Summary
이 프로토콜의 목표는 드로소필라 용기의 작물 수축을 측정하고 식품 유통을 정량화하는 것입니다.
Abstract
대부분의 동물은 음식을 소화하기 위해 위장관 (GI) 항로를 사용합니다. 기관에서 섭취 한 음식의 움직임은 영양소 흡수에 필수적입니다. 무질서한 GI 운동성 및 위 비우는 다중 질병 및 현상을 일으키는 원인이 됩니다. 강력한 유전 모델 유기체로서 Drosophila는 GI 운동성 연구에 사용될 수 있습니다. D로소필라 작물은 포유류 위장과 기능적으로 유사한 추가 소화를 위해 음식을 미드구트로 계약하고 이동하는 기관입니다. 제시는 간단한 측정 도구를 사용하여 Drosophila 작물 운동성을 연구하는 프로토콜입니다. 작물 수축을 계산하여 작물 의 운동성을 평가하는 방법과 분광계를 사용하여 작물과 장 사이에 파란색으로 염색된 식품의 분포를 검출하여 식품 패세이징에 대한 작물의 효과를 조사하는 방법이 설명되어 있다. 이 방법은 대조군과 nprl2 돌연변이 파리 사이의 작물 운동성의 차이를 감지하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 비용 효율적이며 작물 운동성에 매우 민감합니다.
Introduction
대부분의 동물은 환경에서 에너지와 영양분을 흡수하는 위장관 (GI) 관에게 불린 소화관을 가지고 있습니다. 인간 기관은 식도, 위, 소장 및 대장 (결장)의 네 부분으로 구성됩니다. 위장에서 장으로 음식 통로는 영양 흡수에 필수적입니다. 노화, 독성 약물 및 감염과 같은 일부 이펙터는 소화 불량, 위식도 역류 질환 및 변비1과같은 일부 질병 및 증상과 관련된 장애된 기관 운동성 및 위 비우기를 유발합니다.
과일 파리(Drosophila 멜라노가스터)는쉽게 유전 적 조작으로 인해 생물 의학 연구에서 널리 사용되는 모델 동물입니다. 중요하게도, 인간 질병과 관련되었던 유전자의 대략 77%는 Drosophila2에 있는 호모로그를 가지고있습니다. Drosophila를 사용 하 여 연구는 많은 질병 메커니즘의 우리의 이해에 거 대 한 발전을 했다. 강력한 유전 적 모델 유기체로서, Drosophila는 GI tract 연구3에서널리 사용됩니다. 드로소필라는 세 가지 이산 영역으로 나뉘어져 있는 간단한 소화관을 가지고 있습니다: 전가, 미드구트 및 힌드구트4. 작물, 전장의 일부, 섭취 식품 저장에 대 한 사이트 역할을 하는 가방 같은 구조. 미드구트는 농생장세포(EC)와 분비장내분비(EE) 세포5로구성된 상피층을 통한 식품 소화 및 영양 흡수 부위로서 긴 튜브 및 기능이다. 흥미롭게도, 드로소필라의 위장 기능은 두 부분으로 나뉩니다: 식품 저장과 구리 세포 영역(CCR)으로서 작물 기능은 pH & lt;36을가진 고산성 영역이다. 드로소필라에서섭취된 음식은 처음에는 작물로 옮겨져 미드구트7로펌핑됩니다. 따라서, 작물은 음식 패시징에 중요한 역할을한다. 내장 근육에 둘러싸여 밸브와 스핑크터의 복잡한 배열로 구성된 작물은 추가 소화를 위해 중간 구장으로 음식을 수축하고 이동유지합니다.
이 프로토콜은 드로소필라의작물에서 미드구트까지 음식 이동을 감지할 수 있게 해줍니다. 작물 수축은 작물 수축 빈도를 계산하여 평가됩니다. 또한 작물과 장 사이의 식품 분포를 감지하여 식품 패싱에 대한 작물의 효과를 조사합니다. 또한, 식품 분포는 다른 수유 기간을 사용하여 즉각적인 음식 운동 또는 기본 식품 상태를 반영하는 데 사용할 수 있습니다. 종합하면, 이 프로토콜은 Drosophila에서작물 운동성과 음식 패청기를 신속하게 평가하는 방법을 제공합니다.
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Protocol
1. 실험용 파리 를 유지하고 준비합니다.
- 25°C에서 25°C의 인큐베이터에서 갓 만든 식품 10mL(1% 한천, 2.4% 양조업자 효모, 3% 자당, 옥수수 5%)를 함유한 바이알에서 파리를 유지합니다. 인큐베이터의 라이트 사이클을 12h 라이트:12-h 어둡게 설정합니다.
