ショウジョウバエにおける作物運動性と食物過大評価の測定

Summary

このプロトコルの目的は、作物の収縮を測定し、ショウジョウバエ腸内の食物分布を定量化することです。

Abstract

ほとんどの動物は食物を消化するために消化管(GI)を使用します。消化管で摂取した食品の動きは、栄養吸収に不可欠です。障害を持つGI運動性と胃の空は、複数の疾患および症状を引き起こす。強力な遺伝モデル生物として、ショウジョウバエはGI運動性研究に使用することができます。D好酸球作物は、哺乳類の胃に機能的に似たさらなる消化のために食べ物を収縮させ、中腸に移動する器官である。提示は、簡単な測定ツールを使用してショウジョウバエ作物運動性を研究するためのプロトコルです。作物の運動性を評価する作物収縮を数える方法と、分光光度計を用いて作物と腸の間で青色に染めた食品の分布を検出する方法について説明する。この方法は、対照とnprl2変異型ハエとの間の作物運動性の違いを検出するために使用した。このプロトコルは、コスト効率が高く、作物の運動性に高い感度を持っています。

Introduction

ほとんどの動物は、環境からエネルギーや栄養素を吸収するために消化管(GI)と呼ばれる消化管を持っています。人の消化管は食道、胃、小腸、大腸(大腸)の4つの部分で構成されています。栄養吸収には胃から腸への食物の通過が不可欠です。老化、毒性薬物、および感染などのいくつかのエフェクターは、消化不良、胃食道逆流症、便秘などのいくつかの疾患およびそれらの症状に関連する消化管運動性および胃の空虚を引き起^こす。

フルーツフライ(ショウジョウバエメラノガスター)は、その容易な遺伝子操作のために生物医学研究で広く使用されているモデル動物です。重要なことに、ヒト疾患に関連する遺伝子の約77%がショウジョウバエ²において同族体を有する。ショウジョウバエを用いた研究は、多くの疾患メカニズムの理解において大きな進歩を遂げてきた。強力な遺伝モデル生物として、ショウジョウバエはGIの管の研究³で広く使用されている。ショウジョウバエは、より単純な消化管を有し、これは3つの離散ドメイン(前腸、中腸、および後腸⁴⁾に分けられる。前腸の一部である作物は、摂取した食品貯蔵の場所として機能するバッグのような構造です。中腸は、長い管であり、上皮層を介した食物消化および栄養吸収の部位として機能し、これは吸収性腸球(ECs)および分泌腸内分泌(EE)細胞⁵からなる。興味深いことに、ショウジョウバエの胃機能は、2つの部分に分かれています:作物は食品貯蔵として機能し、銅細胞領域(CCR)はpH<36を有する⁶高酸性領域である。ショウジョウバエでは、摂取した食物は最初は作物に移され、その後中腸7に送り込^まれる。したがって、作物は食物の通過に重要な役割を果たしています。内臓の筋肉に包まれ、バルブとスフィンクターの複雑な配列で構成され、作物は収縮し、さらなる消化のために中間腸に食べ物を移動し続けます。

このプロトコルは、ショウジョウバエの作物から中腸への食糧移動の検出を可能にする。作物収縮は、作物収縮頻度をカウントすることによって評価される。さらに、作物の食品の通過に対する効果を調べるのは、作物と腸の間の食物分布を検出することによって行われます。さらに、食品流通は、異なる摂食期間を使用して、即時の食品の動きまたは基本的な食品状態を反映するために使用することができる。このプロトコルは、ショウジョウバエの作物運動性と食物の通過を迅速に評価する方法を提供する。

Protocol

1. 実験ハエの維持と準備

1. 10 mLの新鮮な食品(1%寒天、2.4%の醸造酵母、3%スクロース、5%コーンミール)を含むバイアルでハエを湿度60%の25°Cのインキュベーターに維持します。インキュベーターの光サイクルを12-h光:12-h暗に設定します。
2. 所望の遺伝子型の多数が同時に閉じるように、培養若いハエ(1-3日)は、表面に乾燥した酵母を3日間標準的な食品で行います。大人を湿った酵母を含む標準的な食品と新しい食品バイアルに2日間移し、産卵を可能にします。より多くの卵を収集するために新しいバイアルに成虫のハエを開発し、転送するためにインキュベーターに卵を残します。
3. 毎日精通したオスまたはメスのハエを収集し、所望の年齢に維持条件で標準的な食品と新しいバイアルでそれらを培養します。
   注:より多くの同じ年齢のハエを得るために、所望の遺伝子型の複数のバイアルを同時に設定することができます。大人のフライ文化のバイアルは3〜5日ごとに変更する必要があります。

