Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو قياس انكماش المحاصيل وتحديد كمية توزيع الأغذية في الأمعاء الدوزوفيا.
Abstract
معظم الحيوانات استخدام الجهاز الهضمي (GI) للهضم الغذاء. حركة الطعام الذي يتم تناوله في الجهاز الهضمي أمر ضروري لامتصاص المغذيات. اضطراب GI الحركة وإفراغ المعدة يسبب أمراض وأعراض متعددة. ككائن حي قوي نموذج وراثي، Drosophila يمكن استخدامها في البحوث GI الحركة. محصول Drosophila هو الجهاز الذي يتعاقد ويتحرك الطعام إلى منتصف الgut لمزيد من الهضم ، وتشبه وظيفيا المعدة الثدييات. قدم هو بروتوكول لدراسة Drosophila حركية المحاصيل باستخدام أدوات قياس بسيطة. ويرد وصف لطريقة لحساب تقلصات المحاصيل لتقييم حركية المحاصيل وطريقة للكشف عن توزيع الأغذية المُصَوَّل الأزرق بين المحصول والأمعاء باستخدام مقياس طيفي للتحقيق في تأثير المحصول على النتوء الغذائي. وقد استخدمت هذه الطريقة للكشف عن الفرق في حركية المحاصيل بين التحكم وprprl2 الذباب متحولة. وهذا البروتوكول يتسم بالكفاءة من حيث التكلفة وحساسية شديدة لحركية المحاصيل.
Introduction
معظم الحيوانات لديها أنبوب الجهاز الهضمي يسمى الجهاز الهضمي (GI) لامتصاص الطاقة والمواد المغذية من البيئة. يتكون الجهاز الهضمي البشري من أربعة أجزاء: المريء، والمعدة، والأمعاء الدقيقة، والأمعاء الغليظة (القولون). مرور الطعام من المعدة إلى الأمعاء ضروري لامتصاص المغذيات. بعض الآثار، مثل الشيخوخة، والعقاقير السامة، والعدوى، تسبب اضطراب الجهاز الهضمي حركية الجهاز الهضمي وإفراغ المعدة، والذي يرتبط ببعض الأمراض وأعراضها مثل عسر الهضم، مرض الجزر المعدي المريئي، والإمساك1.
ذبابة الفاكهة(Drosophila melanogaster)هو نموذج يستخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية بسبب التلاعب الجينية السهل. الأهم من ذلك، حوالي 77٪ من الجينات المرتبطة بمرض الإنسان لديها homolog في Drosophila2. وقد حققت البحوث باستخدام دروسوفيا تقدما هائلا في فهمنا للعديد من آليات الأمراض. ككائن قوي نموذج وراثي، Drosophila يستخدم على نطاق واسع في بحوث الجهاز الهضمي3. Drosophila لديه الجهاز الهضمي أبسط، والتي تنقسم إلى ثلاثة مجالات منفصلة: foregut، midgut، و hindgut4. المحصول، وهو جزء من الـ foregut، هو هيكل يشبه الكيس الذي يعمل كموقع لتخزين المواد الغذائية التي يتم تناولها. midgut هو أنبوب طويل ويعمل كموقع لهضم الطعام وامتصاص المغذيات من خلال طبقة الظهارية ، والتي تتكون من enterocytes absorptive (ECs) وإفرازات enteroendocrine (EE) الخلايا5. ومن المثير للاهتمام، وتنقسم وظيفة المعدة في دروسوفيليا إلى قسمين: وظائف المحاصيل وتخزين المواد الغذائية ومنطقة خلية النحاس (CCR) هي منطقة حمضية للغاية مع درجة الحموضة < 36. في Drosophila، يتم نقل الطعام الذي تم تناوله في البداية إلى المحصول ثم ضخه في منتصف7. وهكذا، فإن المحاصيل تلعب دورا حاسما في تمرير الطعام. المغلفة من قبل العضلات الحشوية وتتألف من مجموعة معقدة من الصمامات وsphincters، المحصول يحتفظ التعاقد ونقل الطعام في منتصف هضم.
