Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Kontraktion der Ernte zu messen und die Lebensmittelverteilung im Drosophila-Darm zu quantifizieren.
Abstract
Die meisten Tiere verwenden den Magen-Darm-Trakt (GI), um Nahrung zu verdauen. Die Bewegung der aufgenommenen Nahrung im GI-Trakt ist für die Nährstoffaufnahme unerlässlich. Gestörte GI-Motilität und Magenentleerung verursachen mehrere Krankheiten und Symptome. Als mächtiger genetischer Modellorganismus kann Drosophila in der GI-Motilitätsforschung eingesetzt werden. Die DD-Rosophila-Ernte ist ein Organ, das sich zusammenzieht und Nahrung zur weiteren Verdauung ins Mittelgut verschiebt, funktionell ähnlich wie ein Säugetiermagen. Präsentiert wird ein Protokoll zur Untersuchung der Beweglichkeit der Drosophila-Pflanzen mit einfachen Messwerkzeugen. Beschrieben wird eine Methode zum Zählen von Erntekontraktionen zur Bewertung der Beweglichkeit von Pflanzen und eine Methode zum Nachweis der Verteilung von blau gefärbten Lebensmitteln zwischen der Ernte und dem Darm, die ein Spektralphotometer verwenden, um die Auswirkungen der Kultur auf die Weitergabe von Lebensmitteln zu untersuchen. Die Methode wurde verwendet, um den Unterschied in der Beweglichkeit der Ernte zwischen Kontroll- und nprl2-Mutantenfliegen zu erkennen. Dieses Protokoll ist sowohl kosteneffizient als auch sehr empfindlich auf Diebeszeit.
Introduction
Die meisten Tiere haben eine Verdauungsröhre genannt magenintestinal (GI) Trakt, um Energie und Nährstoffe aus der Umwelt zu absorbieren. Der menschliche GI-Trakt besteht aus vier Teilen: Speiseröhre, Magen, Dünndarm und Dickdarm (Kolon). Der Nahrungsübergang vom Magen in den Darm ist für die Nährstoffaufnahme unerlässlich. Einige Effektoren, wie Alterung, toxische Medikamente, und Infektion, verursachen gestörte GI-Trakt Motilität und Magenentleerung, die mit einigen Krankheiten und ihre Symptome wie Dyspepsie, gastroösophageale Reflux-Krankheit, und Verstopfung1verbunden ist.
Die Fruchtfliege(Drosophila melanogaster) ist ein weit verbreitetes Mustertier in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen genetischen Manipulation. Wichtig ist, dass etwa 77% der Gene, die mit menschlichen Krankheiten assoziiert sind, einen Homolog in Drosophila2haben. Die Forschung mit Drosophila hat enorme Fortschritte in unserem Verständnis vieler Krankheitsmechanismen gemacht. Als mächtiger genetischer Modellorganismus ist Drosophila weit verbreitet in der GI-Traktforschung3. Drosophila hat einen einfacheren Verdauungstrakt, der in drei diskrete Bereiche unterteilt ist: Vorgut, Mittelgut und Hinterdarm4. Die Ernte, ein Teil des Vorguts, ist eine beutelartige Struktur, die als Ort für die Lagerung von aufgenommenen Lebensmitteln dient. Das Midgut ist eine lange Röhre und fungiert als Ort für die Verdauung und Nährstoffaufnahme durch die Epithelschicht, die aus absorptiven Enterozyten (ECs) und sekretorischen enteroendokrinen (EE) Zellenbesteht 5. Interessanterweise ist die Magenfunktion in Drosophila in zwei Teile unterteilt: Die Ernte funktioniert als Lebensmittellagerung und die Kupferzellregion (CCR) ist eine hochsäugische Region mit einem pH < 36. In Drosophilawird das aufgenommene Essen zunächst in die Ernte gebracht und anschließend in smittelgut7gepumpt. Daher spielt die Ernte eine entscheidende Rolle bei der Nahrungsweitergabe. Umhüllt von viszeralen Muskeln und bestehend aus einer komplexen Reihe von Ventilen und Schließmuskeln, zieht die Ernte immer wieder an und bewegt Nahrung zur weiteren Verdauung ins Mittelgut.
Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis der Lebensmittelbewegung von der Ernte bis zum Mittelgut in Drosophila. Die Erntekontraktion wird durch Zählen der Häufigkeit der Erntekontraktion bewertet. Darüber hinaus wird die Wirkung der Kultur auf die Weitergabe von Lebensmitteln untersucht, indem die Nahrungsverteilung zwischen Kultur und Darm festgestellt wird. Darüber hinaus kann die Lebensmittelverteilung verwendet werden, um die unmittelbare Lebensmittelbewegung oder den Grundlegendennahrungsstatus unter Verwendung unterschiedlicher Fütterungszeiten widerzuspiegeln. Zusammengenommen bietet dieses Protokoll Methoden zur schnellen Bewertung der Beweglichkeit von Pflanzen und der Nahrungsweitergabe in Drosophila.
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Protocol
1. Pflege und Vorbereitung von Experimentellen Fliegen
- Halten Sie Fliegen in Fläschchen mit 10 ml frisch zubereiteter Nahrung (1% Agar, 2,4% Bierhefe, 3% Saccharose, 5% Maismehl) in einem Brutkasten bei 25 °C mit 60% Luftfeuchtigkeit. Stellen Sie den Lichtzyklus des Inkubators auf 12-h-Licht:12-h dunkel ein.
- Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl der gewünschten Genotypfliegen gleichzeitig eatiert, Kultur junge Fliegen (1-3 Tage alt) in Standard-Lebensmittel mit trockener Hefe auf der Oberfläche für 3 Tage. Übertragen Sie die Erwachsenen auf eine neue Lebensmittel-Durchstechflasche mit Standard-Lebensmittel einschließlich Nasshefe, für 2 Tage, um Eiablage zu ermöglichen. Lassen Sie die Eier im Brutkasten, um erwachsene Fliegen zu entwickeln und in eine neue Durchstechflasche zu bringen, um mehr Eier zu sammeln.
- Sammeln Sie die geschlossenen männlichen oder weiblichen Fliegen jeden Tag und Kultur sie in neuen Fläschchen mit Standard-Essen bei der Wartung Zustand auf das gewünschte Alter.
HINWEIS: Um mehr gleichaltrige Fliegen zu erhalten, können mehrere Durchstechflaschen des gewünschten Genotyps gleichzeitig eingerichtet werden. Die Fläschchen für die Erwachsenen-Fliegenkultur sollten alle 3 bis 5 Tage gewechselt werden.
2. Zählen von Erntekontraktionen
- Anästhetisieren Sie die Fliegen mit CO2 und nehmen Sie eine Fliege in eine Sezierenplatte, die 200 l 1x phosphatgepufferte Kochsaline (PBS, pH = 7,4) enthält, bestehend aus 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4und 1,76 mM KH2PO4.
- Greifen Sie die Fliege an ihrem Thorax mit einem Paar Pinzette, glatt öffnen Sie den Thorax mit einem anderen Paar Pinzette, und ziehen Sie dann das Ende in entgegengesetzte Richtungen, um den Bauch zu öffnen. Nehmen Sie die Ernte und den Darm aus dem Körper sorgfältig.
- Warten Sie, bis die Fliege aufwacht, und visualisieren Sie dann die Ernte und zählen Sie, wie oft sie sich in 1 min zusammenzieht.
HINWEIS: Nur eine vollständige Welle auf den Erntelappen wird als eine Kontraktion gezählt. - Wiederholen Sie Schritt 2.3 für 5x zwischen 30 s Intervallen.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Erntekontraktionen pro Minute.
HINWEIS: Während der Kontraktionszählung sollte die Fliege am Leben sein, und der Darm sollte intakt sein und an seinen vorderen und hinteren Enden nach der Zerlegung befestigt sein.
3. Zubereitung von gefärbten Lebensmitteln
- Wiegen und lösen Sie den blauen Farbstoff (Materialtabelle) in PBS mit einer Konzentration von 20% (w/v).
- Fügen Sie den 20% blauen Farbstoff in die gekochte flüssige Pflegenahrung (Schritt 1.1) mit einer Verdünnung von 1:40 auf eine Endkonzentration von 0,5% (w/v) während des Lebensmittelkühlprozesses ein.
HINWEIS: Der blaue Farbstoff wird vor der Abkühlung des Lebensmittels zugegeben und gut unter Rühren vermischt. Es ist optional, den blauen Farbstoff in PBS aufzulösen; destilliertes Wasser ist ebenfalls geeignet.
