Summary
L’objectif de ce protocole est de mesurer la contraction des cultures et de quantifier la distribution alimentaire dans l’intestin de Drosophila.
Abstract
La plupart des animaux utilisent le tractus gastro-intestinal (IG) pour digérer les aliments. Le mouvement des aliments ingérés dans le tractus gastro-intestinal est essentiel pour l’absorption des nutriments. La motilité gastro-intestinale désordonnée et la vidange gastrique causent de multiples maladies et symptômes. En tant qu’organisme modèle génétique puissant, Drosophila peut être utilisé dans la recherche sur la motilité GI. La culture de Drosophila est un organe qui contracte et déplace la nourriture dans le midgut pour une digestion plus poussée, fonctionnellement semblable à un estomac de mammifères. Présenté est un protocole pour étudier la motilité des cultures Drosophila à l’aide d’outils de mesure simples. Une méthode de comptage des contractions des cultures pour évaluer la motilité des cultures et une méthode de détection de la distribution de la nourriture teint en bleu entre la culture et l’intestin à l’aide d’un spectrophotomètre pour étudier l’effet de la culture sur le passage des aliments est décrite. La méthode a été utilisée pour détecter la différence de motilité des cultures entre le contrôle et les mouches mutantes nprl2. Ce protocole est à la fois rentable et très sensible à la motilité des cultures.
Introduction
La plupart des animaux ont un tube digestif appelé le tractus gastro-intestinal (GI) pour absorber l’énergie et les nutriments de l’environnement. Le tractus gastro-intestinal humain est composé de quatre parties : l’œsophage, l’estomac, l’intestin grêle et le gros intestin (côlon). Le passage des aliments de l’estomac à l’intestin est essentiel pour l’absorption des nutriments. Certains effecteurs, tels que le vieillissement, les médicaments toxiques, et l’infection, causent la motilité désordonnée de tractus gastro-intestinal et la vidange gastrique, qui est liée à certaines maladies et leurs symptômes tels que la dyspepsie, la maladie de reflux gastro-esophagien, et la constipation1.
La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) est un animal modèle largement utilisé dans la recherche biomédicale en raison de sa manipulation génétique facile. Fait important, environ 77% des gènes associés à la maladie humaine ont un homologue dans Drosophila2. La recherche utilisant Drosophila a fait d’énormes progrès dans notre compréhension de nombreux mécanismes de la maladie. En tant qu’organisme modèle génétique puissant, Drosophila est largement utilisé dans la recherche sur les voiesgastro-intestinales 3. Drosophila a un tube digestif plus simple, qui est divisé en trois domaines distincts: foregut, midgut, et hindgut4. La culture, une partie de l’avant-goût, est une structure en forme de sac qui sert de site pour le stockage des aliments ingérés. Le midgut est un long tube et fonctionne comme le site pour la digestion des aliments et l’absorption des nutriments à travers la couche épithéliale, qui se compose d’entérocytes absorptives (EC) et des cellules entéroendocrines sécrétoires (EE)5. Fait intéressant, la fonction de l’estomac dans Drosophila est divisé en deux parties: la culture fonctionne comme stockage des aliments et la région des cellules de cuivre (CCR) est une région très acide avec un pH < 36. Dans Drosophila, les aliments ingérés sont d’abord déplacés à la culture et par la suite pompé dans le midgut7. Ainsi, la culture joue un rôle essentiel dans le passage des aliments. Enveloppée par des muscles viscéraux et composée d’un ensemble complexe de valves et de sphincters, la culture continue de se contracter et de déplacer les aliments dans le midgut pour une digestion ultérieure.
Ce protocole permet de détecter le mouvement des aliments de la culture au midgut dans Drosophila. La contraction des cultures est évaluée en comptant la fréquence de contraction des cultures. En outre, l’effet de la culture sur le passage des aliments est étudié en détectant la distribution des aliments entre les cultures et l’intestin. En outre, la distribution de nourriture peut être utilisée pour refléter le mouvement alimentaire immédiat ou l’état alimentaire de base en utilisant différentes périodes d’alimentation. Pris ensemble, ce protocole fournit des méthodes pour évaluer rapidement la motilité des cultures et le passage des aliments dans Drosophila.
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Protocol
1. Entretien et préparation des mouches expérimentales
- Maintenir les mouches dans des flacons contenant 10 mL d’aliments fraîchement faits (1% d’agar, 2,4% de levure de bière, 3% de saccharose, 5% de semoule de maïs) dans un incubateur à 25 °C avec 60% d’humidité. Réglez le cycle de lumière de l’incubateur à 12 h de lumière: 12-h sombre.
