Summary
该协议的目标是测量作物收缩和量化食物分布在果蝇肠道。
Abstract
大多数动物使用胃肠道（GI）来消化食物。摄入的食物在胃肠道的运动对营养吸收至关重要。紊乱的GI运动和胃排空导致多种疾病和症状。作为一种强大的基因模型生物体，果蝇可用于GI运动性研究。D罗友病作物是一种器官，它收缩并移动食物进入中腹，以便进一步消化，其功能类似于哺乳动物的胃。介绍是一种使用简单测量工具研究果蝇作物动性的协议。介绍了一种计算作物收缩以评估作物运动性的方法，以及一种利用分光光度计检测作物和肠道之间染蓝色食物分布的方法，以调查作物对食物传传的影响。该方法用于检测控制与nprl2突变苍蝇在作物运动性上的差异。该协议既具有成本效益，又对作物的动性高度敏感。
Introduction
大多数动物有一个消化管称为胃肠道（GI），以吸收来自环境的能量和营养。人类胃肠道由四个部分组成：食道、胃、小肠和大肠（结肠）。从胃到肠的食物通道对营养吸收至关重要。一些影响因素，如老化，有毒药物和感染，导致胃肠道运动障碍和胃排空，这与一些疾病及其症状，如消化不良，胃食管反流病，便秘1。
果蝇（果蝇黑色素）是生物医学研究中广泛使用的模型动物，因为它易于基因操作。重要的是，大约77%与人类疾病相关的基因在果蝇2中具有同源性。使用果蝇的研究在了解许多疾病机制方面取得了巨大的进展。作为一种强大的遗传模型生物体，果蝇在胃肠道研究中得到了广泛的应用。果蝇有一个更简单的消化道，分为三个离散域：前脑、中生道和后脑4。作物是前种的一部分，是一个袋式结构，作为摄入食物储存的场地。中肠是一个长管，作为食物消化和营养吸收的站点，通过上皮层，其中包括吸收性肠细胞（CS）和分泌肠分泌细胞5。有趣的是，果蝇的胃功能分为两部分：作物功能作为食物储存和铜细胞区（CCR）是一个高酸性区域与pH <3 6。在果蝇，摄入的食物最初被转移到作物，然后泵入中果7。因此，作物在食物传传中起着至关重要的作用。被内脏肌肉包裹，由一系列复杂的阀门和括约肌组成，作物不断收缩，将食物移动到中游，以作进一步消化。
该协议允许检测食物从作物到中游的果蝇运动。通过计算作物收缩频率来评估作物收缩。此外，通过检测作物和肠道之间的食物分布，对作物对食物传通的影响进行了调查。此外，食物分配可用于反映使用不同喂养期的直接食物运动或基本食物状况。综合起来，该协议提供了快速评估作物运动性和食物传通性的方法。
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Protocol
1. 维护和准备实验苍蝇
- 在25°C的孵化器中，在含有10 mL新鲜食物（1%agar，2.4%的啤酒酵母，3%蔗糖，5%玉米粉）的培养箱中保持苍蝇，湿度为60%。将培养箱的光循环设置为 12 小时光：12-h 暗。
- 为了确保大量所需的基因型苍蝇同时出现，培养幼蝇（1~3天大）在标准食品中，表面有干酵母，3天。将成人转移到一个新的食物小瓶与标准食品，包括湿酵母，2天，让产卵。将卵子留在孵化器中，以发育和转移成年苍蝇到新瓶收集更多的卵子。
- 每天收集被围住的雄蝇或雌蝇，并在标准食品的维护条件下用标准食物培养它们，达到所需的年龄。
注：为了得到更多的同龄苍蝇，可以同时设置所需基因型的多个小瓶。成人苍蝇养殖的小瓶应每3~5天更换一次。
2. 计算作物收缩
- 用CO2对苍蝇进行麻醉，将一只苍蝇放入含有200μL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH = 7.4）的解剖板井中，这些盐由136.89 mM NaCl、2.67 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4和 1.76 mM KH2PO4 组成。
- 用一对钳子抓住它的胸，用另一对钳子平稳地打开胸部，然后用相反的方向拉端打开腹部。小心地把庄稼和肠道从身体里拿出来。
- 等待苍蝇醒来，然后可视化作物，并在 1 分钟内计算其收缩次数。
注：作物叶上只有一个完整的波算作一次收缩。 - 在 30 s 间隔之间重复步骤 2.3 5 倍。