هذا البروتوكول يسمح للكشف عن حركة الغذاء من المحصول إلى منتصف في Drosophila. يتم تقييم انكماش المحاصيل عن طريق حساب تواتر انكماش المحاصيل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم دراسة تأثير المحصول على الأعلاف الغذائية عن طريق الكشف عن توزيع الأغذية بين المحاصيل والأمعاء. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام توزيع الأغذية لتعكس الحركة الغذائية الفورية أو الحالة الغذائية الأساسية باستخدام فترات تغذية مختلفة. معا، وهذا البروتوكول يوفر أساليب لتقييم بسرعة حركية المحاصيل والطعام passaging في Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة وإعداد الذباب التجريبي
- الحفاظ على الذباب في قارورة تحتوي على 10 مل من الأغذية الطازجة (1٪ أجار، 2.4٪ خميرة البيرة، 3٪ السكروز، 5٪ دقيق الذرة) في حاضنة في 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪. تعيين دورة الضوء من الحاضنة إلى 12 ساعة ضوء: 12-ساعة الظلام.
- لضمان أن عددا كبيرا من أنواع الجيلية المطلوبة الذباب ecloses في وقت واحد، ثقافة الذباب الشباب (1-3 أيام من العمر) في الغذاء القياسية مع الخميرة الجافة على السطح لمدة 3 أيام. نقل الكبار إلى قارورة الغذاء الجديد مع الغذاء القياسية بما في ذلك الخميرة الرطبة، لمدة 2 أيام للسماح وضع البيض. ترك البيض في الحاضنة لتطوير ونقل الذباب الكبار إلى قارورة جديدة لجمع المزيد من البيض.
- جمع ذباب الذكور أو الإناث eclosed كل يوم وثقافتها في قارورة جديدة مع الغذاء القياسية في حالة الصيانة إلى العمر المطلوب.
ملاحظة: للحصول على المزيد من الذباب في نفس العمر، قد يتم إعداد قوارير متعددة من النمط الجيني المطلوب في وقت واحد. يجب تغيير قارورة استزراع الذبابة الخاصة بالغًا كل 3-5 أيام.
2- عد تقلصات المحاصيل
- تخدير الذباب مع CO2 واتخاذ ذبابة واحدة في لوحة تشريح جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من 1x الفوسفات المالحة المخزنة (PBS، pH = 7.4) تتألف من 136.89 mM NaCl، 2.67 mM KCl، 8.1 mM Na2HPO4،و 1.76 mM KH2PO4.
- فهم ذبابة في الصدر باستخدام زوج واحد من ملاقط، بسلاسة فتح الصدر باستخدام زوج آخر من ملاقط، ومن ثم سحب نهاية في اتجاهين متعاكسين لفتح البطن. تأخذ المحاصيل والأمعاء من الجسم بعناية.
- انتظر ذبابة لتستيقظ ومن ثم تصور المحصول وعدد عدد المرات التي يتعاقد في 1 دقيقة.
ملاحظة: يتم احتساب موجة كاملة فقط على فصوص المحاصيل كانكماش واحد. - كرر الخطوة 2.3 لـ 5x بين فواصل 30 s.
- حساب متوسط عدد تقلصات المحاصيل في الدقيقة.
ملاحظة: أثناء العد الانكماشي، يجب أن تكون الذبابة على قيد الحياة، وينبغي أن يكون الأمعاء سليمة ومتعلقة في طرفيه الأمامي والخلفي بعد تشريح.
3. إعداد الأغذية المُزهَلَة
- وزن وحل الصبغة الزرقاء(جدول المواد)في برنامج تلفزيوني بتركيز 20٪ (ث / الخامس).
- أضف الصبغة الزرقاء بنسبة 20% إلى طعام الصيانة السائل المسلوق (الخطوة 1.1) مع تخفيف 1:40 إلى تركيز نهائي بنسبة 0.5٪ (ث/ الخامس) أثناء عملية تبريد الطعام.
ملاحظة: يتم إضافة الصبغة الزرقاء قبل تبريد الطعام وخلطها جيدًا مع التحريك. ومن الاختياري لإذابة الصبغة الزرقاء في برنامج تلفزيوني؛ المياه المقطرة هي أيضا مناسبة.
4. إطعام الذباب مع الطعام المُقَلَم
- نقل مجموعات من الذباب في نفس العمر إلى قوارير مع الغذاء المجاعة (1٪ أجار في الماء المقطر) لمدة 4 ساعات لضمان تناول الطعام.
