Summary
O objetivo deste protocolo é medir a contração da cultura e quantificar a distribuição de alimentos no intestino de Drosophila.
Abstract
A maioria dos animais usa o trato gastrointestinal (GI) para digerir alimentos. O movimento dos alimentos ingeridos no trato GI é essencial para a absorção de nutrientes. Motilidade desordenada e esvaziamento gástrico causam múltiplas doenças e sintomas. Como um poderoso organismo de modelo genético, o Drosophila pode ser usado em pesquisas de motilidade gi. A cultura Drosophila é um órgão que contrai e move alimentos para o meio para uma digestão mais aprofundada, funcionalmente semelhante a um estômago mamífero. Apresentado é um protocolo para estudar a motilidade da cultura Drosophila utilizando ferramentas de medição simples. Descreve-se um método de contagem de contrações agrícolas para avaliar a motilidade da cultura e um método para detectar a distribuição de alimentos tingidos de azul entre a cultura e o intestino usando um espectrofotômetro para investigar o efeito da cultura na passagem de alimentos. O método foi usado para detectar a diferença na motilidade da cultura entre o controle e as moscas mutantes nprl2. Este protocolo é ao mesmo tempo econômico e altamente sensível à motilidade das culturas.
Introduction
A maioria dos animais tem um tubo digestivo chamado trato gastrointestinal (GI) para absorver energia e nutrientes do ambiente. O trato gi humano é composto de quatro partes: esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso (cólon). A passagem de alimentos do estômago para o intestino é essencial para a absorção de nutrientes. Alguns efeitos, como envelhecimento, drogas tóxicas e infecção, causam motilidade do trato GI desordenado e esvaziamento gástrico, que está relacionado a algumas doenças e seus sintomas como dispepsia, doença do refluxo gastroesofágico e constipação1.
A mosca-das-frutas (Drosophila melanogaster) é um animal modelo amplamente utilizado em pesquisas biomédicas devido à sua fácil manipulação genética. É importante ressaltar que cerca de 77% dos genes associados à doença humana têm um homólogo em Drosophila2. Pesquisas usando Drosophila fizeram enormes avanços em nossa compreensão de muitos mecanismos de doença. Como um poderoso organismo de modelo genético, o Drosophila é amplamente utilizado na pesquisa do trato GI3. A drosophila possui um trato digestivo mais simples, que é dividido em três domínios discretos: foregut, midgut e hindgut4. A cultura, uma parte do foregut, é uma estrutura semelhante a uma bolsa que serve como um local para armazenamento de alimentos ingeridos. O midgut é um tubo longo e funciona como local para digestão alimentar e absorção de nutrientes através da camada epitelial, que consiste em enterócitos absortivos (CEs) e células enteroendócrinas secretas (EE)5. Curiosamente, a função estomacal em Drosophila é dividida em duas partes: a cultura funciona como armazenamento de alimentos e a região da célula de cobre (CCR) é uma região altamente ácida com pH < 36. Em Drosophila,o alimento ingerido é inicialmente movido para a cultura e posteriormente bombeado para o midgut7. Assim, a cultura desempenha um papel fundamental na passagem de alimentos. Envolta por músculos viscerais e consistindo de uma complexa variedade de válvulas e esfíncteres, a cultura continua contraindo e movendo alimentos para o meio para uma digestão adicional.
Este protocolo permite a detecção do movimento alimentar da cultura até o midgut em Drosophila. A contração da cultura é avaliada pela contagem da frequência de contração da cultura. Além disso, o efeito da cultura na passagem de alimentos é investigado pela detecção da distribuição de alimentos entre a cultura e o intestino. Além disso, a distribuição de alimentos pode ser usada para refletir o movimento alimentar imediato ou o status alimentar básico usando diferentes períodos de alimentação. Em conjunto, este protocolo fornece métodos para avaliar rapidamente a motilidade da cultura e a passagem de alimentos em Drosophila.
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Protocol
1. Manutenção e preparação de moscas experimentais
- Mantenha moscas em frascos contendo 10 mL de alimentos recém-feitos (1% de ágar, 2,4% de levedura cervejeira, 3% de sacarose, 5% de farinha de milho) em uma incubadora a 25 °C com 60% de umidade. Coloque o ciclo de luz da incubadora para 12 h de luz:12 h escuro.