- 计算每分钟作物收缩的平均数。
注：在收缩计数期间，苍蝇应是活的，并且肠道应完好无损，并在解剖后附着在它的前部和后部。
3. 准备染色食品
- 在PBS中，以20%（w/v）的浓度称重和溶解PBS中的蓝色染料（材料表）。
- 在食品冷却过程中，将 20% 的蓝色染料加入煮沸液体维护食品（步骤 1.1），稀释 1：40 至最终浓度为 0.5%（w/v）。
注：蓝色染料在食物冷却前加入，并很好地与搅拌混合。在PBS中溶解蓝色染料是可选的;蒸馏水也适用。
4. 用染色食物喂养苍蝇
- 将一组同年龄苍蝇转移到小瓶与饥饿的食物（1%的阿加在蒸馏水中）4小时，以确保食物的摄入量。
- 将苍蝇转移到新小瓶与食物染成蓝色，培养苍蝇在期望的时间。
注：喂食时间是一个关键因素，取决于研究目的。在食物通过时，短喂养可以用来评估从作物到肠道的食物运动速度。在维护条件下，食物大约在2小时内通过。但是，通过的时间可能与文化条件有关。长喂养，最多几天，可用于评估作物和肠道之间的持续食物分布状态。
5. 解剖苍蝇，收集作物和肠道中的染料样本
- 用CO2对苍蝇进行麻醉，将一只苍蝇放入含有200μL1x PBS的解剖板井中。
- 用一对钳子抓住苍蝇的胸部，用另一对钳子把头从身上拿开。将剩余主体移动到包含 200 μL 1x PBS 的新井。
- 用一对钳子在 200 μL 的 1x PBS 中轻轻摇动身体 2x，以清洁附着在苍蝇身上的染料。
- 用两对钳子轻轻、平稳地打开腹部，小心地将整个肠道与身体分开。
- 小心地从整个肠道中脱下作物，并放入 100 μL 的 1x PBS 的管子中。
- 最后，把整个肠道没有作物（以下简称肠道）在另一管与100μL的1xPBS。
- 使用移液器尖端在管中分别研磨作物和肠道，使染料溶解在 PBS 中。
- 重复步骤 5.1~5.7，直到为设计的实验收集足够的作物和胆量。
注：作物和肠道应完全均匀化，所有染料应溶解在缓冲液中。出于研究目的，一个或多个作物或胆量可以收集在一个管中。
6. 计算作物和肠道中的染料量
- 以最高速度离心样品管 1 分钟，将 90 μL 的上流液转移到 96 孔板的孔中。
- 以 1 x 10-7 g/mL 到1 x 10-4 g/mL 的浓度进行一系列蓝色染料稀释。
- 在 96 孔板的油井中加入一系列 90 μL 标准。
- 使用板分光光度计在 630 nm 下测量样品和标准的吸光度。
- 要创建标准曲线，请绘制每个标准的吸光度与浓度的线图。然后通过点绘制一条最佳拟合线，以获得用于计算样品中染料浓度的方程。
- 通过将样品浓度乘以 0.1 mL 来计算染料量。
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Representative Results
这些计算作物收缩率和检测染色食物分布的方法可用于评估作物对食物活力的功能。作物收缩反映了将食物推入肠道的频率。短喂养期后，染料在苍蝇中的分布表明食物从作物直接从作物到中游。
拉帕霉素复合物1（TORC1）的目标是调节营养和细胞代谢的主调节器。TORC1抑制可延长许多生物体的寿命，包括果蝇。作为 TORC1 的抑制剂，nprl2 突变苍蝇表现出 TORC1 和 GI 消化缺陷8、9的超活化。nprl2突变体中的作物大小在3天大时是正常的，在15天大时扩大，相比之下，其遗传背景控制（yw）8。为了评估作物运动性测定，使用了3天大的nprl2突变苍蝇和yw对等控制。每种作物被计算五次，并使用平均值（补充表1）。五次重复期间作物收缩的数量相似，这表明PBS可能不会在短期喂养中影响作物生理，并适合作物收缩计数。nprl2突变显著降低作物收缩率（图1）。
与哺乳动物的胃相似，果蝇作物不断收缩，将食物转移到肠道中。为了进一步确认Nprl2对作物的功能，检测出食物运动。用染色食物喂养苍蝇30分钟，并立即解剖，使用分光光度测量法检测作物和肠道中的染料量。如图2A所示，控制作物和nprl2突变体中的蓝色染料量相似，与先前报告的可比作物大小8一致。nprl2突变体在肠道中的染料较少，这可能与收缩率降低有关（图2B）。