- 원하는 유전자형의 다수가 동시에 닫히도록 하기 위해, 문화 젊은 파리 (1-3 일 오래 된) 표면에 건조 효모와 표준 식품에서 3 일 동안. 젖은 효모를 포함한 표준 음식과 함께 성인을 새로운 음식 병으로 옮기고 2 일 동안 계란 누워를 허용하십시오. 인큐베이터에 계란을 두고 성인 파리를 새로운 유리병으로 옮겨 더 많은 계란을 수집합니다.
- 매일 밀폐된 남성 또는 암컷 파리를 수집하고 원하는 나이에 유지 보수 조건에서 표준 음식과 함께 새로운 유리병에 배양하십시오.
참고: 더 많은 동일 나이 파리를 얻으려면 원하는 유전자형의 여러 유리알을 동시에 설정할 수 있습니다. 성인 비행 문화의 바이알은 3-5 일마다 변경해야합니다.
2. 작물 수축 계산
- CO2로 파리를 마취하고 1x 인산완충식살린 200μL(PBS, pH = 7.4)를 함유한 해부판에 1번 날아가 136.89m NaCl, 2.67m MM KCl, 8.1m M MNa2HPO 4, 1.76m4M4, 1.76mPO4m.
- 한 쌍의 핀셋을 사용하여 흉부에서 비행을 잡고 다른 핀셋을 사용하여 흉부를 부드럽게 열고 반대 방향으로 끝을 당겨 복부를 엽니다. 조심스럽게 몸에서 작물과 용기를 꺼내.
- 비행이 깨어나고 작물을 시각화하고 1 분 안에 계약 횟수를 계산할 때까지 기다립니다.
참고: 작물 로브의 완전한 파도만 하나의 수축으로 계산됩니다. - 30s 간격 사이의 5x에 대해 2.3 단계를 반복합니다.
- 분당 평균 작물 수축 수를 계산합니다.
참고: 수축 카운트 하는 동안, 비행 살아 야 한다, 그리고 창 자 그대로 하 고 그것의 전방및 후방 끝에 부부 후 종료 해야 합니다.
3. 염색식품 준비
- PBS에서 20%(w/v)의 농도로 파란색 염료(재료표)를계량하고 용해합니다.
- 식품 냉각 과정에서 최종 농도0.5%(w/v)에 1:40 희석을 하여 삶은 액체 유지 보수 식품(1.1단계)에 20%의 청색 염료를 넣습니다.
참고: 파란 염료는 음식이 식기 전에 첨가되고 교반과 잘 섞입니다. PBS에서 청색 염료를 용해하는 것은 선택 사항입니다. 증류수도 적합합니다.
4. 염색된 음식으로 파리를 먹이기
- 같은 숙성 된 파리의 그룹을 기아 식품 (증류수의 1 % 한마)으로 유리병으로 옮겨 4 시간 동안 음식 섭취를 보장합니다.
- 파리를 새 유리알로 옮기고, 원하는 시간 동안 파리를 배양하여 식품염색블루로 염색합니다.
참고: 먹이 주기 시간은 중요한 요소이며 연구 목적에 따라 다릅니다. 짧은 수유, 통과 하는 음식의 시간 내에서, 작물에서 창 자에 음식 운동성의 속도를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 유지 보수 조건에서 식품은 약 2 시간 동안 통과합니다. 그러나 통과 시기는 문화 조건과 관련이 있을 수 있습니다. 긴 먹이, 최대 며칠, 작물과 창 자 사이 지속적인 음식 분포 상태를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 작물과 장에서 파리를 해부하고 염료 샘플을 수집
- CO2로 파리를 마취하고 1x PBS 200 μL을 포함하는 해부 판에 한 번 날아갑니다.
- 한 쌍의 핀셋을 사용하여 흉부에서 비행을 잡고 다른 핀셋을 사용하여 머리를 몸에서 떼어 내십시오. 나머지 바디를 1x PBS의 200 μL을 포함하는 새로운 우물로 이동합니다.
- 1x PBS 의 200 μL에서 핀셋을 사용하여 플라이 바디에 부착된 염료를 청소하여 2배 의 몸을 부드럽게 흔들어 바디를 세척하십시오.
- 두 쌍의 핀셋을 사용하여 복부를 부드럽고 부드럽게 열고 전체 용기를 몸에서 조심스럽게 분리합니다.
- 조심스럽게 전체 창자에서 작물을 벗고 1 x PBS의 100 μL튜브에 넣어.
- 마지막으로, 1x PBS의 100 μL을 가진 다른 튜브에 자르기 없이 전체 창자를 넣습니다(이하 용기라고 함).
- 파이펫 팁을 사용하여 튜브에서 각각 자르기와 내장을 분쇄하여 염료가 PBS에 용해되도록 합니다.
