Summary
Het doel van dit protocol is om gewascontractie te meten en de voedseldistributie in de Drosophila darm te kwantificeren.
Abstract
De meeste dieren gebruiken het maag-darmkanaal (GI) om voedsel te verteren. De beweging van het ingenomen voedsel in het DARM-darmkanaal is essentieel voor de opname van voedingsstoffen. Wanordelijke GI beweeglijkheid en maaglediging veroorzaken meerdere ziekten en symptomen. Als een krachtig genetisch model organisme, Drosophila kan worden gebruikt in GI beweeglijkheid onderzoek. De Drosophila gewas is een orgaan dat contracten en beweegt voedsel in de midgut voor verdere spijsvertering, functioneel vergelijkbaar met een zoogdier maag. Gepresenteerd is een protocol om Drosophila gewas beweeglijkheid te bestuderen met behulp van eenvoudige meetinstrumenten. Een methode voor het tellen van gewascontracties om de beweeglijkheid van gewassen te evalueren en een methode voor het detecteren van de verdeling van voedsel dat blauw geverfd wordt tussen het gewas en de darm met behulp van een spectrofotometer om het effect van het gewas op voedselpassages te onderzoeken, wordt beschreven. De methode werd gebruikt om het verschil in gewasmotiliteit tussen controle en nprl2 mutant vliegen te detecteren. Dit protocol is zowel kostenefficiënt als zeer gevoelig voor begroeiing.
Introduction
De meeste dieren hebben een spijsverteringsbuis genaamd het maag-darmkanaal (GI) om energie en voedingsstoffen uit de omgeving te absorberen. Het menselijke DARMKANAAL bestaat uit vier delen: de slokdarm, maag, dunne darm en dikke darm (dikke darm). Voedselpassage van de maag naar de darm is essentieel voor de opname van voedingsstoffen. Sommige effectoren, zoals veroudering, toxische drugs, en infectie, veroorzaken wanordelijke GI tract motility en maaglediging, die gerelateerd is aan sommige ziekten en hun symptomen zoals dyspepsie, gastro-oesofageale reflux ziekte, en constipatie1.
De fruitvlieg(Drosophila melanogaster)is een veel gebruikt modeldier in biomedisch onderzoek vanwege zijn eenvoudige genetische manipulatie. Belangrijk is dat ongeveer 77% van de genen geassocieerd met menselijke ziekte een homolog heeft in Drosophila2. Onderzoek met drosophila heeft enorme vooruitgang geboekt in ons begrip van vele ziektemechanismen. Als een krachtig genetisch model organisme, Drosophila wordt veel gebruikt in GI tract onderzoek3. Drosophila heeft een eenvoudiger spijsverteringskanaal, dat is verdeeld in drie afzonderlijke domeinen: voorgedeïntegreert, midgut, en hindgut4. Het gewas, een deel van de voorbegroe, is een zak-achtige structuur die dient als een site voor ingenomen voedselopslag. De midgut is een lange buis en functioneert als de site voor voedselvertering en opname van voedingsstoffen door de epitheellaag, die bestaat uit absorptieve enterocyten (ECs) en secretory enteroendocrine (EE) cellen5. Interessant is dat de maagfunctie in Drosophila is verdeeld in twee delen: het gewas functioneert als voedselopslag en het kopercelgebied (CCR) is een zeer zure regio met een pH < 36. In Drosophilawordt het ingenomen voedsel in eerste instantie naar het gewas verplaatst en vervolgens in de midgut7 gepompt. Zo speelt het gewas een cruciale rol in voedsel passaging. Gehuld door viscerale spieren en bestaande uit een complexe reeks kleppen en sluitspieren, het gewas houdt aanbestedende en bewegende voedsel in de midgut voor verdere spijsvertering.
Dit protocol maakt het mogelijk om voedselbewegingen te detecteren van het gewas naar de midgut in Drosophila. De krimp van gewassen wordt geëvalueerd door de frequentie van de gewascontractie te tellen. Daarnaast wordt het effect van het gewas op voedselpassaging onderzocht door de voedselverdeling tussen gewas en darmen op te sporen. Bovendien kan de voedseldistributie worden gebruikt om onmiddellijke voedselbeweging of basisvoedselstatus met behulp van verschillende voedingsperioden weer te geven. Samen, dit protocol biedt methoden om snel te evalueren gewas beweeglijkheid en voedsel passaging in Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud en voorbereiding van experimentele vliegen
- Houd vliegen in flesjes met 10 mL vers gemaakt voedsel (1% agar, 2,4% biergist, 3% sacharose, 5% maïsmeel) in een couveuse bij 25 °C met 60% vochtigheid. Stel de lichtcyclus van de couveuse in op 12-uur licht:12-h donker.
