Summary
L'obiettivo di questo protocollo è misurare la contrazione delle colture e quantificare la distribuzione degli alimenti nell'intestino della Drosophila.
Abstract
La maggior parte degli animali usa il tratto gastrointestinale (GI) per digerire il cibo. Il movimento del cibo ingerito nel tratto GI è essenziale per l'assorbimento dei nutrienti. La motilità e lo svuotamento gastrico disordinato causano molteplici malattie e sintomi. Come potente organismo modello genetico, la Drosophila può essere utilizzata nella ricerca sulla motilità delle GI. Lacoltura di rosophila Dè un organo che contrae e sposta il cibo nel midgut per un'ulteriore digestione, funzionalmente simile allo stomaco di un mammifero. Presentato è un protocollo per studiare la motilità delle colture della Drosophila utilizzando semplici strumenti di misurazione. Viene descritto un metodo per contare le contrazioni delle colture per valutare la motilità delle colture e un metodo per rilevare la distribuzione degli alimenti tinto di blu tra il raccolto e l'intestino utilizzando uno spettrofotometro per studiare l'effetto della coltura sul passaggio degli alimenti. Il metodo è stato utilizzato per rilevare la differenza di motilità delle colture tra il controllo e le mosche mutanti nprl2. Questo protocollo è sia conveniente che altamente sensibile alla motilità delle colture.
Introduction
La maggior parte degli animali hanno un tubo digestivo chiamato tratto gastrointestinale (GI) per assorbire energia e sostanze nutritive dall'ambiente. Il tratto di GI umano è composto da quattro parti: l'esofago, lo stomaco, l'intestino tenue e l'intestino crasso (colon). Il passaggio alimentare dallo stomaco all'intestino è essenziale per l'assorbimento dei nutrienti. Alcuni effetti, come l'invecchiamento, farmaci tossici, e l'infezione, causano la motilità del tratto GI disordinato e lo svuotamento gastrico, che è legato ad alcune malattie e ai loro sintomi come la dispepsia, la malattia del reflusso gastroesofageo, e costipazione1.
La mosca della frutta (Drosophila melanogaster) è un animale modello ampiamente usato nella ricerca biomedica grazie alla sua facile manipolazione genetica. È importante sottolineare che circa il 77% dei geni associati alla malattia umana ha un omologa nella Drosophila2. La ricerca con la Drosophila ha fatto enormi progressi nella nostra comprensione di molti meccanismi di malattia. Come potente organismo modello genetico, la Drosophila è ampiamente utilizzata nella ricerca sul tratto GI3. La Drosophila ha un tratto digestivo più semplice, che è diviso in tre domini discreti: budello, midgut e hindgut4. Il raccolto, una parte del foregut, è una struttura simile a un sacchetto che funge da sito per lo stoccaggio di cibo ingerito. Il midgut è un tubo lungo e funziona come il sito per la digestione alimentare e l'assorbimento dei nutrienti attraverso lo strato epiteliale, che consiste di enterociti addominali (EC) e cellule di enteroendocrina secretory (EE)5. È interessante notare che la funzione dello stomaco in Drosophila è divisa in due parti: le funzioni delle colture come conservazione degli alimenti e la regione delle cellule di rame (CCR) è una regione altamente acida con un pH < 36. In Drosophila, il cibo ingerito viene inizialmente spostato al raccolto e successivamente pompato nel mezzo budello7. Così, la coltura svolge un ruolo fondamentale nel passaggio del cibo. Avvolto da muscoli viscerali e costituito da una complessa gamma di valvole e sfinteri, il raccolto continua a contrarre e spostare il cibo nel midgut per un'ulteriore digestione.
Questo protocollo consente di rilevare il movimento alimentare dalla coltura al midgut in Drosophila. La contrazione delle colture viene valutata contando la frequenza di contrazione del raccolto. Inoltre, l'effetto della coltura sul passaggio degli alimenti viene studiato rilevando la distribuzione degli alimenti tra colture e intestini. Inoltre, la distribuzione degli alimenti può essere utilizzata per riflettere il movimento alimentare immediato o lo stato degli alimenti di base utilizzando diversi periodi di alimentazione. Nel loro insieme, questo protocollo fornisce metodi per valutare rapidamente la motilità delle colture e il passaggio di cibo nella Drosophila.
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Protocol
1. Mantenere e preparare mosche sperimentali
- Mantenere le mosche nelle fiale contenenti 10 mL di cibo appena fatto (1% agar, 2,4% di lievito di birra, 3% di saccarosio, 5% farina di mais) in un'incubatrice a 25 gradi centigradi con 60% di umidità. Impostare il ciclo di luce dell'incubatrice su 12-h luce:12-h scuro.