4. Fütterung von Fliegen mit gefärbten Lebensmitteln
- Transfergruppen gleichaltnierter Fliegen auf die Fläschchen mit Hungerfutter (1% Agar in destilliertem Wasser) für 4 h, um die Nahrungsaufnahme zu gewährleisten.
- Übertragen Sie die Fliegen auf neue Fläschchen mit Lebensmittel gefärbt blau und Kultur die Fliegen für die gewünschte Zeit.
HINWEIS: Die Fütterungszeit ist ein kritischer Faktor und hängt vom Forschungszweck ab. Kurze Fütterung, innerhalb der Zeit der Nahrung durch, kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Lebensmittel Motilität von der Ernte zu Darm zu bewerten. Bei den Wartungsbedingungen geht das Essen in ca. 2 h durch. Die Zeit des Durchgangs könnte jedoch mit den Kulturbedingungen zusammenhängen. Lange Fütterung, bis zu ein paar Tage, kann verwendet werden, um persistente Lebensmittelverteilung Status zwischen Ernte und Darm zu bewerten.
5. Fliegen sezieren und Färbeproben in Ernte und Darm sammeln
- Anästhetisieren Sie die Fliegen mit CO2 und nehmen Sie eine Fliege in eine Sezierenplatte, die 200 l 1x PBS enthält.
- Greifen Sie die Fliege an ihrem Thorax mit einer Pinzette und nehmen Sie den Kopf vom Körper mit einem anderen Paar Pinzette. Bewegen Sie den restlichen Körper in einen neuen Brunnen, der 200 L 1x PBS enthält.
- Waschen Sie den Körper 2x, indem Sie ihn vorsichtig in 200 l 1x PBS schütteln, indem Sie eine Pinzette verwenden, um den Farbstoff zu reinigen, der am Fliegenkörper befestigt ist.
- Öffnen Sie den Bauch vorsichtig und sanft mit zwei Paarpinzette und trennen Sie vorsichtig den ganzen Darm vom Körper.
- Nehmen Sie die Ernte vorsichtig aus dem gesamten Darm ab und legen Sie sie in ein Rohr mit 100 l 1x PBS.
- Schließlich den ganzen Darm ohne Ernte (im Folgenden als Darm bezeichnet) in ein anderes Rohr mit 100 l 1x PBS geben.
- Schleifen Sie die Ernte bzw. den Darm in Rohren mit Pipettenspitzen, um den Farbstoff im PBS auflösen zu lassen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1 x 5.7, bis genügend Ernten und Eingeweide für das entwickelte Experiment gesammelt werden.
HINWEIS: Die Ernte und der Darm sollten vollständig homogenisiert sein, und alle Farbstoffe sollten im Puffer gelöst werden. Zu Forschungszwecken können eine oder mehrere Kulturen oder Eingeweide in einer Röhre gesammelt werden.
6. Berechnung der Farbstoffmengen in Ernte und Darm
- Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen mit der höchsten Geschwindigkeit für 1 min und übertragen Sie 90 l Überstand auf die Brunnen einer 96-Wellplatte.
- Stellen Sie eine Reihe von blauen Farbstoffverdünnungen in Konzentrationen von 1 x 10-7 g/ml bis 1 x 10-4 g/ml als Standard her.
- Fügen Sie den Bohrungen der 96-Well-Platte eine Reihe von 90-L-Standards hinzu.
- Messen Sie die Absorption der Proben und Standards bei 630 nm mit einem Plattenspektrophotometer.
- Um eine Standardkurve zu erstellen, zeichnen Sie ein Liniendiagramm der Absorption vs. Konzentration für jeden der Standards. Zeichnen Sie dann eine Linie von der besten Passform durch die Punkte, um die Gleichung zu erhalten, die verwendet wird, um die Farbstoffkonzentration in den Proben zu berechnen.
- Berechnen Sie die Menge des Farbstoffs, indem Sie die Probenkonzentration mit 0,1 ml multiplizieren.
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Representative Results
Diese Methoden zur Zählung der Erntekontraktionsrate und zum Nachweis der Verteilung gefärbter Lebensmittel können verwendet werden, um die Erntefunktion auf die Beweglichkeit von Lebensmitteln zu bewerten. Die Erntekontraktion spiegelt die Häufigkeit wider, Lebensmittel in den Darm zu schieben. Die Verteilung von Farbstoff in der Fliege nach einer kurzen Fütterungszeit zeigt, dass die Nahrung von der Ernte bis zum Mittelgut sofort abgeht.