- Pour s’assurer qu’un grand nombre de génotype désiré vole des ecloses simultanément, les jeunes mouches de culture (1−3 jours) dans les aliments standard avec la levure sèche sur la surface pendant 3 jours. Transférer les adultes dans un nouveau flacon alimentaire avec des aliments standard, y compris la levure humide, pendant 2 jours pour permettre la ponte. Laissez les œufs dans l’incubateur pour développer et transférer les mouches adultes vers une nouvelle fiole pour recueillir plus d’œufs.
- Recueillir les mouches mâles ou femelles eclosed chaque jour et les culture dans de nouvelles fioles avec des aliments standard à l’état d’entretien à l’âge désiré.
REMARQUE : Pour obtenir plus de mouches de même âge, plusieurs flacons du génotype désiré peuvent être mis en place simultanément. Les flacons de la culture de la mouche adulte doivent être changés tous les 3 à 5 jours.
2. Compter les contractions des cultures
- Anesthésiez les mouches avec du CO2 et prenez une mouche dans un puits de plaque de dissection contenant 200 μL de solution saline tamponnée de phosphate 1x (PBS, pH = 7,4) composée de 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, et 1,76 mM KH2PO4.
- Saisissez la mouche à son thorax à l’aide d’une paire de pinces à épiler, ouvrez le thorax en douceur à l’aide d’une autre paire de pinces à épiler, puis tirez l’extrémité dans des directions opposées pour ouvrir l’abdomen. Retirez soigneusement la culture et l’intestin du corps.
- Attendez que la mouche se réveille, puis visualisez la récolte et comptez le nombre de fois qu’elle se contracte en 1 min.
REMARQUE : Seule une onde complète sur les lobes de culture est comptée comme une contraction. - Répétez l’étape 2.3 pour 5x entre les intervalles de 30 s.
- Calculer le nombre moyen de contractions de cultures par minute.
REMARQUE : Pendant le comptage de contraction, la mouche doit être vivante, et l’intestin doit être intact et attaché à ses extrémités antérieures et postérieures après dissection.
3. Préparation d’aliments teints
- Peser et dissoudre le colorant bleu (Tableau des matériaux)en PBS à une concentration de 20% (w/v).
- Ajouter le colorant bleu de 20 % dans les aliments d’entretien liquide bouilli (étape 1.1) avec une dilution de 1:40 à une concentration finale de 0,5 % (w/v) pendant le processus de refroidissement des aliments.
REMARQUE : Le colorant bleu est ajouté avant que les aliments ne refroidissent et se mélangent bien en remuant. Il est facultatif de dissoudre le colorant bleu dans PBS; l’eau distillée convient également.
4. Nourrir les mouches avec de la nourriture teintée
- Transférer des groupes de mouches de même âge vers les flacons avec de la nourriture de famine (1% d’agar dans de l’eau distillée) pendant 4 h pour assurer la prise de nourriture.
- Transférer les mouches vers de nouvelles fioles avec de la nourriture teintée en bleu et la culture des mouches pour le temps désiré.
REMARQUE : Le temps d’alimentation est un facteur critique et dépend de l’objectif de recherche. L’alimentation courte, dans le temps de passage des aliments, peut être utilisée pour évaluer la vitesse de la motilité alimentaire de la culture à l’intestin. Aux conditions d’entretien, la nourriture passe à travers dans environ 2 h. Cependant, le temps de passage pourrait être lié aux conditions culturelles. L’alimentation longue, jusqu’à quelques jours, peut être utilisée pour évaluer l’état persistant de distribution des aliments entre la culture et l’intestin.
5. Disséquer les mouches et prélever des échantillons de colorant dans les cultures et les intestins
- Anesthésiez les mouches avec du CO2 et prenez une mouche dans un puits de plaque de dissection contenant 200 μL de 1x PBS.
- Saisissez la mouche à son thorax à l’aide d’une paire de pinces à épiler et retirez la tête du corps à l’aide d’une autre paire de pinces à épiler. Déplacez le corps restant dans un nouveau puits contenant 200 μL de 1x PBS.
- Laver le corps 2x en le secouant doucement en 200 μL de 1x PBS à l’aide d’une paire de pinces pour nettoyer le colorant attaché au corps de la mouche.
- Ouvrez doucement et en douceur l’abdomen à l’aide de deux paires de pinces à épiler et séparez soigneusement tout l’intestin du corps.
- Retirez soigneusement la récolte de l’intestin entier et mettez-la dans un tube avec 100 μL de 1x PBS.
- Enfin, mettre l’intestin entier sans culture (ci-après appelé intestin) dans un autre tube avec 100 μL de 1x PBS.
