट्यूब का उपयोग एक रबर बैंड के साथ एक साथ आयोजित किया और सूखी बर्फ से भरा एक बर्फ बाल्टी में रखा। ट्यूबों एल2 से भर रहे है जब तक बस अपने रिम्स के नीचे और तरल नाइट्रोजन के साथ अक्सर सबसे ऊपर है उंहें लगभग पूरा रखने के लिए जब तक सभी सेल निलंबन पॉपकॉर्न में किया गया था(बी) पॉपकॉर्न का आकार इष्टतम पीसने दक्षता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है । पॉपकॉर्न की आकार सीमा व्यास में 0.3 और 0.5 सेमी के बीच होनी चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. क्रायोग्रिंडिंग

  1. शुरू करने के लिए, सुनिश्चित करें कि फ्रीजर मिल को ठंडा करने, शीशियों को पीसने, आपूर्ति करने और सभी नमूनों के लिए मशीन संचालित करने के लिए पर्याप्त एलएन2 उपलब्ध है। पांच से कम नमूनों के लिए, एलएन2 के 30-35 एल पर्याप्त होना चाहिए। फिल लाइन तक एलएन2 के साथ फ्रीजर मिल चैंबर भरें।
    चेतावनी:एलएन 2 से जुड़े सभी कदम एक अच्छीतरह से हवादार क्षेत्र में किए जाने चाहिए और फ्रीजर मिल को ऐसे क्षेत्र में स्थित होना चाहिए ताकि श्वासावरोध के जोखिम से बचा जा सके। उचित जूते, प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा, नाइट्रिल दस्ताने की एक आधार परत, फिर थर्मल दस्ताने, नाइट्रिल दस्ताने की एक और जोड़ी के बाद सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। एलएन 2 को संभालते समय अत्यधिक सावधानीबरतें।
  2. फ्रीजर मिल ढक्कन धीरे-धीरे बंद करें, एलएन 2 के छप से बचतेहुए और मशीन को ठंडा करने के लिए कुछ मिनट की अनुमति दें। अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले वाष्पीकरण के कारण हुए नुकसान की भरपाई के लिए एलएन2 के साथ चैंबर को फिर से भरना आवश्यक हो सकता है।
    नोट: केवल भरने की लाइन तक की जरूरत के रूप में एलएन2 फिर से भरना । कक्ष को ओवरफिल न करें क्योंकि यह मशीन के लिए खतरनाक और हानिकारक दोनों हो सकता है। स्वचालित रिफिल सिस्टम फ्रीजर मिल के लिए उपलब्ध हैं जो फ्रीजर मिल से जुड़े स्टोरेज टैंक से सीधे आवश्यक वाष्पीकरण एलएन2 की भरपाई कर सकते हैं।
  3. बड़े पीसने वाली शीशियों और चुंबकीय प्रभावक बार को एलएन2 में डुबोकर एक अलग छोटे देवर में रखा गया प्री-चिल करें । जब एलएन2 बुदबुदाना बंद हो जाता है तो सभी एलएन2 को डिकेंट करें। फिर पीसने वाली शीशी में नमूना/खमीर पॉपकॉर्न जोड़ें और इसे दो स्टेनलेस स्टील एंड प्लग के साथ कसकर सील करें ।
    1. पीसने वाली शीशी को एक तिहाई से अधिक नमूने के साथ न भरें क्योंकि इससे पीसने की दक्षता कम हो सकती है। इसके बजाय, बड़े नमूनों को दो या अधिक शीशियों में विभाजित करके और उन्हें क्रमिक रूप से पीसकर संसाधित किया जा सकता है। छोटे पीसने वाली शीशियों का उपयोग छोटे नमूनों (3 एमएल तक) के लिए किया जा सकता है।
  4. पीसने वाली शीशी को फ्रीजर मिल के चैंबर में रखें और जगह-जगह लॉक कर दें। ढक्कन बंद कर दें।
  5. नवोदित खमीर के लिए, 14 की एक कुचल दर पर 2 मिनट/चक्र (चक्र के बीच ठंडा करने के लिए 2 मिनट तोड़ने के साथ) के लिए कुल तीन चक्रों के लिए नमूनों को पीसने । जब मशीन चक्र ों को पूरा करने के बाद बंद हो जाती है, तो फ्रीजर मिल के ढक्कन को धीरे-धीरे खोलें और ध्यान से पाउडर जमे हुए सेल के साथ शीशी को अनलॉक करें और फ्रीजर मिल से निकाल दें। यदि कई छोटी शीशियों का उपयोग किया जाता है, तो एक समय में एक शीशी को हटाने और उन्हें सूखी बर्फ में रखने के लिए जल्दी से काम करें।
    नोट: आमतौर पर एक ही प्रकार के नमूने के साथ विभिन्न आकारों की शीशियों का उपयोग करते समय पीसने वाले मापदंडों को समायोजित करने की कोई आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, पीसने वाले मापदंडों जैसे चक्रों की संख्या और पीसने की दर को विभिन्न नमूना प्रकारों के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है, जो आसानी के आधार पर होता है जिसके साथ वे lyse करते हैं। अधिकांश स्तनधारी कोशिकाएं और मुलायम ऊतक 10 की पेराई दर पर 1-2 चक्रों में lyse होंगे। बैक्टीरिया, खमीर, फ्लाई लार्वा और वयस्क फल मक्खियों जैसे नमूनों को lyse करने के लिए कठिन अधिकतम दर पर 3-6 चक्रों की आवश्यकता होती है, जबकि हड्डी, दांत आदि जैसे कठोर ऊतकों को 10 चक्रों तक की आवश्यकता हो सकती है। गल नमूने का एक छोटा सा एलिकोट माइक्रोस्कोप के नीचे पहले और पीसने के बाद देखा जा सकता है ताकि लाइसिस दक्षता निर्धारित करने के लिए अक्षुण्ण, असंसाद कोशिकाओं की संख्या को गिना जा सके। नवोदित खमीर से प्रोटीन और डीएनए की रिहाई पर क्रायोफ्रेंडिंग मापदंडों के प्रभाव का एक उत्कृष्ट विश्लेषण पहले15प्रकाशित किया गया है ।
