Summary
Målet med denne protokol er at måle afgrøde sammentrækning og kvantificere fødevaredistribution i Drosophila gut.
Abstract
De fleste dyr bruger mave (GI) tarmkanalen til at fordøje mad. Bevægelsen af den indtagede mad i mave-tarmkanalen er afgørende for optagelse af næringsstoffer. Uorganiseret GI motilitet og gastrisk tømning forårsage flere sygdomme og symptomer. Som en kraftfuld genetisk model organisme, Drosophila kan bruges i GI motilitet forskning. Drosophila afgrøde er et organ, der kontrakter og flytter mad ind i midgut for yderligere fordøjelse, funktionelt ligner et pattedyr mave. Præsenteret er en protokol til at studere Drosophila afgrøde motilitet ved hjælp af simple måleværktøjer. En metode til optælling af afgrødesammentrækninger til vurdering af afgrødemotilitet og en metode til påvisning af fordelingen af fødevarer farvet blå mellem afgrøden og tarmen ved hjælp af et spektrofotometer til at undersøge afgrødens indvirkning på madpasning er beskrevet. Metoden blev anvendt til at påvise forskellen i afgrødemotilitet mellem kontrol- og nprl2-mutantfluer. Denne protokol er både omkostningseffektiv og meget følsom over for afgrøde motilitet.
Introduction
De fleste dyr har et fordøjelsesrør kaldet mave (GI) tarmkanalen til at absorbere energi og næringsstoffer fra miljøet. Den menneskelige mave-tarmkanalen er sammensat af fire dele: spiserøret, mave, tyndtarmen, og tyktarmen (tyktarmen). Mad passage fra maven til tarmen er afgørende for optagelse af næringsstoffer. Nogle effektorer, såsom aldring, giftige stoffer, og infektion, forårsage uordnede mave-tarmkanalen motilitet og gastrisk tømning, som er relateret til nogle sygdomme og deres symptomer såsom dyspepsi, gastroøsofageal refluks sygdom, og forstoppelse1.
Frugtfluen(Drosophila melanogaster)er et udbredt modeldyr i biomedicinsk forskning på grund af sin nemme genetiske manipulation. Vigtigere, omkring 77% af gener forbundet med sygdomme hos mennesker har en homolog i Drosophila2. Forskning ved hjælp af Drosophila har gjort enorme fremskridt i vores forståelse af mange sygdomsmekanismer. Som en kraftfuld genetisk model organisme, Drosophila er meget udbredt i mave-tarmkanalen forskning3. Drosophila har en enklere fordøjelseskanalen, som er opdelt i tre diskrete domæner: foregut, midgut, og hindgut4. Afgrøden, en del af foregut, er en pose-lignende struktur, der tjener som et sted for indtages opbevaring af fødevarer. Midgut er et langt rør og fungerer som stedet for fordøjelse af fødevarer og næringsstof absorption gennem epitellaget, som består af absorptive enterocytter (ECs) og sekretoriske enteroendokrine (EE) celler5. Interessant, maven funktion i Drosophila er opdelt i to dele: afgrøden fungerer som opbevaring af fødevarer og kobbercelle region (CCR) er en meget sur region med en pH < 36. I Drosophilaflyttes den indtagede mad i første omgang til afgrøden og pumpes derefter ind i midgut7. Således afgrøden spiller en afgørende rolle i fødevarer passaging. Indhyllet af viscerale muskler og bestående af en kompleks vifte af ventiler og lukkemuskel, afgrøden holder ordregivende og flytte mad ind i midgut for yderligere fordøjelse.
Denne protokol giver mulighed for påvisning af fødevarer bevægelse fra afgrøden til midgut i Drosophila. Beskæring evalueres ved at tælle afgrødesammentrækningsfrekvensen. Desuden undersøges afgrødens indvirkning på overpasning af fødevarer ved påvisning af fødevarefordelingen mellem afgrøde og tarm. Desuden kan fødevaredistributionen bruges til at afspejle øjeblikkelig fødevarebevægelse eller grundlæggende fødevarestatus ved hjælp af forskellige fodringsperioder. Tilsammen giver denne protokol metoder til hurtigt at evaluere afgrøde motilitet og mad passaging i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedligeholdelse og forberedelse af forsøgsfluer
- Vedligehold fluer i hætteglas indeholdende 10 ml frisklavet mad (1% agar, 2,4% ølgær, 3% saccharose, 5% majsmel) i en inkubator ved 25 °C med 60% fugtighed. Indstil inkubatorens lyscyklus til 12-h lys:12-h mørk.
