Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד את התכווצות היבול ואת התפלגות המזון לכמת בתוך הבטן Drosophila .
Abstract
רוב החיות להשתמש במערכת העיכול (GI) בדרכי לעכל מזון. התנועה של המזון הבלוע במערכת העיכול חיונית לספיגה מזינים. תנועתיות והקיבה מרוחים ומרוקנים את הגורם למחלות ותסמינים מרובים. כאורגניזם מודל גנטי רב-עוצמה, ניתן להשתמש בדרוסופילה במחקרים של מערכת העיכול. היבול של Drosophila ילה הוא איבר החוזה ומעביר מזון לתוך המעיים לעיכול נוסף, הדומה באופן פונקציונלי לבטן היונקים. מוצג הוא פרוטוקול לחקר דרוסופילה היבול התנועתיות באמצעות כלי מדידה פשוטים. שיטה לספירת התכווצויות יבול להערכת תנועתיות היבול ושיטה לגילוי התפלגות המזון הנצבע כחול בין היבול והבטן באמצעות ספקטרוסקופיה כדי לחקור את ההשפעה של היבול על מזון הפסהאייג ' מתואר. השיטה שימש כדי לזהות את ההפרש בגידול בתנועתיות בין שליטה לבין nprl2 מוטאנטים. פרוטוקול זה מהווה גם חסכוני ורגיש מאוד לחיתוך תנועתיות.
Introduction
רוב החיות יש צינור העיכול שנקרא מערכת העיכול (GI) בדרכי לקלוט אנרגיה וחומרים מזינים מהסביבה. מערכת העיכול האנושית מורכבת מארבעה חלקים: הוושט, הקיבה, המעי הדק, והמעי הגס (נקודתיים). מעבר המזון מהבטן אל המעי הוא חיוני לספיגה מזינים. חלק מהעריקים, כגון הזדקנות, סמים רעילים וזיהום, גורמים לתנועתיות בדרכי GI ולריקון הקיבה, הקשורה למחלות מסוימות ולתסמינים כגון דיספסיה, מחלת ריפלוקס ועצירות1.
זבוב הפירות (דרוסופילה מלאנוסטר) הוא בעל חיים מודל נפוץ במחקר ביו-רפואי בשל מניפולציה גנטית קלה. חשוב מכך, כ-77% מהגנים הקשורים למחלה האנושית יש יומן הומוזוזה בדרוסופילה2. המחקר בדרוסופילה התקדם בהרבה את הבנתנו את מנגנוני המחלות הרבים. כאורגניזם מודל גנטי רב עוצמה, דרוזופילה משמש רבות במחקר בדרכי העיכול3. לדרוסופילה יש מערכת עיכול פשוטה יותר, המחולקת לשלושה תחומים נפרדים: במעי הקדמי, באמצע המעיים ובבטן4. היבול, חלק מהבטן הקדמי, הוא מבנה דומה לתיק המשמש כאתר לאחסון מזון שבלע. המעיים היא צינורית ארוכה ומתפקדת כאתר לעיכול מזון וספיגה מזינים באמצעות שכבת האפיתל, המורכבת מתאים בנטציטים (ECs) והפרשה בתאי הנדסת חשמל5. מעניין, תפקוד הקיבה בדרוסופילה מחולק לשני חלקים: היבול מתפקד כאחסון מזון ואזור תא הנחושת (ccr) הוא אזור חומצי מאוד עם pH < 36. בדרוזופילה, המזון הבלוע מועבר בתחילה ליבול ולאחר מכן נשאב לתוך המיבטן7. לפיכך, היבול ממלא תפקיד קריטי בהפסיית מזון. עטוף על ידי שרירי הקרביים והמורכב של מערך מורכב של שסתומים וספיריטרים, היבול ממשיך בקבלנות והעברת מזון לתוך המעיים לעיכול נוסף.