- Om ervoor te zorgen dat een groot aantal van de gewenste genotype vliegt gelijktijdig afgesloten, cultuur jonge vliegen (1−3 dagen oud) in standaard voedsel met droge gist op het oppervlak voor 3 dagen. Breng de volwassenen naar een nieuw voedsel flesje met standaard voedsel, waaronder natte gist, voor 2 dagen om het leggen van eieren mogelijk te maken. Laat de eieren in de couveuse om volwassen vliegen te ontwikkelen en over te brengen naar een nieuw flesje om meer eieren te verzamelen.
- Verzamel de uitgeschermde mannelijke of vrouwelijke vliegen elke dag en cultuur ze in nieuwe flesjes met standaard voedsel op de onderhoudstoestand op de gewenste leeftijd.
LET OP: Om meer vliegen van dezelfde leeftijd te krijgen, kunnen meerdere flesjes van het gewenste genotype tegelijkertijd worden ingesteld. De flesjes voor volwassen vliegcultuur moeten elke 3−5 dagen worden gewijzigd.
2. Samenlopend gewascontracties
- Verdoven de vliegen met CO2 en neem een vlieg in een ontleden plaatput met 200 μL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH = 7,4) bestaande uit 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4en 1,76 mM KH2PO4.
- Grijp de vlieg op zijn thorax met behulp van een pincet, open de thorax soepel met behulp van een ander pincet en trek het einde vervolgens in tegengestelde richting om de buik te openen. Neem het gewas en de darm uit het lichaam zorgvuldig.
- Wacht tot de vlieg wakker wordt en visualiseer het gewas en tel het aantal keren dat het contracteert in 1 min.
LET OP: Alleen een volledige golf op de gewaslobben wordt geteld als één samentrekking. - Herhaal stap 2.3 voor 5x tussen intervallen van 30 s.
- Bereken het gemiddelde aantal gewascontracties per minuut.
OPMERKING: Tijdens het tellen van de samentrekking moet de vlieg in leven zijn en moet de darm intact zijn en aan de voorste en achterste uiteinden na ontleding worden bevestigd.
3. Bereiding van geverfd voedsel
- Weeg en los de blauwe kleurstof(Tabel van materialen) in PBS op bij een concentratie van 20% (w/v).
- Voeg de 20% blauwe kleurstof toe aan het gekookte vloeibare onderhoudsvoedsel (stap 1.1) met een verdunning van 1:40 tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% (w/v) tijdens het voedselkoelingsproces.
LET OP: De blauwe kleurstof wordt toegevoegd voordat het voedsel afkoelt en goed gemengd met roeren. Het is optioneel om de blauwe kleurstof in PBS op te lossen; gedestilleerd water is ook geschikt.
4. Het voeren van vliegen met geverfd voedsel
- Breng groepen van dezelfde leeftijd vliegen naar de flesjes met honger voedsel (1% agar in gedestilleerd water) voor 4 uur om voedselinname te garanderen.
- Breng de vliegen naar nieuwe flesjes met voedsel geverfd blauw en cultuur de vliegen voor de gewenste tijd.
LET OP: De voedertijd is een kritische factor en is afhankelijk van het onderzoeksdoel. Korte voeding, binnen de tijd van voedsel passeren, kan worden gebruikt om de snelheid van voedsel beweeglijkheid van gewas tot darmen te evalueren. Bij de onderhoudsomstandigheden gaat het voedsel in ongeveer 2 uur over. De tijd van het passeren kan echter verband houden met cultuuromstandigheden. Lange voeding, tot een paar dagen, kan worden gebruikt om de permanente voedseldistributiestatus tussen gewas en darmen te evalueren.
5. Het ontleden van vliegen en het verzamelen van kleurstofmonsters in gewas en darmen
- Verdoven de vliegen met CO2 en neem een vlieg in een ontleden plaat goed met 200 μL van 1x PBS.
- Grijp de vlieg op zijn thorax met behulp van een pincet en neem het hoofd van het lichaam met behulp van een ander paar pincet. Verplaats het resterende lichaam naar een nieuwe put met 200 μL 1x PBS.
- Was het lichaam 2x door het zachtjes te schudden in 200 μL van 1x PBS met behulp van een pincet om de kleurstof aan het vlieglichaam schoon te maken.
- Open de buik voorzichtig en soepel met twee paar pincet en scheid zorgvuldig de hele darm van het lichaam.
- Haal het gewas voorzichtig uit de hele darm en stop het in een buis met 100 μL van 1x PBS.
- Ten slotte, zet de hele darm zonder gewas (hierna aangeduid als gut) in een andere buis met 100 μL van 1x PBS.
- Maal het gewas en de darm respectievelijk in buizen met behulp van pipet tips om de kleurstof op te lossen in de PBS.
- Herhaal stap 5.1−5.7 totdat er voldoende gewassen en ingewanden worden verzameld voor het ontworpen experiment.