- نقل الذباب إلى قارورة جديدة مع الغذاء المُغَلَّل الأزرق وثقافة الذباب في الوقت المطلوب.
ملاحظة: وقت التغذية هو عامل حاسم ويعتمد على الغرض البحثي. يمكن استخدام التغذية القصيرة ، في وقت مرور الطعام ، لتقييم سرعة حركة الطعام من المحاصيل إلى الأمعاء. في ظروف الصيانة، والغذاء يمر من خلال في حوالي 2 ساعة. ومع ذلك، قد يكون وقت المرور مرتبطًا بظروف الثقافة. يمكن استخدام التغذية الطويلة، التي تصل إلى بضعة أيام، لتقييم حالة توزيع الطعام المستمر بين المحاصيل والأمعاء.
5. تشريح الذباب وجمع عينات صبغ في المحاصيل والأمعاء
- تخدير الذباب مع CO2 واتخاذ ذبابة واحدة في لوحة تشريح جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من 1X PBS.
- فهم ذبابة في الصدر باستخدام زوج واحد من ملاقط واتخاذ رئيس قبالة الجسم باستخدام زوج آخر من ملاقط. نقل الجسم المتبقية إلى بئر جديد يحتوي على 200 ميكرولتر من 1X PBS.
- غسل الجسم 2x عن طريق هز بلطف في 200 ميكرولتر من 1X PBS باستخدام زوج من ملاقط لتنظيف الصبغة تعلق على الجسم ذبابة.
- بلطف وسلاسة فتح البطن باستخدام اثنين من أزواج من ملاقط وفصل بعناية كامل القناة الهضمية من الجسم.
- بعناية خلع المحصول من الأمعاء كلها ووضعها في أنبوب مع 100 ميكرولتر من 1X PBS.
- وأخيرا، وضع القناة الهضمية كله دون المحاصيل (المشار إليها فيما بعد باسم الأمعاء) في أنبوب آخر مع 100 ميكرولتر من 1X PBS.
- طحن المحاصيل والأمعاء على التوالي في أنابيب باستخدام نصائح ماصة لجعل صبغة تذوب في برنامج تلفزيوني.
- كرر الخطوات 5.1−5.7 حتى يتم جمع ما يكفي من المحاصيل والأحشاء للتجربة المصممة.
ملاحظة: يجب أن يكون المحصول والأمعاء متجانسين بالكامل، ويجب أن تذوب جميع الصبغة في المخزن المؤقت. لأغراض البحث، يمكن جمع محصول واحد أو عدة أو أحشاء في أنبوب واحد.
6. حساب كميات الصبغة في المحاصيل والأمعاء
- أجهزة الطرد المركزي الأنابيب العينة في أعلى سرعة لمدة 1 دقيقة ونقل 90 ميكرولتر من فائقة إلى آبار 96 بئر.
- جعل سلسلة من تخفيف صبغة زرقاء بتركيزات من 1 × 10-7 غرام / مل إلى 1 × 10-4 غرام / مل وفقا للمعايير.
- أضف سلسلة من معايير 90 ميكرولتر إلى آبار 96 بئر.
- قياس امتصاص العينات والمعايير في 630 نانومتر مع مطياف لوحة.
- لإنشاء منحنى قياسي، رسم رسم بياني خط من امتصاص مقابل التركيز لكل من المعايير. ثم رسم خط من أفضل تناسب من خلال النقاط للحصول على المعادلة المستخدمة لحساب تركيز صبغة في العينات.
- حساب كمية الصبغة بضرب تركيز العينة في 0.1 مل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن استخدام هذه الطرق لحساب معدل انكماش المحاصيل والكشف عن توزيع الأغذية المصوغة لتقييم وظيفة المحاصيل على الحركة الغذائية. يعكس انكماش المحاصيل تردد دفع الطعام إلى الأمعاء. توزيع الصبغة في الذبابة بعد فترة تغذية قصيرة يشير إلى تمرير الغذاء الفوري من المحاصيل إلى منتصفgut.