图1：控制与nprl2突变雄性之间的作物收缩差异。对3天大的雄蝇进行了解剖，计算了作物收缩率。每个苍蝇的作物收缩频率显示为数据点。错误条表示来自指示的数据点中的 SD。， P < 0.001.请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在短暂的喂养时间后，对照组和nprl2突变雄性之间的食物分布差异。3天大的雄性苍蝇被喂食含有0.5%蓝色染料的食物30分钟，然后立即解剖，以检测染料量。（A） 作物中的染料量。（B） 肠道中没有作物的染料量。**， P < 0.01;NS ，不重要。请单击此处查看此图的较大版本。
补充表1：图1中使用的作物收缩.的原始数据，请点击这里下载此表。
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Discussion
在果蝇中，摄入的食物从作物转移到肠道进行消化。在这个过程中，营养物质被吸收，废物被排出体外作为粪便。因此，将食物摄入与粪便喷射进行比较，可以大致评估食物在体内运动的速度。毛细管喂食器（CAFE）的方法被广泛用于测量食物摄入10，11。10,粪便数计数方法可用于估计粪便的产生量12。然而，果蝇体内的食物运动受到许多因素的控制，包括作物的动性。使用 CAFE 和粪便计数方法无法轻松评估裁剪函数。该协议可以定量地评估作物的动能和食物从作物到肠道在果蝇。
作物活动对于食物传传和果蝇生存至关重要。一些影响作物功能的基因突变或病毒感染导致寿命缩短7，13，14。,13,14该协议可用于筛选和评估影响作物活动性突变体和药物。作物收缩计数用于检测作物活动频率，用于测量作物和肠道中食物分布的分光光度测量法预测作物活动效率。这两种方法易于执行，并且高度敏感。此外，可以修改分光光度测量方法，以检测果蝇中的食品使用情况。例如，可以通过检测整个肠道中的染料量来评估短时间的食物摄入。通过检测用染料食物喂养的苍蝇中的染料量，可以评估作物和肠道之间的连续食物分布状态。
此协议中有几个技术注意事项。对于作物收缩计数方法，在PBS缓冲液中仔细解剖和切除了作物是十分必要的。盐水溶液不是作物的生理环境。作物必须保持与身体的联系，苍蝇必须活着和清醒;否则，作物将失去收缩能力。建议计算作物收缩在完好无损的苍蝇以及13。对于分光光度测量方法，应仔细、快速地将作物从解剖GI中分离并转移到96井板中。染料用于指示作物和肠道中的食物量。在解剖过程中，作物和肠道应接触。如果染料泄漏到解剖介质中，则不能使用样品。通过实践，熟练的技术人员可以在30天内完成解剖和作物分离。
此前，这些方法被用来评估15天大的nprl2突变苍蝇的作物运动能力，这些苍蝇已经扩大作物8。在这种情况下，对3天大的nprl2突变体中具有正常作物大小的作物收缩和食物分配进行量化。与作物收缩率降低一致，nprl2突变体在肠道中表现出较少的食物染料。这些结果表明，nprl2突变体在作物运动性方面甚至年轻时也有一些缺陷。yw背景被用作野生类型控制，因为它是nprl2突变体的基因背景。对于其他实验，像广州S和w118这样的菌株可以用作对等控制。 w其他组使用不同的解剖溶液（123 mM NaCl，2 mM KCl，1.8 mM CaCl2，8mM MgCl 2，35.5 mM蔗糖，pH = 7.1）来检测作物收缩13，14，15。,14,152在这项研究中发现的对照蝇的作物收缩率低于S solari等人报告的结果，但高于Chtarbanova等人14和Peller等人13。这种差异可能是由不同的遗传背景或解剖介质引起的。
总之，蓝色染料分光光度法与作物收缩一起可用于有效评估作物的动量。这里介绍的协议有助于使果蝇成为胃肠道生理学研究的好模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（第31872287号）、江苏省自然科学基金（NO.BK20181456）和江苏省六大人才高峰项目（第1号SWYY-146）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