LET OP: Het gewas en de darm moeten volledig gehomogeniseerd zijn en alle kleurstof moet in de buffer worden opgelost. Voor onderzoeksdoeleinden kunnen één of meerdere gewassen of ingewanden in één buis worden verzameld.
6. Berekening van de kleurstofhoeveelheden in gewas en darmen
- Centrifugeren de monsterbuizen op de hoogste snelheid gedurende 1 min en breng 90 μL supernatant over naar de putten van een 96 putplaat.
- Maak een reeks van blauwe kleurstof verdunningen bij concentraties van 1 x 10-7 g/mL tot 1 x 10-4 g/mL als normen.
- Voeg een serie van 90 μL normen toe aan de putten van de 96 putplaat.
- Meet de absorptie van de monsters en normen op 630 nm met een plaatspectrofotometer.
- Als u een standaardcurve wilt maken, stelt u een lijngrafiek van absorptie versus concentratie voor elk van de standaarden uit. Teken vervolgens een lijn van de beste pasvorm door de punten om de vergelijking gebruikt om de kleurstof concentratie in de monsters te berekenen.
- Bereken de hoeveelheid kleurstof door de monsterconcentratie te vermenigvuldigen met 0,1 mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methoden om gewas contractie tarief tellen en detecteren geverfd voedsel distributie kan worden gebruikt om gewas functie op voedsel beweeglijkheid te evalueren. De gewascontractie weerspiegelt de frequentie van het duwen van voedsel in de darm. De verdeling van kleurstof in de vlieg na een korte voedingsperiode geeft aan dat er onmiddellijk voedsel wordt doorgegeven van gewas tot midgut.
Doelwit van rapamycine complex 1 (TORC1) is een meester regulator die voedingsstoffen en celstofwisseling bemiddelt. TORC1-remming verlengt de levensduur bij veel organismen, waaronder Drosophila. Als remmer van TORC1 vertoont de nprl2 mutant fly hyperactivatie van TORC1 en GI-spijsverteringsdefecten8,9. De gewasgrootte in een nprl2 mutant is normaal op 3 dagen oud en vergroot op 15 dagen oud, in vergelijking met zijn genetische achtergrondcontrole (yw)8. Om de bemotiliteitstest te evalueren, werden 3 dagen oude nprl2 mutantvliegen en yw-controles gebruikt. Elk gewas werd vijf keer geteld en de gemiddelde waarde werd gebruikt(aanvullende tabel 1). De aantallen van de gewascontractie tijdens de vijf herhalingen waren vergelijkbaar, wat erop wijst dat PBS de gewasfysiologie in korte voedingen niet zou kunnen beïnvloeden en geschikt is voor het tellen van de gewascontractie. De nprl2-mutatie heeft de oogstkrimping aanzienlijk verminderd(figuur 1).
Net als bij de zoogdiermaag, de Drosophila gewas blijft samentrekken om het voedsel te verplaatsen in de darm. Om de functie van Nprl2 op het gewas verder te bevestigen, werd voedselbeweging gedetecteerd. De vliegen werden gevoed met geverfd voedsel voor 30 min en ontleed onmiddellijk om de hoeveelheid kleurstof in het gewas en de darm met behulp van spectrofotometrie te detecteren. Zoals blijkt uit figuur 2Awaren de hoeveelheden blauwe kleurstof in de controlegewassen en nprl2-mutanten vergelijkbaar , in overeenstemming met de eerder gemelde vergelijkbare gewasgrootte8. De nprl2 mutanten hadden minder kleurstof in de darm, wat kan worden geassocieerd met de verminderde krimppercentage (figuur 2B).
Figuur 1: Gewascontractieverschil tussen controle en nprl2 mutantmannetjes. De 3-daagse-oude mannelijke vliegen werden ontleed, en de gewas contractie tarief werd geteld. De samentrekkingsfrequentie van elke vlieg wordt weergegeven als een gegevenspunt. Foutbalken vertegenwoordigen SD vanaf het aangegeven gegevenspunt. , P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verschil in voedselverdeling tussen controle en nprl2 gemuteerde mannetjes na een korte voedertijd. De 3-daagse oude mannelijke vliegen werden gevoed met voedsel met 0,5% blauwe kleurstof voor 30 min en vervolgens onmiddellijk ontleed om de kleurstof bedrag te detecteren. (A) De kleurstofhoeveelheid in het gewas. (B) De kleurstof hoeveelheid in de darm zonder gewas. **, P < 0,01; NS, niet significant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende tabel 1: De oorspronkelijke gegevens van de gewascontractie die in figuur 1worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In Drosophila ingenomen voedsel beweegt van het gewas naar de darm voor de spijsvertering. Tijdens dit proces worden de voedingsstoffen geabsorbeerd en wordt het afval als uitwerpselen uit het lichaam verdreven. Zo kan het vergelijken van voedselinname samen met uitwerping van uitwerping van uitwerping van voedsel worden gebruikt om de snelheid van voedselbeweging in het lichaam ruwweg te beoordelen. De methode van capillaire feeder (CAFE) wordt veel gebruikt om voedselopname10,11te meten . De methode van het tellen van het aantal uitwerpselen kan worden gebruikt om de hoeveelheid ontlastingscreatie12te schatten. Echter, de voedselbeweging in Drosophila lichaam is onder de controle van vele factoren, waaronder bemotiliteit bij het gewas. Gewasfunctie kan niet gemakkelijk worden geëvalueerd met behulp van CAFE- en ontlastingsweegmethoden. Dit protocol kan kwantitatief evalueren gewas beweeglijkheid en voedsel doorgeven van gewas tot darmen in Drosophila.