- Broyer la culture et l’intestin respectivement dans des tubes à l’aide de pointes de pipette pour faire dissoudre le colorant dans le PBS.
- Répétez les étapes 5.1−5.7 jusqu’à ce que suffisamment de cultures et de boyaux soient recueillis pour l’expérience conçue.
REMARQUE : La culture et l’intestin doivent être entièrement homogénéisés, et tout colorant doit être dissous dans le tampon. À des fins de recherche, une ou plusieurs cultures ou intestins peuvent être recueillis dans un tube.
6. Calcul des quantités de colorants dans les cultures et les intestins
- Centrifuger les tubes d’échantillon à la vitesse la plus élevée pendant 1 min et transférer 90 μL de supernatant aux puits d’une plaque de puits de 96.
- Faire une série de dilutions de colorant bleu à des concentrations de 1 x 10-7 g/mL à 1 x 10-4 g/mL comme normes.
- Ajouter une série de normes de 90 μL aux puits de la plaque de puits de 96.
- Mesurer l’absorption des échantillons et des normes à 630 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque.
- Pour créer une courbe standard, tracez un graphique linéaire d’absorption par rapport à la concentration pour chacune des normes. Ensuite, tracez une ligne de meilleur ajustement à travers les points pour obtenir l’équation utilisée pour calculer la concentration de colorant dans les échantillons.
- Calculer la quantité de colorant en multipliant la concentration de l’échantillon de 0,1 mL.
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Representative Results
Ces méthodes pour compter le taux de contraction des cultures et détecter la distribution d’aliments teints peuvent être utilisées pour évaluer la fonction des cultures sur la motilité alimentaire. La contraction des cultures reflète la fréquence de pousser les aliments dans l’intestin. La distribution de colorant à la mouche après une courte période d’alimentation indique un passage immédiat des aliments de la culture au midgut.
Target of rapamycin complex 1 (TORC1) est un régulateur principal qui joue un médiateur dans le métabolisme des nutriments et des cellules. L’inhibition torc1 prolonge la durée de vie dans de nombreux organismes, y compris Drosophila. En tant qu’inhibiteur de TORC1, la mouche mutante nprl2 affiche une hyperactivation des défauts de digestion TORC1 et GI8,9. La taille de la récolte dans un mutant nprl2 est normale à 3 jours et agrandie à 15 jours, par rapport à son contrôle génétique de fond (yw)8. Pour évaluer l’essai de motilité des cultures, des mouches mutantes nprl2 de 3 jours ont été utilisées. Chaque culture a été comptée cinq fois et la valeur moyenne a été utilisée (Tableau supplémentaire 1). Les chiffres de la contraction des cultures au cours des cinq répétitions étaient semblables, ce qui suggère que le PBS pourrait ne pas affecter la physiologie des cultures dans les alimentations courtes et convient au comptage des contractions des cultures. La mutation nprl2 a considérablement diminué le taux de contraction des cultures (figure 1).
Semblable à l’estomac des mammifères, la culture Drosophila continue de se contracter pour déplacer la nourriture dans l’intestin. Pour confirmer davantage la fonction de Nprl2 sur la culture, des mouvements alimentaires ont été détectés. Les mouches ont été nourries avec de la nourriture teintée pendant 30 min et disséquées immédiatement pour détecter la quantité de colorant dans la culture et l’intestin à l’aide de la spectrophotométrie. Comme le montre la figure 2A, les quantités de colorant bleu dans les cultures de lutte et les mutants nprl2 étaient similaires, ce qui correspond à la taille comparable de la culture précédemmentdéclarée 8. Les mutants nprl2 avaient moins de colorant dans l’intestin, ce qui peut être associé à la diminution du taux de contraction (Figure 2B).
Figure 1 : Différence de contraction des cultures entre les mâles mutants de contrôle et de nprl2. Les mouches mâles de 3 jours ont été disséquées, et le taux de contraction des cultures a été compté. La fréquence de contraction des cultures de chaque mouche est affichée sous forme de point de données. Les barres d’erreur représentent SD à partir du point de données indiqué. , P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Différence de distribution alimentaire entre les mâles mutants de contrôle et les mâles mutants nprl2 après un court laps de temps d’alimentation. Les mouches mâles de 3 jours ont été nourries avec de la nourriture contenant 0,5% de colorant bleu pendant 30 min, puis disséquées immédiatement pour détecter la quantité de colorant. (A) La quantité de colorant dans la culture. (B) La quantité de colorant dans l’intestin sans culture. **, P < 0,01; NS, pas significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau supplémentaire 1 : Les données originales de la contraction des cultures utilisées à la figure 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Dans Drosophila ingéré les aliments se déplace de la culture à l’intestin pour la digestion. Au cours de ce processus, les nutriments sont absorbés, et les déchets sont expulsés hors du corps comme excréments. Ainsi, la comparaison de l’ingestion de nourriture avec l’éjection des excréments peut être utilisée pour évaluer grossièrement la vitesse du mouvement des aliments dans le corps. La méthode de la mangeoire capillaire (CAFE) est largement utilisée pour mesurer l’ingestion de nourriture10,11. La méthode de comptage des nombres d’excréments peut être utilisée pour estimer la quantité de création d’excréments12. Cependant, le mouvement alimentaire dans le corps de Drosophila est sous le contrôle de nombreux facteurs, y compris la motilité des cultures. La fonction de culture ne peut pas être facilement évaluée à l’aide des méthodes de comptage cafe et des excréments. Ce protocole peut évaluer quantitativement la motilité des cultures et le passage des aliments de la culture à l’intestin à Drosophila.