- 5.1-5.7 단계를 반복하여 설계된 실험을 위해 충분한 작물과 내장이 수집될 때까지 반복하십시오.
참고: 작물과 창자는 완전히 균질화되어야 하며 모든 염료를 버퍼에 용해해야 합니다. 연구 목적으로 하나 또는 여러 작물 또는 창 자를 하나의 튜브에서 수집할 수 있습니다.
6. 작물과 창자에 염료 양을 계산
- 원심 분리는 1 분 동안 최고 속도로 샘플 튜브를 원심 분리하고 96 웰 플레이트의 우물에 90 μL을 전송합니다.
- 표준으로 1 x 10-7 g/mL에서 1 x 10-4 g/mL농도로 일련의 파란색 염료 희석제를 만듭니다.
- 96 웰 플레이트의 우물에 90 μL 표준을 연이어 추가합니다.
- 플레이트 분광광계로 630 nm에서 샘플 및 표준의 흡광도를 측정합니다.
- 표준 곡선을 만들려면 각 표준에 대해 흡광도 대 농도의 선 그래프를 플롯합니다. 그런 다음 샘플을 통해 염료 농도를 계산하는 데 사용되는 방정식을 얻기 위해 점을 통해 가장 적합한 선을 그립니다.
- 샘플 농도를 0.1mL로 곱하여 염료의 양을 계산합니다.
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Representative Results
작물 수축 속도를 계산하고 염색 된 식품 분포를 감지하는 이러한 방법은 식품 운동성에 작물 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 작물 수축은 음식을 창자에 밀어 넣는 빈도를 반영합니다. 짧은 수유 기간 후에 즉석에서 염료의 분포는 작물에서 미드구트로 지나가는 즉각적인 음식을 나타냅니다.
라파마이신 복합체 1(TORC1)의 표적은 영양소와 세포 대사를 중재하는 마스터 레귤레이터입니다. TORC1 억제는 드로소필라를포함한 많은 유기체에서 수명을 연장한다. TORC1의 억제제로, nprl2 돌연변이 플라이는 TORC1 및 GI 소화 결함8,,9의과잉 활성화를 표시한다. nprl2 돌연변이체의 자르기 크기는 3일 된 때 정상이며 15일 전에 확대되며, 유전적 배경제어(yw)8과비교하면 확대된다. 작물 운동성 분석기를 평가하기 위해 3일 된 nprl2 돌연변이 파리와 yw 컨트롤이 사용되었습니다. 각 작물은 5번 계산되었고 평균 값이사용되었습니다(보충표 1). 5 회 반복 중 작물 수축의 수는 유사했다, 이는 PBS짧은 수유에서 작물 생리학에 영향을미치지 않을 수 있음을 시사하고 작물 수축 계산에 적합하다. nprl2 돌연변이는 작물 수축률을 현저히 감소시켰습니다(도1).
포유류 위장과 마찬가지로, 드로소필라 작물은 음식을 장으로 옮기는 데 계속 계약을 맺습니다. 작물에 대한 Nprl2의 기능을 추가로 확인하기 위해 식품 운동이 감지되었습니다. 파리는 30 분 동안 염색 식품으로 공급되었고 분광계를 사용하여 작물과 용기의 염료 양을 감지하기 위해 즉시 해부되었습니다. 도 2A에도시된 바와 같이, 대조군 및 nprl2 돌연변이의 작물에 있는 청색 염료 양은 유사했으며, 이전에 보고된 비교 작물 크기8과일치했다. nprl2 돌연변이체는 창자에 염료가 적었으며, 이는 수축률 감소율(도2B)과연관될 수 있다.
그림 1: 대조군과 nprl2 돌연변이 수컷 간의 작물 수축 차이. 3일 된 수컷 파리는 해부되었고 작물 수축률이 계산되었습니다. 각 플라이의 작물 수축 빈도가 데이터 포인트로 표시됩니다. 오류 막대는 표시된 데이터 포인트에서 SD를 나타냅니다. , P & 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 짧은 수유 시간 후에 대조군과 nprl2 돌연변이 수컷 간의 음식 분포 차이. 3일 된 수컷 파리는 30분 동안 0.5%의 청색 염료를 함유한 식품으로 공급한 다음 즉시 해부하여 염료 양을 검출했습니다. (A)작물의 염료 양. (B)작물없이 창자에 염료 금액. **, P&01; NS, 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 그림 1에 사용된 작물 수축의 원래 데이터는 Figure 1. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
드로소필라에서 섭취 한 음식은 작물에서 소화를위한 장으로 이동합니다. 이 과정에서 영양분이 흡수되고 폐기물이 대변으로 몸밖으로 추방됩니다. 따라서, 대변 배출과 함께 음식 섭취를 비교하는 것은 대략 바디에 있는 음식 운동의 속도를 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 모세관 피더(CAFE)의 방법은 식품섭취(10,,11)를측정하는 데 널리 사용된다. 대변 수 계산 방법은 대변생성(12)의양을 추정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, Drosophila 바디에 있는 음식 운동은 작물 운동성을 포함하여 많은 요인의 통제의 통제의 밑에 있습니다. 작물 기능은 CAFE 및 대변 계수 방법을 사용하여 쉽게 평가할 수 없습니다. 이 프로토콜은 Drosophila에서작물에서 창자에 작물 운동성 및 음식 패청기를 정량적으로 평가할 수 있습니다.
