Summary
Målet med denne protokollen er å måle avlingssammentrekning og kvantifisere matdistribusjon i Drosophila tarmen.
Abstract
De fleste dyr bruker mage-tarmkanalen (GI) til å fordøye mat. Bevegelsen av den inntatte maten i GI-kanalen er avgjørende for næringsabsorpsjon. Uorden GI motilitet og gastrisk tømming forårsake flere sykdommer og symptomer. Som en kraftig genetisk modell organisme, Drosophila kan brukes i GI motility forskning. Drosophila-avlingen er et organ som trekker seg sammen og flytter mat inn i midten for videre fordøyelse, funksjonelt lik en pattedyrmage. Presentert er en protokoll for å studere Drosophila avling motilitet ved hjelp av enkle måleverktøy. En metode for å telle avlingssammentrekninger for å evaluere avlingsmotilitet og en metode for å oppdage fordelingen av matfarget blått mellom avlingen og tarmen ved hjelp av et spektrofotometer for å undersøke effekten av avlingen på matpassaging er beskrevet. Metoden ble brukt til å oppdage forskjellen i avlingsmotilitet mellom kontroll og nprl2 muterte fluer. Denne protokollen er både kostnadseffektiv og svært følsom for avlingsmotilitet.
Introduction
De fleste dyr har et fordøyelsesrør kalt mage-tarmkanalen (GI) for å absorbere energi og næringsstoffer fra miljøet. Den menneskelige GI-kanalen består av fire deler: spiserøret, magen, tynntarmen og tykktarmen (kolon). Matpassasje fra magen til tarmen er avgjørende for næringsabsorpsjon. Noen effektorer, som aldring, giftige stoffer og infeksjon, forårsaker uorden GI-kanalmotilitet og gastrisk tømming, som er relatert til noen sykdommer og deres symptomer som dyspepsi, gastroøsofageal reflukssykdom og forstoppelse1.
Fruktfluen (Drosophila melanogaster) er et mye brukt modelldyr i biomedisinsk forskning på grunn av sin enkle genetiske manipulasjon. Viktigere, ca 77% av gener forbundet med menneskelig sykdom har en homolog i Drosophila2. Forskning ved hjelp av Drosophila har gjort enorme fremskritt i vår forståelse av mange sykdomsmekanismer. Som en kraftig genetisk modell organisme, Drosophila er mye brukt i GI tract forskning3. Drosophila har en enklere fordøyelseskanal, som er delt inn i tre diskrete domener: foregut, midgut og hindgut4. Avlingen, en del av foredelen, er en poselignende struktur som fungerer som et sted for inntatt matlagring. Midgut er et langt rør og fungerer som stedet for mat fordøyelse og næringsabsorpsjon gjennom epitellaget, som består av absorptive enterocytes (ECs) og sekretoriske enteroendokrine (EE) celler5. Interessant, magen funksjonen i Drosophila er delt inn i to deler: avlingen fungerer som mat lagring og kobbercelleregionen (CCR) er en svært sur region med en pH < 36. I Drosophilaflyttes den inntatte maten først til avlingen og deretter pumpes inn i midgut7. Dermed spiller avlingen en kritisk rolle i matpassaging. Innhyllet av viscerale muskler og bestående av et komplekst utvalg av ventiler og sphincters, fortsetter avlingen å trekke seg sammen og flytte mat inn i midtgut for videre fordøyelse.
Denne protokollen gjør det mulig for påvisning av matbevegelse fra avlingen til midgut i Drosophila. Crop sammentrekning evalueres ved å telle avling sammentrekning frekvens. I tillegg undersøkes effekten av avlingen på matpassaging ved å oppdage matfordelingen mellom avling og tarm. Videre kan matfordelingen brukes til å reflektere umiddelbar matbevegelse eller grunnleggende matstatus ved hjelp av forskjellige fôringsperioder. Samlet gir denne protokollen metoder for raskt å evaluere avlingsmotilitet og matpassaging i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedlikeholde og forberede eksperimentelle fluer
- Opprettholde fluer i hetteglass som inneholder 10 ml nylaget mat (1% agar, 2,4% bryggergjær, 3% sukrose, 5% maismel) i en inkubator ved 25 °C med 60% fuktighet. Sett lyssyklusen til inkubatoren til 12-timers lys: 12-timers mørk.