Gewas beweeglijkheid is essentieel voor voedsel passaging en Drosophila overleven. Sommige genmutaties of virusinfecties die de gewasfunctie beïnvloeden, resulteren in een verminderde levensduurvan 7,13,14. Dit protocol kan worden gebruikt om de mutanten en geneesmiddelen die de beweeglijkheid van gewassen beïnvloeden te screenen en te evalueren. De gewascontractie telling wordt gebruikt om gewasmotility frequentie te detecteren en de spectrofotometrie meten voedseldistributie in gewas en darm wordt gebruikt om gewasmotiliteit efficiëntie te voorspellen. Deze twee methoden zijn gemakkelijk uit te voeren en zeer gevoelig. Bovendien kan de spectrofotometriemethode worden aangepast om het voedselgebruik in Drosophilate detecteren. Voedselopname kan bijvoorbeeld binnen een korte tijd worden geëvalueerd door de hoeveelheid kleurstof in de hele darm te detecteren. De continue voedseldistributie status tussen gewas en darm kan worden beoordeeld door het detecteren van de kleurstof bedragen in de vliegen gevoed met kleurstof voedsel voor enkele dagen.
Er zijn een paar technische overwegingen in dit protocol. Voor de methode voor het tellen van gewassen is het essentieel om het gewas zorgvuldig te ontleden en uit te schakelen in de PBS-buffer. Zoutoplossing is niet de fysiologische omgeving van het gewas. Het gewas moet verbonden blijven met het lichaam, en de vlieg moet in leven en wakker zijn; anders verliest het gewas de mogelijkheid om samen te trekken. Er wordt voorgesteld om gewascontractie te tellen in intacte vliegenevenals 13. Voor de spectrofotometrie methode, de scheiding van de gewassen van de ontleed GI en hun overdracht in een 96 goed bord na voedsel kleurstof voeding moet zorgvuldig en snel worden gedaan. De kleurstof wordt gebruikt om de hoeveelheid voedsel in het gewas en de darm aan te geven. Tijdens het ontledingsproces moeten het gewas en de darm in contact zijn. Als kleurstof lekt in de dissectie media, kan het monster niet worden gebruikt. Met de praktijk kan een ervaren technicus ontleding en gewasscheiding binnen 30 s voltooien.
Voorheen werden deze methoden gebruikt om de bemotiliteit van gewassen te evalueren bij 15 dagen oude nprl2 mutantvliegen die vergrote gewassenhadden 8. In dit geval werden de gewascontractie en de voedseldistributie bij 3-dagen-oude nprl2 mutanten met een normale gewasgrootte gekwantificeerd. In overeenstemming met de verminderde oogstcontractie snelheid, de nprl2 mutanten weergegeven minder kleurstof in de darm. Deze resultaten suggereren dat de nprl2 mutanten hebben een aantal gebreken in de begeerte gewas, zelfs op jonge leeftijd. De yw achtergrond werd gebruikt als een wild type controle omdat het de genetische achtergrond van de nprl2 mutant. Voor andere experimenten, stammen zoals Canton S en w118, kan worden gebruikt als controles. Andere groepen gebruiken een andere ontledenoplossing (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35,5 mM sacharose, pH = 7.1) voor het opsporen van gewascontractie13,14,15. Het percentage gewascontractie in de controlevliegen in deze studie is lager dan dat van Solari et al.15, maar hoger dan Chtarbanova et al.14 en Peller et al.13. Dit verschil kan worden veroorzaakt door de verschillende genetische achtergronden of dissectiemedia.
In alle, blauwe kleurstof spectrofotometrie samen met gewas contractie kan efficiënt worden gebruikt om de beweeglijkheid van gewassen te evalueren. Het protocol hier gepresenteerd helpt om Drosophila een goed model voor GI tract fysiologie studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) en Six talent peaks project in jiangsu provincie (nr. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