الهدف من راباميسين مجمع 1 (TORC1) هو منظم الرئيسي الذي يتوسط المغذيات والتمثيل الغذائي للخلايا. TORC1 تثبيط يمتد عمر في العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك دروسوفيا. كمثبط TORC1، وperl2 يطير متحولة يعرض فرط التنشيط من عيوب الهضم TORC1 وجي8،9. حجم المحاصيل في متحولة nprl2 أمر طبيعي في 3 أيام من العمر وتضخم في 15 يوما من العمر، مقارنة مع التحكم في الخلفية الوراثية (yw)8. لتقييم مقايسة حركية المحاصيل ، تم استخدام الذباب المتحول و عناصر التحكم yw التي يبلغ عمرها 3 أيام. تم حساب كل محصول خمس مرات واستخدم متوسط القيمة(الجدول التكميلي 1). وكانت أعداد انكماش المحاصيل خلال التكرارات الخمس متشابهة، مما يشير إلى أن برنامج تلفزيوني قد لا يؤثر على فسيولوجيا المحاصيل في الوجبات القصيرة وهو مناسب لعد انكماش المحاصيل. الطفرة nprl2 انخفضت بشكل ملحوظ في معدل انكماش المحاصيل(الشكل 1).
على غرار المعدة الثديية، يستمر محصول دروسوفيليا في التعاقد لنقل الطعام إلى الأمعاء. لمزيد من تأكيد وظيفة Nprl2 على المحصول، تم الكشف عن حركة الغذاء. تم تغذية الذباب بالطعام المصبغ لمدة 30 دقيقة وتشريحه على الفور للكشف عن كمية الصبغة في المحصول والأمعاء باستخدام القياس الطيفي. كما هو مبين في الشكل 2A، فإن كميات الصبغة الزرقاء في محاصيل السيطرة وطفرات nprl2 كانت متشابهة ، بما يتفق مع حجم المحاصيل المقارنة التي تم الإبلاغ عنها سابقًا8. وكان المسوخ nprl2 أقل صبغ في القناة الهضمية، والتي قد تكون مرتبطة مع انخفاض معدل الانكماش(الشكل 2B).
الشكل 1: اختلاف انكماش المحاصيل بين السيطرة والذكور المتحولين منprl2. تم تشريح الذباب الذكور البالغ من العمر 3 أيام ، وتم حساب معدل انكماش المحاصيل. يتم عرض تكرار انكماش المحاصيل لكل ذبابة كنقطة بيانات. تمثل أشرطة الخطأ SD من نقطة البيانات المشار إليها. ، P < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الفرق توزيع الغذاء بين الذكور التحكم وprl2 متحولة بعد وقت تغذية قصيرة. تم تغذية الذباب الذكور البالغ من العمر 3 أيام بطعام يحتوي على صبغة زرقاء بنسبة 0.5٪ لمدة 30 دقيقة ثم تم تشريحه على الفور للكشف عن كمية الصبغة. (أ) كمية الصبغة في المحصول. (ب) كمية الصبغة في الأمعاء دون محصول. **، P < 0.01; NS، ليست كبيرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول التكميلي 1: البيانات الأصلية لانكماش المحاصيل المستخدمة في الشكل 1. Please click here to download this table.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في دروسوفيليا المواد الغذائية بلعها ينتقل من المحاصيل إلى الأمعاء للهضم. خلال هذه العملية، يتم امتصاص المواد الغذائية، ويتم طرد النفايات من الجسم كبراز. وهكذا، يمكن استخدام مقارنة ابتلاع الطعام مع طرد البراز لتقييم سرعة حركة الطعام في الجسم تقريبًا. طريقة تغذية الشعيرات الدموية (CAFE) تستخدم على نطاق واسع لقياس ابتلاع المواد الغذائية10،11. يمكن استخدام طريقة العد عدد البراز لتقدير كمية خلق البراز12. ومع ذلك، فإن حركة الغذاء في الجسم Drosophila تحت سيطرة العديد من العوامل، بما في ذلك حركية المحاصيل. لا يمكن تقييم وظيفة المحاصيل بسهولة باستخدام أساليب حساب الـ CAF والبراز. هذا البروتوكول يمكن أن تقيم كميا حركية المحاصيل والطعام passaging من المحاصيل إلى الأمعاء في Drosophila.