- For å sikre at et stort antall av de ønskede genotypen flyr eus samtidig, kultur unge fluer (1-3 dager gammel) i standard mat med tørr gjær på overflaten i 3 dager. Overfør de voksne til et nytt mat hetteglass med standard mat, inkludert våt gjær, i 2 dager for å tillate egglegging. La eggene i inkubatoren utvikle og overføre voksne fluer til et nytt hetteglass for å samle flere egg.
- Samle de eklosed mannlige eller kvinnelige fluer hver dag og kultur dem i nye hetteglass med standard mat på vedlikeholdstilstand til ønsket alder.
MERK: For å få flere fluer i samme alder, kan flere hetteglass med ønsket genotype settes opp samtidig. Hetteglassene for voksenfluekultur bør endres hver 3-5.
2. Telle avlingssammentrekninger
- Bedøv fluene med CO2 og ta en flue inn i en dissekereplate brønn som inneholder 200 μL av 1x fosfat bufret saltvann (PBS, pH = 7,4) bestående av 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4og 1,76 mM KH2PO4.
- Grip flyet på thoraxen ved hjelp av ett par pinsett, åpne thoraxen jevnt ved hjelp av et annet par pinsett, og trekk deretter enden i motsatt retning for å åpne magen. Ta avlingen og tarmen ut fra kroppen nøye.
- Vent til flyet skal våkne opp og deretter visualisere avlingen og telle antall ganger den kontrakter i 1 min.
MERK: Bare en fullstendig bølge på beskjæringskappene telles som én sammentrekning. - Gjenta trinn 2.3 for 5x mellom 30 s intervaller.
- Beregn gjennomsnittlig antall avlingssammentrekninger per minutt.
MERK: Under sammentrekningstellingen skal flyet være i live, og tarmen skal være intakt og festet ved fremre og bakre ender etter disseksjon.
3. Tilberedning av farget mat
- Vei og oppløs det blå fargestoffet (Tabell over materialer) i PBS ved en konsentrasjon på 20 % (m/v).
- Tilsett 20% blått fargestoff i kokt flytende vedlikeholdsmat (trinn 1.1) med en 1:40 fortynning til en endelig konsentrasjon på 0,5% (m / v) under matkjølingsprosessen.
MERK: Det blå fargestoffet tilsettes før maten kjøles ned og blandes godt med omrøring. Det er valgfritt å oppløse det blå fargestoffet i PBS; destillert vann er også egnet.
4. Fôring fluer med farget mat
- Overfør grupper av samme alderen fluer til hetteglassene med sultmat (1% agar i destillert vann) i 4 timer for å sikre matinntak.
- Overfør fluene til nye hetteglass med matfarget blått og kultur fluene for ønsket tid.
MERK: Fôringstiden er en kritisk faktor og avhenger av forskningsformålet. Kort fôring, innen mat passerer gjennom, kan brukes til å evaluere hastigheten på matmotilitet fra avling til tarm. Ved vedlikeholdsforholdene passerer maten gjennom i ca. 2 timer. Tiden for å passere gjennom kan imidlertid være relatert til kulturforhold. Lang fôring, opptil noen dager, kan brukes til å evaluere vedvarende matfordelingsstatus mellom avling og tarm.
5. Dissekere fluer og samle fargestoffprøver i avling og tarm
- Bedøv fluene med CO2 og ta en flue inn i en dissekereplate brønn som inneholder 200 μL av 1x PBS.
- Grip flyet på thoraxen ved hjelp av ett par pinsett og ta hodet av kroppen ved hjelp av et annet par pinsett. Flytt resten av kroppen til en ny brønn som inneholder 200 μL 1x PBS.
- Vask kroppen 2x ved å forsiktig riste den i 200 μL av 1x PBS ved hjelp av et par pinsett for å rengjøre fargestoffet festet til flykroppen.
- Forsiktig og jevnt åpne magen ved hjelp av to par pinsett og forsiktig skille hele tarmen fra kroppen.
- Ta forsiktig av avlingen fra hele tarmen og legg den i et rør med 100 μL 1x PBS.
- Til slutt, sette hele tarmen uten avling (heretter referert til som gut) i et annet rør med 100 μL av 1x PBS.
- Grind avlingen og tarmen henholdsvis i rør ved hjelp av pipette tips for å gjøre fargestoffet oppløses i PBS.