Target of rapamycin complex 1 (TORC1) ist ein Master-Regulator, der Nährstoff- und Zellstoffwechsel vermittelt. TORC1-Hemmung verlängert die Lebensdauer in vielen Organismen, einschließlich Drosophila. Als Inhibitor von TORC1 zeigt die nprl2 mutante Fliege eine Hyperaktivierung von TORC1- und GI-Verdauungsdefekten8,9. Die Erntegröße in einem nprl2 Mutant ist normal bei 3 Tagen alt und vergrößert bei 15 Tage alt, verglichen mit seiner genetischen Hintergrundkontrolle (yw)8. Zur Bewertung des Pflanzenmotilitätstestes wurden 3 Tage alte nprl2-Mutantfliegen und yw-Kontrollen verwendet. Jede Kultur wurde fünfmal gezählt, und der Durchschnittswert wurde verwendet (Zusatztabelle 1). Die Anzahl der Erntekontraktion während der fünf Wiederholungen war ähnlich, was darauf hindeutet, dass PBS die Pflanzenphysiologie in kurzen Fütterungen nicht beeinflussen könnte und für die Erntekontraktionszählung geeignet ist. Die nprl2-Mutation verringerte die Rate der Erntekontraktion signifikant (Abbildung 1).
Ähnlich wie der Magen der Säugetiere, die Drosophila-Ernte kontraktion immer wieder, um die Nahrung in den Darm zu bewegen. Um die Funktion von Nprl2 auf der Ernte weiter zu bestätigen, wurde eine Lebensmittelbewegung festgestellt. Die Fliegen wurden 30 min lang mit gefärbtem Futter gefüttert und sofort seziert, um die Menge an Farbstoff in der Ernte und im Darm mittels Spektrophotometrie zu erkennen. Wie in Abbildung 2Adargestellt, waren die blauen Farbstoffmengen in den Kontrollkulturen und nprl2 Mutanten ähnlich, was der zuvor gemeldeten vergleichbaren Erntegröße8entsprach. Die nprl2-Mutanten hatten weniger Farbstoff im Darm, der mit der verringerten Kontraktionsrate in Verbindung gebracht werden kann (Abbildung 2B).
Abbildung 1: Erntekontraktionsdifferenz zwischen Kontrolle und nprl2 mutierten Männchen. Die drei Tage alten männlichen Fliegen wurden seziert, und die Erntekontraktionsrate wurde gezählt. Die Erntekontraktionshäufigkeit jeder Fliege wird als Datenpunkt angezeigt. Fehlerbalken stellen SD vom angegebenen Datenpunkt aus dar. , P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Unterschied zwischen der Lebensmittelverteilung zwischen Kontrolle und nprl2 mutierten Männchen nach kurzer Fütterungszeit. Die 3 Tage alten männlichen Fliegen wurden 30 min lang mit Lebensmitteln gefüttert, die 0,5% blauer Farbstoff enthielten, und dann sofort seziert, um die Farbstoffmenge zu erkennen. (A) Die Farbstoffmenge in der Ernte. (B) Die Farbstoffmenge im Darm ohne Ernte. **, P < 0,01; NS, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Die originalen Daten der Erntekontraktion in Abbildung 1.. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In Drosophila aufgenommene Nahrung bewegt sich von der Ernte in den Darm für die Verdauung. Dabei werden die Nährstoffe aufgenommen und der Abfall als Kot aus dem Körper vertrieben. So kann der Vergleich der Nahrungsaufnahme mit dem Kotauswurf verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Nahrungsbewegung im Körper grob zu beurteilen. Die Methode der Kapillarzuführung (CAFE) ist weit verbreitet, um die Nahrungsaufnahme zu messen10,11. Die Methode der Kotanzahl zählen kann verwendet werden, um die Menge der Fäkalien Schöpfung12zu schätzen. Jedoch, die Lebensmittelbewegung in Drosophila Körper ist unter der Kontrolle von vielen Faktoren, einschließlich der Beweglichkeit der Ernte. Die Erntefunktion lässt sich nicht einfach mit CAFE- und Fäkalienzählmethoden bewerten. Dieses Protokoll kann die Beweglichkeit der Kultur und die Nahrungsweitergabe von der Ernte bis zum Darm in Drosophilaquantitativ bewerten.