  6. जल्दी से काम करना ताकि नमूना को गल जाने की अनुमति न दी जा सके, ध्यान से अंत टुकड़ों में से एक को अनस्क्रू करें (ऐसा प्रतीत होता है कि पीसने के दौरान कुछ ढीला हो गया है) उद्घाटन उपकरण का उपयोग करके। फिर, प्रभावकार बार को हटाने के लिए लंबे संदंश (जो सूखी बर्फ के साथ एक बाल्टी में पूर्व-ठंडा होते हैं) की एक जोड़ी का उपयोग करें। एक पॉलीस्टीरिन वजनी डिश पर पीसने वाली शीशी को उलटा और टैप करके पल्वराइज्ड नमूना लें और एलएन2 के साथ पूर्व-ठंडा किया जाए और सूखी बर्फ पर रखा जाए।
  7. एक बार पाउडर जमे हुए सेल lysate के सभी पीसने शीशी से बरामद किया गया है, 50 मिलीएल ट्यूब में वापस वजन पकवान से पाउडर lysate डालना और धीमी गति से विगलन कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना सबसे अच्छा परिणाम के लिए अगले वर्णित है। वैकल्पिक रूप से, जमे हुए पाउडर को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, हालांकि इसके परिणामस्वरूप कुछ गिरावट हो सकती है।
  8. बर्फ और पानी के 50% घोल के साथ एक बर्फ बाल्टी तैयार करें और इसे चुंबकीय उभारने के साथ हलचल प्लेट पर रखें। नमूनों को पकड़ने के लिए बर्फ के घोल में एक तार रैक या किसी अन्य उपयुक्त रैक को जलमग्न करें।
    1. फिर, धीरे-धीरे एक चुंबकीय उभारकर का उपयोग करके घोल के निरंतर आंदोलन के साथ बर्फ के घोल स्नान पर नमूनों को पिघलाएं। पिघलने वाली बर्फ को बदलने के लिए अधिक बर्फ जोड़ें (बर्फ बाल्टी को बहने से रोकने के लिए कुछ पानी को त्यागने की आवश्यकता हो सकती है)। चूंकि कई अवरोधकों के पास जलीय बफ़र्स में कम आधे जीवन होते हैं, इसलिए अतिरिक्त प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (सामग्री की तालिकादेखें) और 10 माइक्रोन प्रोटेसोम अवरोधक एमजी-132 को लाइसेट में जोड़ें एक बार नमूने विगलन शुरू हो जाते हैं (लगभग 30 मिनट के बाद)।
    2. विगलन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए हर 5 मिनट में ट्यूबों के बाहर बनी बर्फ निकालें। ध्यान दें कि कमरे के तापमान या उच्च पर नमूनों की तेजी से विगलन महत्वपूर्ण गिरावट का कारण बन सकता है।
  9. नमूनों के पूरी तरह से गल जाने के बाद (नमूने की मात्रा के आधार पर एक घंटे से अधिक समय लग सकता है), lysated 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रशीतित टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 20 मिनट के लिए ~ 3,220 ग्राम पर lysate से सेल मलबे के थोक को हटाने के लिए ।
  10. सुपरनेट को 50 एमएल पॉलीकार्बोनेट सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें जो बर्फ पर पूर्व-ठंडा किया गया है और नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस (सामग्री की तालिकादेखें) पर 20 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  11. केवल स्पष्ट सुपरनेट को स्थानांतरित करें जिसमें ट्यूब में तरल स्तंभ के केंद्र से स्पष्ट पूरे सेल अर्क बहुत धीरे-धीरे और ध्यान से, बादल लिपिड परत(चित्रा 2)को परेशान किए बिना, पूर्व-ठंडा सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके एक ठंडा 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। लिपिड और मलबे के कैरीओवर को रोकने के लिए सेंट्रलाइज ट्यूब में सभी लाइसेट को हटाने से बचें। प्रत्येक स्पिन के बाद निकालने की छोटी मात्रा को ठीक करने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब में बचे हुए lysate को कई बार अपकेंद्री किया जा सकता है।
    नोट: किसी भी विकृत प्रोटीन के साथ लिपिड बादल/दूधिया दिखाई देगा और तरल के शीर्ष पर स्थित है/