- Para garantir que um grande número do genótipo desejado voe simultaneamente, a cultura de moscas jovens (1-3 dias de idade) em alimentos padrão com levedura seca na superfície por 3 dias. Transfira os adultos para um novo frasco de alimentos com alimentos padrão, incluindo levedura molhada, por 2 dias para permitir a colocação de ovos. Deixe os ovos na incubadora para desenvolver e transferir moscas adultas para um novo frasco para coletar mais ovos.
- Recolher as moscas machos ou fêmeas fechadas todos os dias e cultuá-las em novos frascos com alimentos padrão na condição de manutenção à idade desejada.
NOTA: Para obter mais moscas da mesma idade, vários frascos do genótipo desejado podem ser configurados simultaneamente. Os frascos para a cultura de moscas adultas devem ser trocados a cada 3-5 dias.
2. Contando contrações de cultura
- Anestesiar as moscas com CO2 e levar uma mosca em uma placa de dissecação bem contendo 200 μL de 1x salina tamponada fosfato (PBS, pH = 7,4) composto por 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4e 1,76 mM KH2PO4.
- Segure a mosca em seu tórax usando um par de pinças, abra suavemente o tórax usando outro par de pinças, e então puxe a extremidade em direções opostas para abrir o abdômen. Retire a colheita e o intestino do corpo com cuidado.
- Espere a mosca acordar e depois visualizar a cultura e contar o número de vezes que ela contrai em 1 min.
NOTA: Apenas uma onda completa nos lóbulos da cultura é contada como uma contração. - Repita a etapa 2.3 para 5x entre intervalos de 30 s.
- Calcule o número médio de contrações de cultura por minuto.
NOTA: Durante a contagem de contração, a mosca deve estar viva, e o intestino deve estar intacto e preso em suas extremidades anterior e posterior após a dissecação.
3. Preparar alimentos tingidos
- Pesar e dissolver o corante azul(Tabela de Materiais) na PBS a uma concentração de 20% (c/v).
- Adicione o corante azul de 20% no alimento de manutenção líquida cozida (etapa 1.1) com uma diluição de 1:40 para uma concentração final de 0,5% (w/v) durante o processo de resfriamento dos alimentos.
NOTA: O corante azul é adicionado antes do resfriamento dos alimentos e misturado bem com a agitação. É opcional dissolver o corante azul em PBS; água destilada também é adequada.
4. Alimentar moscas com comida tingida
- Transfira grupos de moscas da mesma idade para os frascos com alimentos de fome (1% de ágar em água destilada) por 4h para garantir a ingestão de alimentos.
- Transfira as moscas para novos frascos com comida tingida de azul e cultura as moscas para o tempo desejado.
NOTA: O tempo de alimentação é um fator crítico e depende do propósito da pesquisa. A alimentação curta, no momento da passagem dos alimentos, pode ser usada para avaliar a velocidade da motilidade alimentar da cultura ao intestino. Nas condições de manutenção, o alimento passa em cerca de 2h. No entanto, o tempo de passagem pode estar relacionado às condições culturais. Alimentação longa, até alguns dias, pode ser usada para avaliar o status de distribuição persistente de alimentos entre a cultura e o intestino.
5. Dissecando moscas e coletando amostras de corante em cultura e intestino
- Anestesiar as moscas com CO2 e levar uma mosca em uma placa de dissecação bem contendo 200 μL de 1x PBS.
- Segure a mosca em seu tórax usando um par de pinças e tire a cabeça do corpo usando outro par de pinças. Mova o corpo restante para um novo poço contendo 200 μL de 1x PBS.
- Lave o corpo 2x sacudindo-o suavemente em 200 μL de 1x PBS usando um par de pinças para limpar o corante ligado ao corpo da mosca.
- Abra suavemente e suavemente o abdômen usando dois pares de pinças e separe cuidadosamente todo o intestino do corpo.
- Retire cuidadosamente a cultura de todo o intestino e coloque-a em um tubo com 100 μL de 1x PBS.
- Por fim, coloque todo o intestino sem cultura (doravante referido como intestino) em outro tubo com 100 μL de 1x PBS.
- Triture a cultura e o intestino, respectivamente, em tubos usando pontas de pipeta para fazer o corante dissolver-se na PBS.
- Repita as etapas 5.1-5.7 até que sejam coletadas culturas e tripas suficientes para o experimento projetado.