- For at sikre, at et stort antal af de ønskede genotypefluer ekskluderer samtidigt, flyver kultur unge (1-3 dage gamle) i standardfødevarer med tørgær på overfladen i 3 dage. Overfør de voksne til en ny fødevare hætteglas med standard mad, herunder vådgær, i 2 dage til at tillade æglægning. Lad æggene i kuvøsen til at udvikle og overføre voksne fluer til et nyt hætteglas til at indsamle flere æg.
- Saml de e lukkede han- eller hunfluer hver dag, og dyrkning dem i nye hætteglas med standardmad i vedligeholdelsestilstand til den ønskede alder.
BEMÆRK: For at få flere samme aldersfluer kan der opstilles flere hætteglas med den ønskede genotype samtidigt. Hætteglassene til voksenfluekultur bør skiftes hver 3-5 dag.
2. Optælling af afgrødesammentrækninger
- Anesthetize fluerne med CO2 og tage en flue ind i en dissekere plade brønd indeholdende 200 μL af 1x fosfat buffered saltvand (PBS, pH = 7,4) bestående af 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4og 1,76 mM KH2PO4.
- Tag fat i fluen ved hjælp af et par pincet, åbn brystkassen jævnt ved hjælp af et andet pincetparre, og træk derefter enden i modsatte retninger for at åbne maven. Tag afgrøden og tarmen ud fra kroppen omhyggeligt.
- Vent til fluen at vågne op og derefter visualisere afgrøden og tælle antallet af gange det kontrakter i 1 min.
BEMÆRK: Kun en komplet bølge på kornapperne tælles som én sammentrækning. - Trin 2.3 gentages for 5x mellem 30 s intervaller.
- Beregn det gennemsnitlige antal afgrødesammentrækninger per minut.
BEMÆRK: Under sammentrækningstællingen skal fluen være i live, og tarmen skal være intakt og fastgøres i dens forreste og bageste ender efter dissektion.
3. Tilberedning af farvet mad
- Det blå farvestof (Materialetabel) afvejesog opløses i PBS med en koncentration på 20% (w/v).
- Tilsæt det 20% blå farvestof i den kogte væskevedligeholdelsesføde (trin 1.1) med en 1:40 fortynding til en endelig koncentration på 0,5% (w/v) under fødevarekølingsprocessen.
BEMÆRK: Det blå farvestof tilsættes, før maden køles af og blandes godt under omrøring. Det er valgfrit at opløse det blå farvestof i PBS; destilleret vand er også egnet.
4. Fodring fluer med farvet mad
- Overfør grupper af samme-alderen fluer til hætteglassene med sult mad (1% agar i destilleret vand) i 4 timer for at sikre fødeindtagelse.
- Overfør fluerne til nye hætteglas med mad farvet blå og kultur fluerne for den ønskede tid.
BEMÆRK: Fodringstiden er en kritisk faktor og afhænger af forskningsformålet. Kort fodring, inden for den tid af fødevarer, der passerer igennem, kan bruges til at vurdere hastigheden af fødevarer motilitet fra afgrøde til tarm. Ved vedligeholdelsesforhold passerer maden igennem i ca. 2 timer. Men tidspunktet for at passere igennem kan være relateret til kulturforhold. Lang fodring, op til et par dage, kan bruges til at vurdere vedvarende fødevaredistribution status mellem afgrøde og tarm.
5. Dissekere fluer og indsamling af farveprøver i afgrøde og tarm
- Anesthetize fluerne med CO2 og tage en flue ind i en dissekere plade godt indeholder 200 μL af 1x PBS.
- Tag fat i fluen ved hjælp af et par pincet og tag hovedet af kroppen ved hjælp af et andet par pincet. Flyt den resterende krop til en ny brønd indeholdende 200 μL 1x PBS.
- Kroppen vaskes 2x ved forsigtigt at ryste den i 200 μL 1x PBS ved hjælp af et par pincet til at rense det farvestof, der er fastgjort til flyvelegemet.
- Forsigtigt og glat åbne maven ved hjælp af to par pincet og forsigtigt adskille hele tarmen fra kroppen.
- Tag forsigtigt afgrøden af hele tarmen og læg den i et rør med 100 μL 1x PBS.
- Til sidst anbringes hele tarmen uden afgrøde (i det følgende benævnt tarm) i et andet rør med 100 μL 1x PBS.
- Slibe afgrøden og tarmen henholdsvis i rør ved hjælp af pipette tips til at gøre farvestoffet opløses i PBS.