Figure 2
चित्रा 2:एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में परतें निकालें। 20 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र के बाद एक ट्यूब में पूरे सेल निकालने की प्रमुख दृश्यमान विशेषताएं इंगित की गई हैं। प्रत्येक सुविधा की सापेक्ष बहुतायत नमूना प्रकार, कोशिकाओं के विकास चरण (घातीय बनाम स्थिर) पर निर्भर करती है, कोशिकाओं को फिर से रीसुस्पेंड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लाइसिस बफर की मात्रा और लाइसिस दक्षता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. सेंट्रलाइज किसी भी शेष lysate 5 मिनट के लिए निकालने के अधिक ठीक करने के लिए । यदि संभव हो सके उतना स्पष्ट उद्धरण को ठीक करने के लिए आवश्यक हो तो इस 5 मिनट अपकेंद्री को कई बार दोहराएं। पैलेट के पास ट्यूब के नीचे के करीब लिपिड युक्त बादल को छोड़ दें।
  2. प्रोटीन जटिल शुद्धिकरण, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और प्रोटेओमिक विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इन अर्क का उपयोग करें।

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Representative Results

हमने दोनों तरीकों से तैयार सेल अर्क में सापेक्ष वसूली प्रोटीन का आकलन करने के लिए खमीर सेल लाइसिस के लिए दो अलग-अलग तरीकों की तुलना की, अर्थात् ग्लास मनका मिलिंग 4 डिग्री सेल्सियस पर और -196 डिग्री सेल्सियस पर एक स्वचालित क्रायोग्रिंडिंग विधि। इस अध्ययन के लिए, हम एक नवोदित खमीर तनाव YAG ११७७ (चटाई एक lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-200 trp1-1 [am] ubi1-1:: TRP1 ubi2-Τ 2:ura3 ubi3-Τub-2 ubi4-Τ2:: LEU2 [pUB39] [pUB221])16 एक उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड ले जाने के लिए एक मिलकर अपने-MYC टैग Ubiquitin (HIS-MYC-Ub) तो हम आत्मीयता शुद्धिकरण के बाद अर्क से टैग सर्वव्यापी प्रोटीन की वसूली की दक्षता का आकलन कर सकते हैं ।