פרוטוקול זה מאפשר איתור תנועת מזון מן היבול לאמצע המעיים בדרוסופילה. התכווצות חיתוך מוערכת על-ידי ספירת תדירות התכווצות החיתוך. בנוסף, ההשפעה של היבול על מזון מעבר המזון הוא נחקר על ידי גילוי התפלגות המזון בין יבול לבטן. יתרה מזו, ניתן להשתמש בחלוקת המזון כדי לשקף תנועת מזון מיידית או מצב מזון בסיסי באמצעות תקופות האכלה שונות. פרוטוקול זה מספק שיטות להערכת מהירות של תנועתיות והזדקנות מזון בדרוזוהילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שמירה והכנה של זבובים ניסיוניים
- שמרו על זבובים בבקבוקונים המכילים 10 מ ל של מזון טרי (1% אגר, 2.4% שמרים בירה, 3% סוכרוז, 5% קמח תירס) בחממה ב -25 ° c עם 60% לחות. הגדר את מחזור האור של האינקובטור לאור 12-h: 12-h כהה.
- כדי להבטיח שמספר רב של גנוטיפ הרצוי יעוף בו, התרבות הצעירה זבובים (1-3 ימים) במזון סטנדרטי עם שמרים יבשים על פני השטח במשך 3 ימים. להעביר את המבוגרים לבקבוקון מזון חדש עם מזון סטנדרטי כולל שמרים רטובים, עבור יומיים כדי לאפשר הנחת ביצים. להשאיר את הביצים בחממה לפתח ולהעביר זבובים מבוגרים למבחנה חדשה כדי לאסוף ביצים יותר.
- לאסוף את הזכר הנשי או הנקבה זבובים כל יום ותרבות אותם בבקבוקונים חדשים עם מזון רגיל במצב תחזוקה לגיל הרצוי.
הערה: כדי לקבל עוד זבובים באותו גיל, ניתן להגדיר בו מספר מבחנות של ה-גנוטיפ הרצוי. יש לשנות את הבקבוקונים לתרבות הזבוב המבוגר כל 3-5 ימים.
2. ספירת התכווצויות יבול
- להוריד את הזבובים עם CO2 ולקחת אחד זבוב לתוך הצלחת מנתח המכיל 200 μl של מלוחים באגירה 1x פוספט (PBS, pH = 7.4) מורכב 136.89 Mm הנאקל, 2.67 Mm kcl, 8.1 mm Na2ההפו4, ו 1.76 mm KH2PO4.
- תפוס את הזבוב בבית החזה באמצעות זוג מלקחיים אחד, פתח בצורה חלקה את בית החזה תוך שימוש בזוג מלקחיים אחר, ולאחר מכן משוך את הקצה בכיוונים מנוגדים כדי לפתוח את הבטן. קח את היבול ואת המעיים מהגוף בזהירות.
- המתן עד שהזבוב יתעורר ולאחר מכן תדמיין את היבול ותספור את מספר הפעמים שהוא מתכווץ בתוך 1 דקות.
הערה: רק גל מלא על האונות היבול נספר כציר אחד. - חזור על שלב 2.3 עבור 5x בין מרווחי זמן של 30.
- חישוב המספר הממוצע של התכווצויות חיתוך לדקה.
הערה: במהלך ספירת הכיווץ, על הזבוב להיות בחיים, והבטן צריכה להיות שלמה ומחוברת בסופו הקדמי והאחורי לאחר הקרע.
3. הכנת מזון צבוע
- שוקלים וממיסים את הצבע הכחול (טבלת חומרים) בערוץ PBS בריכוז של 20% (w/v).
- הוסף את 20% צבע כחול לתוך מזון תחזוקה נוזלי מבושלים (שלב 1.1) עם 1:40 דילול לריכוז הסופי של 0.5% (w/v) במהלך תהליך קירור המזון.
הערה: הצבע הכחול מתווסף לפני שהאוכל מתקרר ומעורבב היטב עם ערבוב. זה אופציונלי לפזר את הצבע הכחול ב-PBS; מים מזוקקים מתאימים גם.