- Gentag trin 5.1−5.7, indtil der indsamles nok afgrøder og indvolde til det eksperiment, der er designet.
BEMÆRK: Afgrøden og tarmen skal homogeniseres fuldt ud, og alt farvestof skal opløses i bufferen. Til forskningsformål kan en eller flere afgrøder eller indvolde opsamles i ét rør.
6. Beregning af farvestofmængder i afgrøde og tarm
- Prøverørene centrifugeres ved den højeste hastighed i 1 min, og 90 μL supernatant overføres til brøndene på en 96 brøndplade.
- Lav en række blå farvestoffortyndinger ved koncentrationer fra 1 x 10-7 g/ml til 1 x 10-4 g/ml som standarder.
- Der tilsættes en serie på 90 μL standarder til 96 brøndene på 96 brøndpladen.
- Prøvernes og standardernes absorbans måles ved 630 nm med et pladespektrofotometer.
- Hvis du vil oprette en standardkurve, skal du afbilde en kurvegraf for absorbans i forhold til koncentrationen for hver af standarderne. Tegn derefter en linje af bedste pasform gennem punkterne for at få ligningen brugt til at beregne farvestofkoncentrationen i prøverne.
- Mængden af farvestof beregnes ved at multiplicere prøvekoncentrationen med 0,1 ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse metoder til at tælle afgrøde sammentrækning sats og opdage farvet fødevarer distribution kan bruges til at evaluere afgrøde funktion på fødevarer motilitet. Afgrøden sammentrækning afspejler hyppigheden af at skubbe fødevarer i tarmen. Fordelingen af farvestof i fluen efter en kort fodringsperiode indikerer øjeblikkelig madpassaging fra afgrøde til midgut.
Mål for rapamycin kompleks 1 (TORC1) er en mester regulator, der formidler næringsstoffer og cellemetabolisme. TORC1 hæmning forlænger levetiden i mange organismer, herunder Drosophila. Som hæmmer af TORC1 viser nprl2-mutantfluen hyperaktivering af TORC1- og GI-fordøjelsesdefekter8,9. Afgrødestørrelsen i en nprl2-mutant er normal ved 3 dage gammel og forstørret ved 15 dage gammel sammenlignet med dens genetiske baggrundskontrol (yw)8. For at vurdere afgrødemotilitetsanalysen blev der anvendt 3 dage gamle nprl2-mutantfluer og yw-kontroller. Hver afgrøde blev optalt fem gange, og gennemsnitsværdien blev anvendt (supplerende tabel 1). Antallet af afgrødesammentrækning i løbet af de fem gentagelser var ens, hvilket tyder på, at PBS måske ikke påvirker afgrødefysiologien i korte fodringer og er egnet til tælling af afgrøder. Nprl2-mutationen reducerede afgrødesammentrækningshastigheden betydeligt (figur 1).
Svarende til pattedyr mave, Drosophila afgrøde holder ordregivende at flytte maden ind i tarmen. For yderligere at bekræfte Nprl2's funktion på afgrøden blev der fundet en fødevarebevægelse. Fluerne blev fodret med farvet mad i 30 min og dissekeret straks at opdage mængden af farvestof i afgrøden og tarmen ved hjælp af spektrofotometri. Som vist i figur 2Avar de blå farvestofmængder i kontrolafgrøderne og nprl2-mutanterne ens i overensstemmelse med den tidligere indberettede sammenlignelige afgrødestørrelse8. Nprl2-mutanterne havde mindre farvestof i tarmen, hvilket kan være forbundet med den faldende sammentrækningsrate (Figur 2B).
Figur 1: Forskel i afgrødesammentrækning mellem mutanthanner med kontrol og nprl2. De 3-dages gamle hanfluer blev dissekeret, og afgrødesammentrækningsraten blev talt. Afgrødesammentrækningsfrekvensen for hver flue vises som et datapunkt. Fejllinjer repræsenterer SD fra det angivne datapunkt. , P < 0.001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Forskellen i fordelingen af fødevarer mellem de mutante hanner i kontrol og nprl2 efter kort fodringstid. De 3-dages gamle hanfluer blev fodret med mad, der indeholdt 0,5% blåt farvestof i 30 min og derefter dissekeret straks at opdage farvestofmængden. (A) Farvestofmængden i afgrøden. (B) Farvestofmængden i tarmen uden afgrøde. **, P < 0,01; NS, ikke signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1: De oprindelige data for afgrødesammentrækning, der anvendes i figur 1. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I Drosophila indtages mad bevæger sig fra afgrøden til tarmen for fordøjelsen. Under denne proces, er næringsstofferne absorberes, og affaldet er udvist ud af kroppen som afføring. Således, sammenligne mad indtagelse sammen med afføring udslyngning kan bruges til groft at vurdere hastigheden af fødevarer bevægelse i kroppen. Metoden til kapillær feeder (CAFE) er almindeligt anvendt til at måle mad indtagelse10,11. Metoden til afføring nummer optælling kan bruges til at vurdere mængden af afføring skabelse12. Men, fødevarebevægelsen i Drosophila kroppen er under kontrol af mange faktorer, herunder afgrøde motilitet. Afgrødefunktionen kan ikke let evalueres ved hjælp af CAFE og fæces tælle metoder. Denne protokol kan kvantitativt evaluere afgrøde motilitet og fødevarer passaging fra afgrøde til tarm i Drosophila.