2. 作物の収縮を数える

1. _CO2でハエを麻酔し、136.89 mM NaCl、2.67 mM KCl、8.1 mM Na₂HPO_4、および1.76mM MM₂PO PO₄で構成される200 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH = 7.4)を含む解剖プレートウェルに1つのハエを取り込みます。
2. ピンセットを1組使用して胸郭でハエをつかみ、別のピンセットを使用して胸郭をスムーズに開き、反対側の端を引いて腹部を開きます。慎重に体から作物と腸を取り出します。
3. フライが目を覚ますのを待ってから、作物を視覚化し、それが1分で収縮する回数を数えます。
   注: クロップローブの完全な波だけが1つの収縮としてカウントされます。
4. 30s間隔の5倍のステップ2.3を繰り返します。
5. 1 分間の収穫収縮の平均数を計算します。
   注:収縮カウント中に、ハエは生きている必要があり、腸は無傷で、解剖後に前部および後部の端に取り付けられるべきです。

3. 染め食品の準備

1. PBSの青色染料(材料表)を20%(w/v)の濃度で計量して溶解します。
2. 20%の青色染料を沸騰した液体維持食品(ステップ1.1)に加え、食品冷却プロセス中に0.5%(w/v)の最終濃度に1:40希釈します。
   注:青い染料は、食品が冷却する前に追加され、攪拌とよく混合されます。PBS で青い染料を溶解する任意です。蒸留水も適している。

4. ハエに染めた食べ物を与える

1. 同じ年老いたハエのグループを飢餓食品(蒸留水の1%寒天)でバイアルに4時間移し、食物摂取量を確保する。
2. 食べ物が青に染められた新しいバイアルにハエを移し、所望の時間のためにハエを培養します。
   注:給餌時間は重要な要素であり、研究目的によって異なります。短い給餌は、食物が通過する時間内に、作物から腸までの食物運動性の速度を評価するために使用することができる。メンテナンス条件では、食品は約2時間で通過します。ただし、通過の時間は、カルチャ条件に関連している可能性があります。長い給餌は、数日まで、作物と腸の間の持続的な食物分布状態を評価するために使用することができる。

5. ハエを解剖し、作物や腸内の染料サンプルを収集する

1. CO₂でハエを麻酔し、1x PBSの200 μLを含む解剖プレートに1つのハエを取ります。
2. ピンセットの1組を使用して胸郭でハエをつかみ、ピンセットの別のペアを使用して体から頭を取り除きます。残りのボディを200 μLの1x PBSを含む新しいウェルに移動します。
3. 1x PBSの200 μLでピンセットを使用して200 μLを軽く振って、フライボディに取り付けられた染料を洗浄して本体2倍を洗います。
4. 2組のピンセットを使用して腹部を穏やかに滑らかに開き、腸全体を体から慎重に分離します。
5. 慎重に全体の腸から作物を取り除き、1x PBSの100 μLのチューブに入れます。
6. 最後に、1x PBSの100 μLを持つ別のチューブに、作物(以下、腸と呼ばれる)を含まない腸全体を入れます。
7. ピペットチップを使用してチューブで作物と腸を粉砕し、染料をPBSに溶解させます。
8. 実験の計画に十分な作物と根性が集まるまで、ステップ5.1~5.7を繰り返します。
   注:作物と腸は完全に均質化され、すべての染料はバッファに溶解する必要があります。研究目的のために、1つまたは複数の作物または根性を1つのチューブに集めることができます。

6. 作物と腸内の染料量の計算

1. サンプルチューブを最高速度で1分間遠心し、90 μLの上清を96ウェルプレートのウェルに移します。
2. 1 x 10^-7 g/mL から 1 x 10^-4 g/mL までの濃度で一連の青色色素希釈液を標準として作成します。
3. 96ウェルプレートのウェルに90 μLの標準を追加します。
4. プレート分光光度計で630nmのサンプルと規格の吸光度を測定します。
5. 標準曲線を作成するには、各標準の吸光度と濃度の折れ線グラフをプロットします。次に、ポイントを通して最適なフィット線を描き、サンプル中の染料濃度の計算に使用される方程式を得ます。
6. 0.1 mLのサンプル濃度を掛けて染料の量を計算します。

Representative Results

これらの方法は、作物収縮率をカウントし、染色された食品分布を検出するために、食品運動性に関する作物機能を評価するために使用することができる。作物の収縮は、食べ物を腸に押し込む頻度を反映しています。短い摂食期間後のハエ中の染料の分布は、作物から中腸への即時の食物通過を示す。

ラパマイシン複合体1(TORC1)の標的は、栄養素および細胞代謝を媒介するマスターレギュレータである。TORC1阻害は、ショウジョウバエを含む多くの生物の寿命を延ばす。TORC1の阻害剤として、nprl2変異型フライはTORC1およびGI消化欠陥^88,99の過剰活性化を示す。nprl2変異体の作物サイズは、その遺伝的背景制御(yw)8と比較して、生後3日で正常であり、15日⁸で拡大する。作物運動性アッセイを評価するために、3日齢のnprl2変異型ハエおよびywコントロールを使用した。各作物を5回数え、平均値を用いた(補足表1)。5回の繰り返しの間の作物収縮の数は同様であり、PBSは短い摂食で作物生理学に影響を与えない可能性があり、作物収縮カウントに適していることを示唆している。nprl2突然変異は、作物収縮率を有意に減少させた(図1)。