4. האכלה זבובים עם מזון צבוע
- העברת קבוצות של זבובים בגיל זהה לבקבוקונים עם מזון רעב (1% אגר במים מזוקקים) עבור 4 h כדי להבטיח צריכת מזון.
- העבירו את הזבובים לבקבוקונים חדשים עם מזון צבוע כחול ותרבותי את הזבובים לזמן הרצוי.
הערה: זמן ההאכלה הוא גורם קריטי ותלוי במטרת המחקר. האכלה קצרה, בזמן האוכל העובר, ניתן להשתמש כדי להעריך את מהירות התנועתיות של מזון מיבול לבטן. בתנאי התחזוקה, האוכל עובר. בסביבות השעה 2 לערך עם זאת, הזמן לעבור דרך יכול להיות קשור לתנאי התרבות. האכלה ארוכה, עד כמה ימים, ניתן להשתמש כדי להעריך מתמשך התפלגות מזון מעמד בין יבול לבטן.
5. מבתר זבובים ואיסוף דגימות צבע ביבול ובמעיים
- להוריד את הזבובים עם CO2 ולקחת זבוב אחד לתוך הצלחת מבתר היטב המכיל 200 μl של 1X PBS.
- לתפוס את הזבוב בבית החזה שלה באמצעות זוג מלקחיים אחד ולקחת את הראש מהגוף באמצעות זוג אחר של מלקחיים. להעביר את הגוף הנותר היטב חדש המכיל 200 μL של 1x PBS.
- לשטוף את הגוף 2x על ידי לטלטל אותו בעדינות 200 μL של 1x PBS באמצעות זוג מלקחיים כדי לנקות את הצבע המחובר לגוף לעוף.
- בעדינות ובאופן חלק לפתוח את הבטן באמצעות שני זוגות של מלקחיים ובזהירות להפריד את כל הבטן מהגוף.
- בזהירות להוריד את היבול מהבטן כולה ולשים אותו בצינור עם 100 μL של 1x PBS.
- לבסוף, לשים את הבטן כולה ללא יבול (להלן המכונה בטן) בצינור אחר עם 100 μL של 1x PBS.
- לטחון את היבול ואת הבטן בהתאמה בצינורות באמצעות עצות הפיפטה כדי להפוך את הצבע מתמוסס ב-PBS.
- חזור על הצעדים 5.1 עד 5.7 עד שמספיק יבולים ומעיים ייאספו עבור הניסוי שמתוכנן.
הערה: היבול והמעיים צריכים להיות הומוגניים לחלוטין, וכל הצבע צריך להיות מומס במאגר. למטרות מחקר, ניתן לאסוף בצינור אחד או מספר גידולים או מעיים.
6. חישוב כמויות צבע ביבול ובמעיים
- צנטריפוגה את הצינורות לדוגמה במהירות הגבוהה ביותר עבור 1 דקות ולהעביר 90 μL של סופרנאטאנט לבארות של הצלחת הטובה 96.
- הפוך סדרה של מדלל צבע כחול בריכוזים מ 1 x 10-7 g/mL ל 1 x 10-4 g/ml כמו סטנדרטים.
- הוסף סדרה של תקן 90 μL לבארות של הצלחת הטובה 96.
- מדוד את ספיגת הדגימות והתקנים ב-630 ננומטר עם פלטת צלחות.
- כדי ליצור עקומה סטנדרטית, יש להתוות גרף קו של ספיגת לעומת ריכוז לכל אחד מהסטנדרטים. ואז לצייר קו של התאמה הטובה ביותר דרך הנקודות כדי לקבל את המשוואה המשמשת לחישוב הריכוז לצבוע בדגימות.
- לחשב את כמות הצבע על ידי הכפלת הריכוז לדוגמה על ידי 0.1 mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטות אלה כדי לספור קצב התכווצות היבול ולזהות התפלגות מזון צבוע ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה יבול על תנועתיות מזון. התכווצות היבול משקפת את התדירות של דחיפת מזון לבטן. התפלגות הצבע בזבוב לאחר תקופת האכלה קצרה מעיד על מזון מיידי הפסחות מפני יבול לאמצע המעיים.