- Gjenta trinn 5.1−5.7 til nok avlinger og innvoller samles inn for eksperimentet som er utformet.
MERK: Avlingen og tarmen skal være fullstendig homogenisert, og alt fargestoff skal oppløses i bufferen. For forskningsformål kan en eller flere avlinger eller guts samles i ett rør.
6. Beregning av fargestoffmengder i avling og tarm
- Sentrifuger prøverørene med høyeste hastighet i 1 min og overføre 90 μL supernatant til brønnene i en 96 brønnplate.
- Lag en serie blå fargestoffutvidelser ved konsentrasjoner fra 1 x 10-7 g/ml til 1 x 10-4 g/ml som standard.
- Legg til en serie med 90 μL-standarder til brønnene på 96 brønnplaten.
- Mål absorbansen av prøvene og standardene ved 630 nm med et platespektrofotometer.
- For å skape en standardkurve, plott en linjegraf med absorbans vs. konsentrasjon for hver av standardene. Deretter trekker du en linje med best passform gjennom punktene for å få ligningen som brukes til å beregne fargestoffkonsentrasjonen i prøvene.
- Beregn mengden fargestoff ved å multiplisere prøvekonsentrasjonen med 0,1 ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse metodene for å telle avling sammentrekningshastighet og oppdage farget matdistribusjon kan brukes til å evaluere avlingsfunksjonen på matmotilitet. Avlingssammentrekningen reflekterer hyppigheten av å skyve mat inn i tarmen. Fordelingen av fargestoff i fly etter en kort fôringsperiode indikerer umiddelbar mat som passerer fra avling til midgut.
Målet for rapamycin kompleks 1 (TORC1) er en master regulator som medierer næringsstoff og celle metabolisme. TORC1 hemming forlenger levetiden i mange organismer, inkludert Drosophila. Som en hemmer av TORC1 viser den nprl2 muterte fluen hyperaktivering av TORC1 og GI fordøyelsesfeil8,,9. Avlingsstørrelsen i en nprl2 mutant er normal ved 3 dager gammel og forstørret ved 15 dager gammel, sammenlignet med sin genetiske bakgrunnskontroll (yw)8. For å evaluere avlingsmotilitetsanalysen ble det brukt 3-dagers nprl2 muterte fluer og yw-kontroller. Hver beskjæring ble talt fem ganger, og gjennomsnittsverdien ble brukt (Tilleggstabell 1). Tallene for avlingssammentrekningen i løpet av de fem repetisjonene var like, noe som tyder på at PBS kanskje ikke påvirker avlingsfysiologien i korte fôringer og er egnet for sammentrekningstelling. Den nprl2 mutasjonen reduserte signifikant frekvensen av avlingssammentrekning (figur 1).
I likhet med den pattedyrmagen fortsetter Drosophila-avlingen å flytte maten inn i tarmen. For ytterligere å bekrefte funksjonen til Nprl2 på avlingen, ble matbevegelse oppdaget. Fluene ble matet med farget mat i 30 min og dissekert umiddelbart for å oppdage mengden fargestoff i avlingen og tarmen ved hjelp av spektrofotometri. Som vist i figur 2Avar de blå fargestoffmengdene i avlingene av kontroll og nprl2-mutanter like, i samsvar med den tidligere rapporterte sammenlignbare avlingsstørrelsen8. De nprl2 mutantene hadde mindre fargestoff i tarmen, som kan være forbundet med redusert sammentrekningshastighet (figur 2B).
Figur 1: Forskjellen mellom kontroll og nprl2 muterte menn. De tre dager gamle hannfluene ble dissekert, og avlingskontraksjonsraten ble talt. Avlingssammentrekningsfrekvensen for hvert fly vises som et datapunkt. Feilfelt representerer SD fra det angitte datapunktet. , P < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Matfordelingsforskjell mellom kontroll og nprl2 muterte menn etter kort fôringstid. De 3-dagers gamle mannlige fluene ble matet med mat som inneholder 0,5% blå fargestoff i 30 min og deretter dissekert umiddelbart for å oppdage fargestoffmengden. Fargestoffmengdeni avlingen. Fargestoffmengdeni tarmen uten avling. **, P < 0,01; NS, ikke signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs tabell 1: De opprinnelige dataene for avlingssammentrekning brukt i figur 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I Drosophila inntatt mat beveger seg fra avlingen til tarmen for fordøyelsen. Under denne prosessen absorberes næringsstoffene, og avfallet blir utvist ut av kroppen som avføring. Dermed kan sammenligning av matinntak sammen med avføring utstøting brukes til å grovt vurdere hastigheten på matbevegelse i kroppen. Metoden for kapillærmater (CAFE) er mye brukt til å måle matinntak10,11. Metoden for avføring nummer telling kan brukes til å estimere mengden avføring etableringen12. Imidlertid er matbevegelsen i Drosophila kroppen under kontroll av mange faktorer, inkludert avlingsmotilitet. Beskjæringsfunksjonen kan ikke enkelt evalueres ved hjelp av CAFE og avføringstellingsmetoder. Denne protokollen kan kvantitativt vurdere avlingmotilitet og mat som passerer fra avling til tarm i Drosophila.