हमने एक त्वरित प्रोटोकॉल का परीक्षण किया जो 4 डिग्री सेल्सियस पर खमीर कोशिकाओंको 9 और फ्रोजन यीस्ट कोशिकाओं (खमीर पॉपकॉर्न) का उपयोग करके क्रायोग्रिंडिंग विधि और उन्हें फ्रीजर मिल में एलएन2 में पीसने के लिए ग्लास मनका मिलिंग का उपयोग करता है। हम निकालने की तैयारी के दो तरीकों के साथ एक स्पष्ट अंतर की रिपोर्ट करते हैं।

चित्रा 3A में हम प्रदर्शित करते हैं कि हम दो अलग-अलग अर्क तैयारी विधियों का उपयोग करके कोशिकाओं की एक ही संख्या से तैयार WCE की बराबर मात्रा में लोड करने के बाद Ponceau एस धुंधला द्वारा निर्धारित फ्रीजर पीसने का उपयोग करके तैयार पूरे सेल अर्क (WCE) से एक निश्चित उच्च कुल प्रोटीन उपज प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, चित्रा 3B अपने-MYC टैग सर्वव्यापी प्रोटीन की उच्च वसूली से पता चलता है नीचे खींचने के बाद नीचे खींचने के लिए WCE से Talon मोती का उपयोग कर cryogrinding द्वारा तैयार की, जब WCE मनका डिब्बा का उपयोग कर तैयार की तुलना में, दोनों मामलों में कोशिकाओं की एक ही संख्या से तैयार अर्क का उपयोग करने के बावजूद ।

Figure 3
चित्रा 3:क्रायोक्रिनिंग से सेल अर्क में उच्च कुल प्रोटीन पैदावार होती है और इन अर्कों से प्रोटीन को खींचने के बाद टैग किए गए प्रोटीन की बेहतर वसूली होती है। (ए) पूरे सेल अर्क (डब्ल्यूसीई) को इस प्रोटोकॉल में क्रायोक्रिंडिंग के लिए वर्णित या जैसा कि पहले मनका मिलिंग विधि के लिए वर्णित किया गया था। 9 500 एमएल खमीर तनाव अपने-MYC-Ub ले जाने के लिए 107 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के लिए हो गया था । फिर प्रत्येक विधि द्वारा अर्क तैयार करने के लिए समानांतर में संस्कृति के 250 एमएल का उपयोग किया गया था। WCE के समकक्ष मात्रा में दो अलग अलग तरीकों का उपयोग कर कोशिकाओं की एक ही संख्या से तैयार किया गया था। उसके टैग प्रोटीन तो नीचे प्रत्येक निकालने की एक ही राशि से Talon मोती (आईपी) का उपयोग कर खींच लिया गया । अंत में, इन आत्मीयता शुद्ध प्रोटीन की तुलना उन्हें एक डेन्चरिंग पॉलीएक्रेलैमाइड जेल पर हल करके की गई थी और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया गया था जिसके बाद पोंसाऊ एस के साथ धुंधला हो गया था। फ्रीजर पीसने विधि का उपयोग करके तैयार डब्ल्यूसीई युक्त लेन में मजबूत धुंधला। (ख) Ponceau एस दाग नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली में दिखाया गया है (ए) तो पश्चिमी दाग के लिए संसाधित किया गया था अपने टैग एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए अपने-Ub टैग प्रोटीन की मात्रा की तुलना करने के लिए दो तरीकों द्वारा तैयार निकालने की समान मात्रा से नीचे खींच लिया । क्रायोक्रिंडिंग (लाल तीरों द्वारा इंगित) द्वारा तैयार डब्ल्यूसीई का उपयोग करके पुलडाउन में कई बैंड स्पष्ट रूप से अधिक प्रतिनिधित्व किए गए थे, जबकि मनका बीटिंग द्वारा तैयार डब्ल्यूसीई का उपयोग करके पुलडाउन में संबंधित बैंड या तो तीव्रता में काफी कमजोर थे, या अज्ञेय थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कुल मिलाकर, प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि खमीर पॉपकॉर्न के क्रायोक्रिनिंग से क्रायोक्रिनिंग(चित्रा 3 ए)द्वारा तैयार डब्ल्यूसीई में मजबूत पोंसेऊ एस दाग प्रोटीन बैंड के आधार पर उच्च पैदावार और बेहतर प्रोटीन अलगाव होता है। यह क्रायोग्रिंडिंग द्वारा तैयार किए गए अर्क में अधिक कुशल लाइसिस और सीमित प्रोटीन क्षरण के कारण होने की संभावना है, जैसा कि पश्चिमी दाग लेन में मजबूत बैंड की उपस्थिति से संकेत मिलता है कि उसकी टैग किए गए प्रोटीन को क्रायोजेनिक एक्सट्रैक्ट(चित्रा 3 बी)से नीचे खींच लिया गया है ।) जबकि ग्लास मनका मिलिंग प्रोटोकॉल तेज और कम श्रम गहन है, यह प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है जो तापमान संवेदनशील या अत्यधिक अस्थिर हैं। हम यह भी पाते हैं कि पॉली सर्वव्यापी प्रोटीन जैसे पोस्टट्रांसल संशोधनों का अलगाव क्रायोग्रिंडिंग प्रोटोकॉल 16 ,17,18के साथ अधिक कुशल है ।