- Per garantire che un gran numero di mosche genotipi ospicano desiderate si chiuda simultaneamente, la coltura giovani mosche (1/3 giorni) nel cibo standard con lievito secco sulla superficie per 3 giorni. Trasferire gli adulti in una nuova fiala di cibo con cibo standard tra cui lievito bagnato, per 2 giorni per consentire la deposizione delle uova. Lasciare le uova nell'incubatrice per sviluppare e trasferire mosche adulte in una nuova fiala per raccogliere più uova.
- Raccogliere le mosche maschili o femminili e la coltura in nuove fiale con cibo standard alle condizioni di manutenzione per l'età desiderata.
NOTA: Per ottenere più mosche della stessa età, possono essere configurate contemporaneamente più fiale del genotipo desiderato. Le fiale per la cultura delle mosche adulte dovrebbero essere cambiate ogni 3-5 giorni.
2. Conteggio delle contrazioni delle colture
- Anestesizzare le mosche con CO2 e prendere una mosca in una piastra di dissezione contenente 200 -L di 1x fosfato buffered saline (PBS, pH 7.4) composta da 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4e 1,76 mM KH24.
- Afferra la mosca al suo torace usando un paio di pinzette, apri il torace senza problemi usando un altro paio di pinzette, quindi tira l'estremità in direzioni opposte per aprire l'addome. Prendere il raccolto e l'intestino fuori dal corpo con attenzione.
- Attendi che la mosca si svegli e quindi visualizza il raccolto e conta il numero di volte in cui si contrae in 1 min.
NOTA: solo un'onda completa sui lobi delle colture viene conteggiata come una contrazione. - Ripetere il passaggio 2.3 per 5x tra intervalli 30 s.
- Calcolare il numero medio di contrazioni delle colture al minuto.
NOTA: Durante il conteggio della contrazione, la mosca deve essere viva e l'intestino deve essere intatto e attaccato alle estremità anteriori e posteriori dopo la dissezione.
3. Preparazione del cibo tato
- Pesare e sciogliere il colorante blu (Tabella dei materiali) in PBS ad una concentrazione del 20% (w/v).
- Aggiungere il 20% di colorante blu nel cibo di manutenzione del liquido bollito (fase 1.1) con una diluizione 1:40 a una concentrazione finale dello 0,5% (w/v) durante il processo di raffreddamento degli alimenti.
NOTA: Il colorante blu viene aggiunto prima del raffreddamento e mescolato bene con agitazione. È facoltativo sciogliere il coloranti blu in PBS; acqua distillata è anche adatto.
4. Alimentazione vola con cibo tinto
- Trasferire gruppi di mosche della stessa età verso le fiale con cibo da fame (1% agar in acqua distillata) per 4 h per garantire l'assunzione di cibo.
- Trasferire le mosche a nuove fiale con cibo tinto blu e cultura le mosche per il tempo desiderato.
NOTA: Il tempo di alimentazione è un fattore critico e dipende dallo scopo della ricerca. L'alimentazione breve, entro il tempo di passaggio del cibo, può essere utilizzata per valutare la velocità della motilità alimentare da coltura a intestino. Alle condizioni di manutenzione, il cibo passa attraverso in circa 2 h. Tuttavia, il tempo di passaggio potrebbe essere correlato alle condizioni culturali. L'alimentazione lunga, fino a pochi giorni, può essere utilizzata per valutare lo stato persistente di distribuzione degli alimenti tra coltura e intestino.
5. Dissezione mosche e raccolta di campioni di tintura in coltura e budello
- Anestesizza recitaro le mosche con CO2 e prendere una mosca in una piastra di dissezione contenente 200 -L di 1x PBS.
- Afferra la mosca al suo torace usando un paio di pinzette e togli la testa dal corpo usando un altro paio di pinzette. Spostare il corpo rimanente in un nuovo pozzo contenente 200 -L di 1x PBS.
- Lavare il corpo 2x scuotendolo delicatamente in 200 gradi l-l di 1x PBS utilizzando un paio di pinzette per pulire il tinrito attaccato al corpo della mosca.
- Aprire delicatamente e senza problemi l'addome utilizzando due paia di pinzette e separare con cura l'intero intestino dal corpo.
- Togliere con cura il raccolto da tutto l'intestino e metterlo in un tubo con 100 -L di 1x PBS.
- Infine, mettere l'intera budello senza raccolto (qui dopo indicato come intestino) in un altro tubo con 100 -L di 1x PBS.
- Macinare il raccolto e sventrare rispettivamente in tubi utilizzando punte di pipetta per fare in modo che il colorante si dissolva nel PBS.