Crop motilitet er afgørende for fødevarer passaging og Drosophila overlevelse. Nogle genmutationer eller virusinfektioner, der påvirker afgrødefunktionen, resulterer i nedsat levetid7,13,14. Denne protokol kan bruges til at screene og evaluere mutanter og lægemidler, der påvirker afgrødemilitet. Dyrkningssammentrækningstællingen bruges til at detektere afgrødemotilitetsfrekvens, og spektrofotometrien, der måler fødevarefordeling i afgrøde og tarm, bruges til at forudsige afgrødemotilitetseffektiviteten. Disse to metoder er nemme at udføre og meget følsomme. Endvidere, spektrofotometri metode kan ændres til at opdage fødevarebrug i Drosophila. For eksempel kan indtagelse af fødevarer inden for kort tid evalueres ved at detektere farvestofmængden i hele tarmen. Den kontinuerlige fødevaredistributionsstatus mellem afgrøde og tarm kan vurderes ved at påvise farvestofmængderne i de fluer, der fodres med farvestoffødevarer i nogle dage.
Der er et par tekniske overvejelser i denne protokol. For metoden til optælling af afgrøder er det vigtigt at dissekere og tage afgrøden forsigtigt ud i PBS-buffer. Saltvandsopløsning er ikke afgrødens fysiologiske miljø. Afgrøden skal forblive forbundet til kroppen, og fluen skal være i live og vågen; Ellers mister afgrøden evnen til at indgå kontrakt. Det foreslås at tælle afgrøde sammentrækning i intakte fluer samt13. For spektrofotometrimetoden bør adskillelsen af afgrøderne fra den dissekerede geografiske betegnelse og deres overførsel til en 96 brøndplade efter fodring af foderstofstoffer ske omhyggeligt og hurtigt. Farvestoffet bruges til at angive mængden af mad i afgrøden og tarmen. Under dissektionsprocessen skal afgrøden og tarmen være i kontakt. Hvis farvestoffet lækker ind i dissektionsmediet, kan prøven ikke anvendes. Med praksis, kan en dygtig tekniker afslutte dissektion og afgrøde adskillelse inden for 30 s.
Tidligere blev disse metoder anvendt til at vurdere afgrødemiliteten i 15 dage gamle nprl2-mutantfluer, der havde forstørrede afgrøder8. I dette tilfælde blev afgrødesammentrækning og fødevaredistribution i 3-dages gamle nprl2-mutanter med normal afgrødestørrelse kvantificeret. I overensstemmelse med den reducerede afgrødesammentrækningsrate viste nprl2-mutanterne mindre næringsstof i tarmen. Disse resultater tyder på, at nprl2 mutanter har nogle defekter i afgrødemotilitet selv i en ung alder. YW-baggrunden blev brugt som en vild typekontrol, fordi den er den genetiske baggrund for nprl2-mutanten. For andre eksperimenter, stammer som Canton S og w118, kan anvendes som kontrol. Andre grupper anvender en anden dissekeringsopløsning (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2,8 mM MgCl2,35,5 mM saccharose, pH = 7,1) til påvisning af afgrødesammentrækning13,,14,15. Den faldende afgrøde, der findes i kontrolfluerne i denne undersøgelse , er lavere end den , der er rapporteret af Solari et al.15, men højere end Chtarbanova et al.14 og Peller et al.13. Denne forskel kan være forårsaget af de forskellige genetiske baggrunde eller dissektion medier.
I alt kan blå farvestofspektrofotometri sammen med afgrødesammentrækning effektivt bruges til at evaluere afgrødemotilitet. Protokollen præsenteres her hjælper med at gøre Drosophila en god model for mave-tarmkanalen fysiologi undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) og Seks talent toppe projekt i Jiangsu-provinsen (Nr. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