היעד של rapamycin קומפלקס 1 (TORC1) הוא וסת מאסטר המדיטים חילוף החומרים התזונתי והתאים. עיכוב TORC1 מרחיב את תוחלת החיים של אורגניזמים רבים, כולל Drosophila ילה. כמדכא של TORC1, לטוס מוטציה nprl2 מציג היפר הפעלה של TORC1 ו-GI פגמים העיכול8,9. גודל היבול של מוטציה nprl2 הוא נורמלי בגיל 3 ימים מוגדל בגיל 15 ימים, לעומת בקרת הרקע הגנטי שלה (שתיכם)8. כדי להעריך את שיטת הגידול של היבול, נעשה שימוש בnprl2 מוטציה בת 3 ימים ובקרות שתיכם . כל חיתוך נספר חמש פעמים והערך הממוצע נעשה בשימוש (טבלה משלימה 1). מספרי התכווצות היבול במהלך חמשת החזרות היו דומים, מה שמעיד על כך ש-PBS לא תשפיע על הפיזיולוגיה של היבול בארוחות קצרות והיא מתאימה לחיתוך ספירת התכווצות. המוטציה nprl2 הפחיתה באופן משמעותי את קצב החיתוך (איור 1).
בדומה לקיבת היונקים, היבול של דרוזוהילה ממשיך להיות מכווץ כדי להעביר את המזון לבטן. כדי לאשר את הפונקציה של Nprl2 על היבול, התגלתה תנועת המזון. הזבובים הואכלו עם מזון צבוע 30 דקות גזור מיד כדי לזהות את כמות הצבע ביבול ואת הבטן באמצעות ספקטרופוטומטר. כפי שמוצג באיור 2A, כמויות הצבע הכחול בגידולי השליטה והמוטנטים הnprl2 היו דומים, בעקביות בגודל היבול הדומה שדווחו בעבר8. מוטציות nprl2 היו פחות צבע בבטן, אשר עשוי להיות משויך קצב התכווצות ירד (איור 2b).
איור 1: הפרשי הכיווץ החיתוך בין השליטה לזכרים nprl2 מוטנטים. הזבובים הזכרים הבני שלושה ימים היו בגזור, ושיעור התכווצות היבול נספר. תדירות התכווצות החיתוך של כל זבוב מוצגת כנקודת נתונים. קווי שגיאה מייצגים את SD מנקודת הנתונים שצוינה. , P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הבדלי התפלגות מזון בין שליטה וזכרים nprl2 מוטציות לאחר זמן האכלה קצר. הזבובים הזכרים בן 3 הימים ניזונו מזון המכיל 0.5% צבע כחול עבור 30 דקות ולאחר מכן גזור מיד כדי לזהות את כמות הצבע. (א) כמות הצבע ביבול. (ב) סכום הצבע בבטן ללא יבול. * *, P < 0.01; . אן. אס., לא משמעותיים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: הנתונים המקוריים של התכווצות החיתוך המשמשים באיור 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדרוזוהילה בלע מזון נע מהיבול למעיים לעיכול. במהלך תהליך זה, החומרים המזינים נספגים, ואת הפסולת הוא גורש מהגוף כמו צואה. כך, השוואת מזון בליעה יחד עם הפליטה צואה ניתן להשתמש כדי לאמוד בערך את מהירות תנועת המזון בגוף. השיטה של ממזין קפילר (קפה) משמשת רבות למדידת מזון בליעה10,11. שיטת ספירת מספרים צואה ניתן להשתמש כדי להעריך את כמות הצואה הבריאה12. עם זאת, תנועת המזון בגוף דרוזוהילה נמצאת תחת שליטתה של גורמים רבים, ובכלל זה היבול. פונקציית חיתוך לא ניתן להעריך בקלות באמצעות קפה וצואה שיטות ספירת. פרוטוקול זה יכול להעריך את התנועתיות היבול ואת מזון החוצה מיבול למעיים בדרוסופילה.