- Ripetete i passaggi 5,1/5,7 fino a quando non vengono raccolte abbastanza colture e budella per l'esperimento progettato.
NOTA: Il raccolto e l'intestino devono essere completamente omogeneizzati e tutti i tincoli devono essere sciolti nel buffer. Per scopi di ricerca, una o più colture o budella possono essere raccolti in un tubo.
6. Calcolo delle quantità di tintura in coltura e budello
- Centrifugare i tubi campione alla massima velocità per 1 min e trasferire 90 l di supernatant ai pozzi di una piastra di 96 pozze.
- Effettuare una serie di diluizioni di coloranti blu a concentrazioni da 1 x 10-7 g/mL a 1 x 10-4 g/mL come standard.
- Aggiungere una serie di 90 standard l ai pozzi del pozzo 96.
- Misurare l'assorbimento dei campioni e degli standard a 630 nm con uno spettrofotometro a piastre.
- Per creare una curva standard, tracciare un grafico a linee di assorbimento rispetto alla concentrazione per ciascuno degli standard. Quindi disegnare una linea di adattamento attraverso i punti per ottenere l'equazione utilizzata per calcolare la concentrazione di tintura nei campioni.
- Calcolare la quantità di tintura moltiplicando la concentrazione del campione per 0,1 mL.
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Representative Results
Questi metodi per contare la velocità di contrazione delle colture e rilevare la distribuzione degli alimenti tinto possono essere utilizzati per valutare la funzione delle colture sulla motilità degli alimenti. La contrazione del raccolto riflette la frequenza di spingere il cibo nell'intestino. La distribuzione del colorante nella mosca dopo un breve periodo di alimentazione indica il passaggio immediato del cibo dal raccolto al midgut.
Obiettivo di rapamicicina complesso 1 (TORC1) è un regolatore principale che media nutrienti e metabolismo cellulare. L'inibizione TORC1 estende la durata della vita in molti organismi, tra cui la Drosophila. Come inibitore di TORC1, la mosca mutante nprl2 mostra l'iperattivazione dei difetti di digestione TORC1 e GI8,9. La dimensione del raccolto in un mutante nprl2 è normale a 3 giorni e ingrandita a 15 giorni di età, rispetto al suo controllo genetico dello sfondo (yw)8. Per valutare il test sulla motilità delle colture, sono state utilizzate mosche mutanti e controlli di yw di 3 giorni. yw Ogni coltura è stata conteggiata cinque volte ed è stato utilizzato il valore medio(tabella supplementare 1). Il numero della contrazione delle colture durante le cinque ripetizioni era simile, il che suggerisce che la PBS potrebbe non influenzare la fisiologia delle colture in brevi poppate ed è adatta per il conteggio della contrazione delle colture. La mutazione nprl2 ha ridotto significativamente il tasso di contrazione delle colture (Figura 1).
Simile allo stomaco dei mammiferi, il raccolto della Drosophila continua a contrarsi per spostare il cibo nell'intestino. Per confermare ulteriormente la funzione di Nprl2 sulla coltura, è stato rilevato il movimento alimentare. Le mosche sono state alimentate con cibo tinto per 30 min e sezionato immediatamente per rilevare la quantità di colorante nel raccolto e l'intestino utilizzando la spettrofotometria. Come mostrato nella Figura 2A, le quantità di colorante blu nelle colture di controllo e i mutanti nprl2 erano simili, in linea con la dimensione comparabile delle colture8. I mutanti nprl2 avevano meno tintura nell'intestino, che può essere associata alla diminuzione del tasso di contrazione (Figura 2B).
Figura 1: Differenza di contrazione delle colture tra il controllo e i maschi mutanti nprl2. Le mosche maschili di 3 giorni sono state sezionate e il tasso di contrazione del grano è stato contato. La frequenza di contrazione del ritaglio di ogni mosca viene visualizzata come punto dati. Le barre di errore rappresentano SD dal punto dati indicato. , P < 0.001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenza di distribuzione alimentare tra il controllo e i maschi mutanti nprl2 dopo un breve tempo di alimentazione. Le mosche maschili di 3 giorni sono state alimentate con cibo contenente 0,5% di colorante blu per 30 min e poi sezionato immediatamente per rilevare la quantità di colorante. (A) La quantità di colore nel raccolto. (B) La quantità di tinri nell'intestino senza raccolto. P < 0,01; NS, non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1: I dati originali di contrazione del raccolto utilizzati nella Figura 1. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Nella Drosophila il cibo ingerito si sposta dal raccolto all'intestino per la digestione. Durante questo processo, i nutrienti vengono assorbiti e i rifiuti vengono espulsi dal corpo come feci. Così, confrontare l'ingestione di cibo con l'espulsione delle feci può essere utilizzato per valutare approssimativamente la velocità del movimento del cibo nel corpo. Il metodo di alimentazione capillare (CAFE) è ampiamente utilizzato per misurare l'ingestione di cibo10,11. Il metodo di conteggio dei numeri delle feci può essere utilizzato per stimare la quantità di feci creazione12. Tuttavia, il movimento alimentare nel corpo della Drosophila è sotto il controllo di molti fattori, tra cui la motilità delle colture. La funzione Crop non può essere facilmente valutata utilizzando i metodi CAFE e di conteggio delle feci. Questo protocollo può valutare quantitativamente la motilità delle colture e il passaggio di cibo da coltura a budello nella Drosophila.