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Discussion

खमीर से देशी प्रोटीन का अध्ययन करने की एक सीमा उनके कठिन सेल दीवार के कारण खमीर कोशिकाओं की अक्षम लाइसिस है। हालांकि कई तरीकों को विकसित किया गया है, हमारे हाथों में सबसे सुसंगत और कुशल विधि खमीर कोशिकाओं के cryogrinding पॉपकॉर्न के रूप में जमे हुए फ़्लैश है । यह विधि अन्य लाइसिस विधियों की तुलना में नवोदित खमीर से उच्च गुणवत्ता वाले पूरे सेल अर्क की विश्वसनीय तैयारी की अनुमति देती है। प्रतिनिधि परिणामों ने दिखाया कि क्रायोक्रिंडिंग खमीर लाइसिस के लिए एक लोकप्रिय यांत्रिक विधि से बेहतर है जो 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 3 ए और 3 बी)पर मनका मिलिंग को रोजगार देता है। क्रायोग्रिन्डिंग कुशलता से खमीर कोशिकाओं को lyses जबकि नमूनों को एलएन 2 स्नान में -196 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर संसाधित कियाजाता है, इसलिए गर्मी प्रेरित प्रोटीन डेनैचुरेशन और गिरावट को बहुत सीमित करके प्रोटीन अखंडता को बनाए रखता है जो निकालने की तैयारी के कई अन्य तरीकों के साथ होता है। यह नमूनों में अत्यधिक लैबाइल मैक्रोमॉलिक्यूल्स के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और कार्यात्मक प्रोटीन परिसरों के शुद्धिकरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, फ्रीजर मिल का उपयोग भी एक मोर्टार के साथ खमीर पॉपकॉर्न के अत्यधिक श्रम-गहन पारंपरिक मैनुअल पीसने की जगह लेता है, जिससे तेजी से और कुशल नमूना प्रसंस्करण की अनुमति मिलती है। अंत में, किसी भी महंगे एंजाइमों के उपयोग के बिना खमीर सेल लाइसिस की उपलब्धि लंबे समय में महत्वपूर्ण बचत के लिए प्रदान करती है।

एक फ्रीजर मिल का प्रमुख नकारात्मक पक्ष उपकरण खरीदने में शामिल अग्रिम लागत है, साथ ही न्यूनतम रखरखाव और रनिंग लागत (यानी, बड़ी मात्रा में तरल नाइट्रोजन) शामिल है। यह भी खमीर पॉपकॉर्न और क्रायोग्रिंडिंग कदम दोनों की तैयारी के लिए संभावित खतरनाक एलएन2 के सावधान हैंडलिंग की आवश्यकता है । बड़े नमूनों को व्यक्तिगत रूप से संसाधित करने की आवश्यकता होती है, जो कई नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होने पर समय लेने वाली हो सकती है। इसके अलावा, जब कई नमूनों प्रसंस्करण, पीसने शीशियों, टोपियां और प्रभावक सलाखों को ठीक से धोया जाना चाहिए और फिर से उपयोग से पहले साफ साफ (वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त सामान के कई सेट बनाए रखा जाना चाहिए) ।