התנועתיות היבול חיונית להישרדות מזון והישרדות דרוזוהילה . כמה מוטציות גנים או זיהומים וירוס המשפיעים על הפונקציה יבול התוצאה בתוחלת החיים מופחת7,13,14. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקרין ולהעריך את המוטציות והתרופות המשפיעות על הגידול. ספירת התכווצות היבול משמשת לזיהוי תדירות החיתוך והפצת המזון הספקטרופוטומטר ביבול ובמעיים משמש לחיזוי יעילות היבול. שתי שיטות אלה הן קלות לביצוע ורגישות מאוד. יתרה מזאת, ניתן לשנות את השיטה הספקטרופוטומטר לאיתור שימוש במזון בדרוסופילה. לדוגמה, ניתן להעריך בליעה של מזון תוך זמן קצר על-ידי זיהוי כמות הצבע בבטן כולה. את המצב התפלגות מזון מתמשך בין יבול לבטן ניתן להעריך על ידי זיהוי כמויות הצבע של הזבובים הניזונים עם מזון צבע במשך כמה ימים.
יש כמה שיקולים טכניים בפרוטוקול זה. עבור שיטת ספירת התכווצות היבול, חיוני לנתח ולהוציא את היבול בזהירות במאגר ה-PBS. תמיסת מלח אינה הסביבה הפיזיולוגית של היבול. היבול חייב להישאר מחובר לגוף, והזבוב חייב להיות חי וער; אחרת, היבול יאבד את היכולת להתכווץ. הוא הציע לספור כיווץ יבול בזבובים שלמים כמו גם13. עבור השיטה ספקטרופוטומטר, הפרדת היבולים מתוך העברה גזור והעברתם לצלחת 96 היטב לאחר האכלה צבע המזון יש לעשות בזהירות ובמהירות. הצבע משמש לציון כמות המזון ביבול ובמעיים. במהלך תהליך הניתוח, היבול והמעיים צריכים להיות במגע. במידה והצבע דולף לתוך מדיית החיתוך, אין אפשרות להשתמש במדגם. באמצעות תרגול, טכנאי מיומן יכול לסיים את הניתוח ולחתוך את ההפרדה בתוך 30 ס מ.
בעבר, שיטות אלה שימשו כדי להעריך את תנועתיות היבול בזבובים nprl2 מוטציה בת 15 ימים שהיו יבולים מוגדלים8. במקרה זה, התכווצות היבול והפצת המזון במוטציות nprl2 בן 3 הימים עם גודל היבול הרגיל היו כמותית. המוטציות הnprl2 הציגו. פחות צבע מזון במעיים תוצאות אלה מרמזות כי מוטציות nprl2 יש כמה פגמים בחיתוך תנועתיות אפילו בגיל צעיר. הרקע שתיכם שימש כפקד סוג פראי כי זה הרקע הגנטי של החשבונאי nprl2 . עבור ניסויים אחרים, זנים כמו של קנטון ו w118, עשוי לשמש כפקדים. קבוצות אחרות להשתמש בפתרון מנתח שונה (123 mm הנאקל, 2 מ"מ kcl, 1.8 mm cacl2, 8 מ"מ mgcl2, 35.5 מ"מ מילימטר, pH = 7.1) לגילוי התכווצות היבול13,14,15. קצב התכווצות היבול שנמצא בשליטה זבובים במחקר זה נמוך יותר מאשר דיווח על ידי Solari ואח '15, אבל גבוה יותר Chtarbanova ואח '.14 ו peller ואח '13. הבדל זה עשוי להיגרם על ידי רקע גנטי שונה או מדיה לחיתוך.
בסך הכל, צבע כחול ספקטרופוטומטר יחד עם כיווץ חיתוך ניתן להשתמש ביעילות כדי להעריך את החיתוך היבול. הפרוטוקול המוצג כאן עוזר להפוך דרוסופילה מודל טוב עבור המחקר הפיזיולוגיה של מערכת העיכול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31872287), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (NO. BK20181456) ושישה פסגות כשרונות פרויקט במחוז ג'יאנגסו (לא. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