La motilità delle colture è essenziale per il passaggio del cibo e la sopravvivenza della Drosophila. Alcune mutazioni genetiche o infezioni da virus che influenzano la funzione delle colture provocano una diminuzione della durata della vita7,13,14. Questo protocollo può essere utilizzato per vagliare e valutare i mutanti e i farmaci che influenzano la motilità delle colture. Il conteggio della contrazione delle colture viene utilizzato per rilevare la frequenza di motilità delle colture e la spettrofotometria che misura la distribuzione degli alimenti nelle colture e nell'intestino viene utilizzata per prevedere l'efficienza della motilità delle colture. Questi due metodi sono facili da eseguire e altamente sensibili. Inoltre, il metodo spettrofotometria può essere modificato per rilevare l'uso di cibo in Drosophila. Ad esempio, l'ingestione di cibo in breve tempo può essere valutata rilevando la quantità di colorante in tutto l'intestino. Lo stato continuo di distribuzione degli alimenti tra colture e intestino può essere valutato rilevando le quantità di colorante nelle mosche alimentate con cibo colorante per alcuni giorni.
Ci sono alcune considerazioni tecniche in questo protocollo. Per il metodo di conteggio della contrazione delle colture, è essenziale sezionare ed estrarre il raccolto con attenzione nel buffer PBS. La soluzione salina non è l'ambiente fisiologico della coltura. Il raccolto deve rimanere collegato al corpo, e la mosca deve essere viva e sveglia; in caso contrario, il raccolto perde la capacità di contrarsi. Si consiglia di contare la contrazione del raccolto in mosche intatte e13. Per il metodo di spettrofotometria, la separazione delle colture dall'IG sezionata e il loro trasferimento in un pozzo 96 dopo l'alimentazione alimentare devono essere fatte con attenzione e rapidamente. Il colorno viene utilizzato per indicare la quantità di cibo nel raccolto e nell'intestino. Durante il processo di dissezione, il raccolto e l'intestino dovrebbero essere in contatto. Se il tinrio fuoriesse nel supporto di dissezione, il campione non può essere utilizzato. Con la pratica, un tecnico esperto può terminare la dissezione e la separazione delle colture entro 30 s.
In precedenza, questi metodi sono stati utilizzati per valutare la motilità delle colture nelle mosche mutanti nprl2 di 15 giorni che avevano ingrandito le colture8. In questo caso, sono state quantificate la contrazione delle colture e la distribuzione degli alimenti nei mutanti nprl2 di 3 giorni con dimensioni normali delle colture. Coerentemente con la diminuzione del tasso di contrazione delle colture, i mutanti nprl2 mostravano meno coloranti alimentari nell'intestino. Questi risultati suggeriscono che i mutanti nprl2 hanno alcuni difetti nella motilità delle colture anche in giovane età. Lo sfondo yw è stato usato come controllo di tipo selvaggio perché è il background genetico del mutante nprl2. Per altri esperimenti, ceppi come Canton S e w118, potrebbero essere utilizzati come controlli. Altri gruppi utilizzano una diversa soluzione di dissezione (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35,5 mm di saccarosio, pH 7,1) per rilevare la contrazione delle colture13,14,15. Il tasso di contrazione delle colture riscontrato nelle mosche di controllo in questo studio è inferiore a quello riportato da Solari et al.15, ma superiore a Chtarbanova et al.14 e Peller et al.13. Questa differenza può essere causata dai diversi background genetici o dai mezzi di dissezione.
In tutto, la spettrofotometria del colorante blu insieme alla contrazione delle colture può essere utilizzata in modo efficiente per valutare la motilità delle colture. Il protocollo qui presentato contribuisce a rendere la Drosophila un buon modello per lo studio di fisiologia del tratto GI.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) e sei picchi di talenti progetto nella provincia di Jiangsu (n. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
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