यहां प्रदर्शित प्रोटोकॉल प्रोटीन आत्मीयता शुद्धिकरण, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययन, लैबिल प्रोटीन या उनके संशोधनों के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए नमूना तैयार करने, या प्रोटेओमिक विश्लेषण16,19के लिए खमीर प्रोटीन नमूनों की तैयारी के लिए मूल्यवान है। इसके अलावा, खमीर पॉपकॉर्न के क्रायोग्रिंडिंग का उपयोग नाभिक गतिविधि को कम करते हुए कतरनी जीनोमिक डीएनए13,20,21 याआरएनए22,23 अलगाव के लिए भी किया जा सकता है, इस प्रकार नमूना संरक्षण सुनिश्चित करना24। इस बहुमुखी विधि का उपयोग बैक्टीरिया21, 22और यीस्ट15जैसे अधिकांश सूक्ष्मजीवों के लिए किया जा सकता है, और स्तनधारी कोशिकाओं के लिए जल्दी से अनुकूलित किया जा सकता है, दोनों संयंत्र25 और पशु26 ऊतकों, खाद्य उत्पादों27,समुद्री नमूनों21,कोरल सहित28, फोरेंसिक नमूने20बाल29 और यहां तक कि जीवाश्म30 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विलुप्त जीवनरूपों के अवशेष पर्माफ्रॉस्ट31में जमे हुए सहित .

अंत में, फ्रीजर मिल में क्रायोग्रिंडिंग कई डाउनस्ट्रीम बायोकेमिकल अनुप्रयोगों के लिए विविध स्रोतों से प्राप्त विभिन्न नमूनों से प्रोटीन और अन्य मैक्रोमॉल्यूल अलगाव के लिए एक कुशल विधि है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

गुंजन लैब में रिसर्च को नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, नेशनल साइंस फाउंडेशन और फ्लोरिडा डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ से फंडिंग का सपोर्ट मिल रहा है । हम तकनीकी सहायता के लिए स्नातक छात्र जॉन पार्कर का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL polycarbonate tubes with screw caps Beckman 357002 Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone BD Biosiences 211677 Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract BD Biosiences 212750 Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge Beckman B38624 High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000 Beckman 366754 Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous MP Biomedicals 901521 Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44 Eppendorf 22637461 Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R Eppendorf 22625101 Refrigerated centrifuge
Glycerol SIGMA-ALDRICH G5150-1GA Volume excluder and cryoprotectant
HEPES FisherBiotech BP310-100 Buffer
HIS6 antibody Novagen 70796 Antibody for HIS tag
KCl SIGMA-ALDRICH P9541-1KG Salt for maintaining ionic strength
MG-132 CALBIOCHEM 474790 Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32957 Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S SIGMA P7170-1L Protein Stain
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32963 Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500 Beckman JLA 25.500 Rotor
Sodium Butyrate EM Science BX2165-1 Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S6521 Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate MP Biomedicals 159664 Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar 13408-09-8 Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill SPEX Sample Prep 6850 Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin BD Biosiences 635502 For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20 VWR International VW1521-07 Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol AMRESCO M131-250ML Reducing agent

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References

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जीव विज्ञान अंक 167 फ्रीजर मिल क्रायोफ्रेंडिंग क्रायोजेनिक पीस फ्रीजर पीस फ्रीजर मिलिंग क्रायोमिलिंग प्रोटीन शुद्धि पूरे सेल निकालने सेल लिस्टे खमीर निकालने खमीर पॉपकॉर्न तरल नाइट्रोजन (एलएन2),इम्यूनोप्रिपिटेशन फोरेंसिक अवशेष जीवाश्म विलुप्त लाइफफॉर्म पर्माफ्रॉस्ट पुरातात्विक
एक स्वचालित फ्रीजर मिल में क्रायोग्रिंडिंग द्वारा सेल अर्क की तैयारी
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Phillips, E. O. N., Giovinazzi, S., Menz, S. L., Son, Y., Gunjan, A. Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill. J. Vis. Exp. (167), e61164, doi:10.3791/61164 (2021).

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