Crop motility er viktig for mat passaging og Drosophila overlevelse. Noen genmutasjoner eller virusinfeksjoner som påvirker avlingsfunksjonen resulterer i redusert levetid7,13,14. Denne protokollen kan brukes til å screene og evaluere mutanter og legemidler som påvirker avlingsmotilitet. Avlingssammentrekningen brukes til å oppdage frekvens avlingsmotilitet, og spektrometrimåling av matdistribusjon i avling og tarm brukes til å forutsi virkningseffektivitet. Disse to metodene er enkle å utføre og svært følsomme. Videre kan spektrofotometrimetoden endres for å oppdage matbruk i Drosophila. For eksempel kan matinntak innen kort tid evalueres ved å oppdage fargestoffmengden i hele tarmen. Den kontinuerlige matfordelingsstatusen mellom avling og tarm kan vurderes ved å oppdage fargestoffmengdene i fluene matet med fargestoffmat i noen dager.
Det er noen tekniske hensyn i denne protokollen. For avlingssammentrekningstellingsmetoden er det viktig å dissekere og ta ut avlingen nøye i PBS-buffer. Saltløsning er ikke det fysiologiske miljøet i avlingen. Avlingen må forbli koblet til kroppen, og flyet må være i live og våken; Ellers mister avlingen evnen til å trekke seg sammen. Det er foreslått å telle avling sammentrekning i intakte fluer samt13. For spektrofotometrimetoden bør separasjonen av avlingene fra den dissekerte GI og deres overføring til en 96 brønnplate etter matfarging gjøres nøye og raskt. Fargestoffet brukes til å indikere mengden mat i avlingen og tarmen. Under disseksjonsprosessen bør avlingen og tarmen være i kontakt. Hvis fargestoff lekker inn i disseksjonsmediet, kan ikke prøven brukes. Med praksis kan en dyktig tekniker fullføre disseksjon og avlingsseparasjon innen 30 s.
Tidligere ble disse metodene brukt til å evaluere avlingsmotiliteten i 15-dagers gamle nprl2 muterte fluer som hadde forstørrede avlinger8. I dette tilfellet ble avlingssammentrekningen og matfordelingen i 3-dagers gamle nprl2-mutanter med normal avlingsstørrelse kvantifisert. I samsvar med den reduserte avlingskontraksjonsraten viste nprl2-mutantene mindre matfargestoff i tarmen. Disse resultatene tyder på at nprl2 mutanter har noen feil i avlingmotilitet selv i ung alder. YW bakgrunnen ble brukt som en vill type kontroll fordi det er den genetiske bakgrunnen til nprl2 mutant. For andre eksperimenter kan stammer som Canton S og w118,, brukes som kontroller. Andre grupper bruker en annen dissekereløsning (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2,8 mM MgCl2,35,5 mM sukrose, pH = 7,1) for å oppdage avlingssammentrekning13,,14,15. Avlingstiltrekningsraten som finnes i kontrollen flyr i denne studien er lavere enn det som rapporteres av Solari et al.15, men høyere enn Chtarbanova et al.14 og Peller et al.13. Denne forskjellen kan være forårsaket av de ulike genetiske bakgrunner eller disseksjon media.
I alt kan blå fargestoffspektrofotometri sammen med avlingssammentrekning effektivt brukes til å evaluere avlingsmotilitet. Protokollen som presenteres her bidrar til å gjøre Drosophila til en god modell for GI-traktatfysiologistudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) og Seks talent topper prosjektet i Jiangsu-provinsen (Nr. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