La motilité des cultures est essentielle au passage des aliments et à la survie de Drosophila. Certaines mutations génétiques ou infections virales qui affectent la fonction des cultures entraînent une diminution de la durée de vie7,,13,14. Ce protocole peut être utilisé pour examiner et évaluer les mutants et les médicaments qui affectent la motilité des cultures. Le comptage des contractions des cultures est utilisé pour détecter la fréquence de motilité des cultures et la spectrophotométrie mesurant la distribution des aliments dans les cultures et les intestins est utilisée pour prédire l’efficacité de la motilité des cultures. Ces deux méthodes sont faciles à exécuter et très sensibles. En outre, la méthode de spectrophotométrie peut être modifiée pour détecter l’utilisation des aliments dans Drosophila. Par exemple, l’ingestion de nourriture dans un court laps de temps peut être évaluée en détectant la quantité de colorant dans l’intestin entier. L’état de distribution continue des aliments entre la culture et l’intestin peut être évalué en détectant les quantités de colorant dans les mouches nourries avec des aliments colorants pendant quelques jours.
Il y a quelques considérations techniques dans ce protocole. Pour la méthode de comptage des contractions des cultures, il est essentiel de disséquer et de retirer la culture soigneusement dans le tampon PBS. La solution saline n’est pas l’environnement physiologique de la culture. La culture doit rester connectée au corps, et la mouche doit être vivante et éveillée; sinon, la culture perd la capacité de se contracter. Il est suggéré de compter la contraction des cultures chez les mouches intactes ainsi13. Pour la méthode de spectrophotométrie, la séparation des cultures de l’IG disséquée et leur transfert dans une plaque de puits de 96 après l’alimentation des colorants alimentaires doivent être effectués avec soin et rapidité. Le colorant est utilisé pour indiquer la quantité de nourriture dans la culture et l’intestin. Pendant le processus de dissection, la culture et l’intestin doivent être en contact. Si le colorant s’infiltre dans le milieu de dissection, l’échantillon ne peut pas être utilisé. Avec la pratique, un technicien qualifié peut terminer la dissection et la séparation des cultures dans les 30 s.
Auparavant, ces méthodes ont été utilisées pour évaluer la motilité des cultures chez les mouches mutantes nprl2 de 15 jours qui avaient agrandi les cultures8. Dans ce cas, la contraction des cultures et la distribution alimentaire chez les mutants nprl2 de 3 jours ayant une taille normale de la récolte ont été quantifiées. Conformément à la diminution du taux de contraction des cultures, les mutants nprl2 ont montré moins de colorant alimentaire dans l’intestin. Ces résultats suggèrent que les mutants nprl2 ont quelques défauts dans la motilité de culture même à un jeune âge. Le fond yw a été utilisé comme un contrôle de type sauvage parce qu’il est le fond génétique du mutant nprl2. Pour d’autres expériences, des souches comme le canton S et w118, peuvent être utilisées comme contrôles. D’autres groupes utilisent une solution de dissection différente (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35,5 mM saccharose, pH = 7,1) pour détecter la contraction des cultures13,14,15. Le taux de contraction des cultures constaté dans les mouches témoins dans cette étude est inférieur à celui rapporté par Solari et al.15, mais plus élevé que Chtarbanova et al.14 et Peller et al.13. Cette différence peut être causée par les différents milieux génétiques ou les milieux de dissection.
Dans l’ensemble, la spectrophotométrie des colorants bleus et la contraction des cultures peuvent être utilisées efficacement pour évaluer la motilité des cultures. Le protocole présenté ici aide à faire de Drosophila un bon modèle pour l’étude de physiologie des voies gastro-intestinales.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (no 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) et six sommets de talents dans la province du Jiangsu (No. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
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