Pflanzenmotilität ist wichtig für Die Nahrungsweitergabe und Drosophila Überleben. Einige Genmutationen oder Virusinfektionen, die die Erntefunktion beeinflussen, führen zu einer verminderten Lebensdauer7,13,14. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mutanten und Medikamente zu überprüfen und zu bewerten, die die Beweglichkeit der Kultur beeinflussen. Die Erntekontraktionszählung wird verwendet, um die Häufigkeit der Beweglichkeit von Pflanzen zu erfassen, und die Spektrophotometrie, die die Lebensmittelverteilung in Kultur und Darm misst, wird verwendet, um die Tilgungseffizienz der Ernte vorherzusagen. Diese beiden Methoden sind einfach durchzuführen und hochsensibel. Darüber hinaus kann die Spektrophotometrie-Methode modifiziert werden, um den Nahrungseinsatz in Drosophilazu erkennen. Beispielsweise kann die Nahrungsaufnahme innerhalb kurzer Zeit durch Die Erkennung der Farbstoffmenge im gesamten Darm bewertet werden. Der kontinuierliche Lebensmittelverteilungsstatus zwischen Ernte und Darm kann beurteilt werden, indem die Farbstoffmengen in den fliegend mit Farbstoffnahrung für einige Tage gefüttert erkannt werden.
Dieses Protokoll hat einige technische Überlegungen. Für die Erntekontraktionszählmethode ist es wichtig, die Ernte sorgfältig im PBS-Puffer zu sezieren und herauszunehmen. Salzlösung ist nicht die physiologische Umgebung der Ernte. Die Ernte muss mit dem Körper verbunden bleiben, und die Fliege muss lebendig und wach sein; andernfalls verliert die Ernte die Fähigkeit, sich zu verankleben. Es wird vorgeschlagen, Erntekontraktion in intakten Fliegen sowie13zu zählen. Bei der Spektrophotometrie-Methode sollte die Trennung der Kulturen vom sezierten GI und deren Übertragung in eine 96-Well-Platte nach der Fütterung von Nahrungsfarbstoffen sorgfältig und schnell erfolgen. Der Farbstoff wird verwendet, um die Menge der Nahrung in der Ernte und Darm anzuzeigen. Während des Sezierens sollten die Ernte und der Darm in Kontakt sein. Wenn Farbstoffe in das Seziermedium eindringen, kann die Probe nicht verwendet werden. Mit der Praxis kann ein erfahrener Techniker die Zerlegung und Erntetrennung innerhalb von 30 s beenden.
Zuvor wurden diese Methoden verwendet, um die Beweglichkeit der Ernte in 15 Tage alten nprl2 mutierten Fliegen zu bewerten, die vergrößerte Kulturen hatten8. In diesem Fall wurden die Erntekontraktion und die Nahrungsmittelverteilung in 3 Tage alten nprl2-Mutanten mit normaler Erntegröße quantifiziert. In Übereinstimmung mit der verringerten Erntekontraktionsrate zeigten die nprl2-Mutanten weniger Lebensmittelfarbstoff im Darm. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die nprl2 Mutanten schon in jungen Jahren einige Mängel in der Beweglichkeit der Kultur haben. Der yw-Hintergrund wurde als Wildtypkontrolle verwendet, da es sich um den genetischen Hintergrund der nprl2 Mutante handelt. Für andere Experimentekönnen Stämme wie Canton S und w118als Steuerungen verwendet werden. Andere Gruppen verwenden eine andere Sezierenlösung (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35,5 mM Saccharose, pH = 7,1) zum Nachweis von Erntekontraktion13,14,15. Die Erntekontraktionsrate, die in den Kontrollfliegen in dieser Studie gefunden wurde, ist niedriger als die von Solari et al.15berichtet, aber höher als Chtarbanova et al.14 und Peller et al.13. Dieser Unterschied kann durch die unterschiedlichen genetischen Hintergründe oder Seziermedien verursacht werden.
Insgesamt kann die Blaufarbstoffspektrophotometrie zusammen mit der Erntekontraktion effizient zur Bewertung der Beweglichkeit der Ernte verwendet werden. Das hier vorgestellte Protokoll hilft, Drosophila zu einem guten Modell für die GI-Traktphysiologie-Studie zu machen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) und Six talent peaks project in Jiangsu Province (Nr. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
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