哺乳類の胃と同様に、ショウジョウバエ作物は食べ物を腸に移動するために収縮し続ける。さらに作物上のNprl2の機能を確認するために、食品の動きが検出された。ハエは30分間染めた食べ物を与えられ、分光光測定を用いて作物および腸内の染料の量を検出するためにすぐに解剖した。図2Aに示すように、対照とnprl2変異体の作物における青色染料量は類似しており、以前に報告された同等の作物サイズ⁸と一致した。nprl2変異体は腸内の染料が少なく、収縮率の低下に関連している可能性がある(図2B)。

図1:対照とnprl2変異体雄間の作物収縮差。3日齢の雄のハエを解剖し、作物の収縮率を数えた。各フライのトリミング収縮頻度はデータポイントとして表示されます。エラー バーは、指定されたデータ ポイントからの SD を表します。、P < 0.001。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:短い給餌時間後の対照とnprl2変異体の男性との食物分布の違い。3日齢の雄ハエは、0.5%の青色染料を含む食品を30分間与え、すぐに解剖して染料量を検出した。(A) 作物中の染料量。(B) 作物を含まない腸内の染料量。**, P < 0.01;NS、重要ではありません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:図1で使用されている作物収縮の元のデータFigure 1をクリックして、この表をダウンロードしてください。

Discussion

ショウジョウバエでは食物を摂取し、消化のために作物から腸に移動します。この過程で、栄養素が吸収され、廃棄物は便として体外に排出されます。このように、食物摂取と便の放出を比較して、体内の食物の動きの速度を大まかに評価するために使用することができる。毛細管フィーダー(CAFE)の方法は、食品摂取^10,11,11を測定するために広く使用されている。便数カウントの方法は、便の作成量を推定するために使用することができる^12。しかし、ショウジョウバエ体の食物の動きは、作物運動性を含む多くの要因の制御下にある。CAFEや便数計法では、作物の機能を簡単に評価できません。このプロトコルは、ショウジョウバエの作物から腸への穀物運動性と食物の通過を定量的に評価することができます。

作物の運動性は、食品の通過とショウジョウバエの生存に不可欠です。作物の機能に影響を与えるいくつかの遺伝子変異やウイルス感染は、寿命^{77、13、1413}の寿命^を14低下させる。このプロトコルは、作物運動に影響を与える変異体および薬物をスクリーニングし、評価するために使用することができる。作物収縮計数は作物運動頻度を検出するために使用され、作物および腸内の分光光度計は作物運動効率を予測するために使用されます。これら 2 つの方法は、実行が容易で、高感度です。さらに、分光光度法は、ショウジョウバエの食品使用量を検出するように変更することができる。例えば、短時間での摂取の食品は、腸全体の染料量を検出することによって評価することができる。作物と腸の間の継続的な食物分布の状態は、数日間染料食品を与えられたハエ中の染料量を検出することによって評価することができる。

このプロトコルには、いくつかの技術的な考慮事項があります。作物収縮計法では、PBSバッファー内で慎重に解剖し、作物を取り出す必要があります。生理食塩水は作物の生理的環境ではない。作物は体に接続されたままでなければならず、ハエは生きて目を覚まさなければなりません。それ以外の場合、作物は契約する能力を失います。それは同様に¹³を無傷のハエで作物の収縮を数えることを示唆しています。分光光度法では、解剖されたGIからの作物の分離と、食品染料供給後の96ウェルプレートへのそれらの移動を慎重かつ迅速に行う必要があります。染料は、作物と腸内の食物の量を示すために使用されます。解剖プロセス中に、作物と腸が接触する必要があります。染料が解剖媒体に漏れた場合、サンプルは使用できません。練習では、熟練した技術者は、30 s以内の解剖と作物の分離を完了することができます。

以前は、これらの方法は、作物⁸を拡大した15日前のnprl2変異型ハエにおける作物運動性を評価するために使用された。この場合、正常な作物サイズを有する3日前のnprl2変異体における作物収縮および食物分布を定量化した。減少した作物収縮率と一致して、nprl2変異体は腸内でより少ない食物染料を示した。これらの結果は、nprl2変異体が若い年齢でも作物運動性に欠陥があることを示唆している。ywの背景は、nprl2変異体の遺伝的背景であるため、野生型制御として使用された。他の実験では、カントンSやw w¹¹⁸のような株がコントロールとして使用されるかもしれません。他のグループは、異なる解剖液(123 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl_2、8mM MgCl 2、35.5₂mMショ糖、pH=7.1)を使用して作物収縮13、14、15を検出する。^13,14,15この研究で見つかった作物収縮率は、Solari et al.¹⁵によって報告されたよりも低いが、Chtarbanova et al.¹⁴およびPellerらより高^い。この違いは、異なる遺伝的背景または解剖媒体によって引き起こされる可能性があります。

全体として、青色素分光度計と作物収縮を併用して、作物運動性を評価するために効率的に使用することができる。ここで示すプロトコルは、ショウジョウバエをGIトラクト生理学研究のための良いモデルにするのに役立ちます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30