작물 운동성은 음식 패시징과 드로소필라 생존에 필수적입니다. 작물 기능에 영향을 미치는 일부 유전자 돌연변이 또는 바이러스 감염은 수명감소7,,13,,14로이어져 있다. 이 프로토콜은 작물 운동성에 영향을 미치는 돌연변이및 약물을 선별하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 작물 수축 카운트작물 운동성 주파수를 감지하는 데 사용되며 작물 및 창자에 있는 식품 분포를 측정하는 분광측약은 작물 운동성 효율을 예측하는 데 사용됩니다. 이 두 가지 방법은 수행하기 쉽고 매우 민감합니다. 더욱이, 분광광법 법은 드로소필라에서음식 사용을 검출하기 위해 수정될 수 있다. 예를 들어, 짧은 시간 내에 음식 섭취는 전체 창자에서 염료 양을 검출하여 평가될 수 있다. 작물과 창자 사이의 지속적인 식품 분포 상태는 며칠 동안 염료 식품으로 공급되는 파리의 염료 양을 감지하여 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 기술적 고려 사항이 있습니다. 작물 수축 계산 방법의 경우 PBS 버퍼에서 작물을 신중하게 해부하고 꺼내는 것이 필수적입니다. 식염수 용액은 작물의 생리환경이 아닙니다. 작물은 몸에 연결되어 있어야하며, 비행은 살아 깨어 있어야합니다; 그렇지 않으면 작물은 계약 할 수있는 능력을 잃게됩니다. 그것은 뿐만 아니라13에 작물 수축을 계산 하는 것이 좋습니다. 분광성 방법의 경우, 해부된 GI로부터 작물을 분리하고 식품 염료 수유 후 96웰 플레이트로 이송하는 것은 신중하고 신속하게 이루어져야 한다. 염료는 작물과 창자에 있는 음식의 양을 나타내는 데 사용됩니다. 해부 과정에서 작물과 창자에 접촉해야 합니다. 염료가 해부 매체로 누출되면 샘플을 사용할 수 없습니다. 연습으로 숙련 된 기술자는 30 s 이내에 해부 및 작물 분리를 완료 할 수 있습니다.
이전에는 이러한 방법으로 작물8을 확대한 15일 된 nprl2 돌연변이 파리의 작물 운동성을8평가하는 데 사용되었습니다. 이 경우, 정상적인 작물 크기를 가진 3 일 된 nprl2 돌연변이체의 작물 수축 및 식품 분포가 정량화되었다. 감소 된 작물 수축 속도와 일치, nprl2 돌연변이 창 자에 적은 음식 염료를 표시. 이러한 결과 제안 nprl2 돌연변이는 심지어 어린 나이에 작물 운동성에 몇 가지 결함이 있다. yW 배경은 nprl2 돌연변이의 유전적 배경이기 때문에 야생형 대조군으로 사용되었다. 다른 실험의 경우 캔톤 S 및 w118과같은 균주가 컨트롤로 사용될수 있습니다. 다른 그룹은 작물 수축 을 검출하기 위한 다른 해부 솔루션(123m NaCl, 2mM KCl, 1.8 mM CaCl2,8m MgCl2,35.5m 자당, pH = 7.1)을 사용하여 작물 수축을 검출한다13,,14,,15. 이 연구에서 볼방제 에서 발견되는 작물 수축률은 Solari 외15에의해 보고된 것보다 낮지만, Chtarbanova외. 14 및 펠러 외13보다높다. 이 차이는 다른 유전 적 배경 또는 해부 미디어에 의해 발생할 수 있습니다.
모두, 작물 수축과 함께 파란색 염료 분광측정법은 작물 운동성을 평가하는 데 효율적으로 사용될 수 있다. 여기에 제시된 프로토콜은 Drosophila를 기장 생리학 연구를 위한 좋은 모형을 만드는 것을 돕습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(제3187만2287호)의 지원을 받아 장쑤성 자연과학재단(NO. BK20181456) 및 강쑤성 6개 인재 피크 프로젝트(No. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