حركية المحاصيل أمر ضروري لتجمّع الطعام والبقاء على قيد الحياة Drosophila. بعض الطفرات الجينية أو التهابات الفيروسات التي تؤثر على وظيفة المحاصيل نتيجة انخفاض عمر7،13،14. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص وتقييم المسوخ والعقاقير التي تؤثر على حركة المحاصيل. ويستخدم عد انكماش المحاصيل للكشف عن تواتر حركية المحاصيل ويستخدم قياس الطيفي لتوزيع الأغذية في المحاصيل والأمعاء للتنبؤ بكفاءة الحركة المحصولية. هذه طريقتين من السهل تنفيذ وحساسة للغاية. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل طريقة قياس الطيفي للكشف عن استخدام المواد الغذائية في Drosophila. على سبيل المثال، يمكن تقييم تناول الطعام في غضون فترة زمنية قصيرة عن طريق الكشف عن كمية الصبغة في الأمعاء بأكملها. يمكن تقييم حالة توزيع الطعام المستمر بين المحاصيل والأمعاء عن طريق الكشف عن كميات الصبغة في الذباب التي تتغذى على أغذية الصبغة لبضعة أيام.
وهناك بعض الاعتبارات التقنية في هذا البروتوكول. لأسلوب عد انكماش المحاصيل ، فمن الضروري تشريح واخراج المحاصيل بعناية في العازلة برنامج تلفزيوني. محلول ملحي ليس البيئة الفسيولوجية للمحصول. يجب أن يبقى المحصول متصلاً بالجسم، ويجب أن تكون الذبابة حية ومستيقظة؛ وإلا، فإن المحصول يفقد القدرة على التعاقد. ويقترح أن عد تقلص المحاصيل في الذباب سليمة وكذلك13. بالنسبة لطريقة القياس الطيفي ، ينبغي فصل المحاصيل عن GI المُحلَّق ونقلها إلى طبق 96 بئرًا بعد تغذية صبغة الطعام بعناية وسرعة. يتم استخدام الصبغة للإشارة إلى كمية الطعام في المحاصيل والأمعاء. أثناء عملية التشريح، يجب أن يكون المحصول والأمعاء على اتصال. إذا تسربت الصبغة إلى وسائط التشريح، لا يمكن استخدام العينة. مع الممارسة، فني المهرة يمكن الانتهاء من تشريح وفصل المحاصيل في غضون 30 s.
سابقا، كانت تستخدم هذه الأساليب لتقييم حركة المحاصيل في 15 يوما nprl2 الذباب المتحولة التي قد تضخم المحاصيل8. وفي هذه الحالة، تم تحديد كمية انكماش المحاصيل وتوزيع الأغذية في طفرات nprl2 التي يبلغ عمرها 3 أيام مع حجم المحاصيل الطبيعي. بما يتفق مع انخفاض معدل تقلص المحاصيل، عرضت المسوخ nprl2 صبغة غذائية أقل في الأمعاء. هذه النتائج تشير إلى أن المسوخ nprl2 لديها بعض العيوب في حركة المحاصيل حتى في سن مبكرة. تم استخدام خلفية yw كتحكم نوع البرية لأنها الخلفية الوراثية من متحولة nprl2. لتجارب أخرى، سلالات مثل كانتون S و W118، قد تستخدم كضوابط. مجموعات أخرى استخدام حل تشريح مختلفة (123 mM NaCl، 2 MM KCl، 1.8 mM CaCl2،8 mM MgCl2،35.5 mM السكروز، pH = 7.1) للكشف عن انكماش المحاصيل13،,14،,15. معدل تقلص المحاصيل الموجود في الذباب المسيطر في هذه الدراسة أقل من المعدل الذي أبلغ عنه سولاري وآخرون15، ولكنه أعلى من Chtarbanova et al.14 و Pellerوآخرون. قد يكون سبب هذا الاختلاف من الخلفيات الجينية المختلفة أو وسائل التشريح.
في كل شيء، يمكن استخدام قياس الطيف الطيفي للصبغة الزرقاء مع انكماش المحاصيل بكفاءة لتقييم حركة المحاصيل. البروتوكول المقدم هنا يساعد على جعل دروسوفيليا نموذجا جيدا لدراسة علم وظائف الأعضاء الجهاز الهضمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31872287)، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (NO. BK20181456) وستة ذروة المواهب المشروع في مقاطعة جيانغسو (رقم SWYYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