NOTA: A cultura e o intestino devem ser totalmente homogeneizados, e todo o corante deve ser dissolvido no tampão. Para fins de pesquisa, uma ou várias culturas ou tripas podem ser coletadas em um tubo.
6. Calcular quantidades de corante na cultura e intestino
- Centrifugar os tubos de amostra na velocidade mais alta por 1 min e transferir 90 μL de supernasal para os poços de uma placa de 96 poços.
- Faça uma série de diluições de corante azul em concentrações de 1 x 10-7 g/mL a 1 x 10-4 g/mL como padrões.
- Adicione uma série de padrões de 90 μL aos poços da placa de 96 poços.
- Meça a absorção das amostras e padrões a 630 nm com um espectrômetro de placa.
- Para criar uma curva padrão, plote um gráfico de linha de absorvência versus concentração para cada um dos padrões. Em seguida, desenhe uma linha de melhor ajuste através dos pontos para obter a equação usada para calcular a concentração de corante nas amostras.
- Calcule a quantidade de corante multiplicando a concentração amostral por 0,1 mL.
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Representative Results
Esses métodos para contar a taxa de contração da cultura e detectar a distribuição de alimentos tingidos podem ser usados para avaliar a função da cultura na motilidade alimentar. A contração da cultura reflete a frequência de empurrar alimentos para o intestino. A distribuição de corante na mosca após um curto período de alimentação indica passagem imediata de alimentos da cultura para o midgut.
Alvo do complexo de rapamicina 1 (TORC1) é um regulador mestre que media o metabolismo de nutrientes e células. A inibição do TORC1 prolonga a vida útil em muitos organismos, incluindo a Drosophila. Como inibidor do TORC1, a mosca mutante nprl2 exibe hiperativação de defeitos de digestão TORC1 e GI8,,9. O tamanho da cultura em um mutante nprl2 é normal aos 3 dias de idade e ampliado aos 15 dias de idade, em comparação com seu controle genético de antecedentes (yw)8. Para avaliar o ensaio de motilidade da cultura, foram utilizadas moscas mutantes nprl2 de 3 dias de idade e controles de yw. Cada safra foi contabilizada cinco vezes e o valor médio foi utilizado (Tabela Suplementar 1). Os números da contração da cultura durante as cinco repetições foram semelhantes, o que sugere que a PBS pode não afetar a fisiologia da cultura em alimentação curta e é adequada para a contagem de contração da cultura. A mutação nprl2 diminuiu significativamente a taxa de contração da cultura(Figura 1).
Semelhante ao estômago mamífero, a cultura de Drosophila continua contraindo para mover o alimento para o intestino. Para confirmar ainda mais a função do Nprl2 na cultura, foi detectado movimento alimentar. As moscas foram alimentadas com alimentos tingidos por 30 minutos e dissecadas imediatamente para detectar a quantidade de corante na cultura e no intestino usando espectrofotometria. Como mostrado na Figura 2A, as quantidades de corante azul nas culturas de controle e mutantes nprl2 foram semelhantes, consistentes com o anteriormente relatado tamanho da culturacomparável 8. Os mutantes nprl2 tinham menos corante no intestino, o que pode estar associado à diminuição da taxa de contração(Figura 2B).
Figura 1: Diferença de contração da cultura entre control e machos mutantes nprl2. As moscas machos de 3 dias foram dissecadas, e a taxa de contração da cultura foi contada. A frequência de contração da cultura de cada mosca é exibida como um ponto de dados. As barras de erro representam SD do ponto de dados indicado. , P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferença de distribuição de alimentos entre o controle e os machos mutantes nprl2 após um curto período de tempo de alimentação. As moscas machos de 3 dias foram alimentadas com alimentos contendo 0,5% de corante azul por 30 minutos e depois dissecadas imediatamente para detectar a quantidade de corante. AAQuantidade de corante na cultura. (B) A quantidade de corante no intestino sem cultura. **, P < 0,01; NS, não é significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela Suplementar 1: Os dados originais de contração da cultura usados na Figura 1. Por favor clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Em Drosophila ingerido alimentos se move da cultura para o intestino para digestão. Durante esse processo, os nutrientes são absorvidos, e os resíduos são expelidos para fora do corpo como fezes. Assim, comparar a ingestão de alimentos com a ejeção das fezes pode ser usado para avaliar aproximadamente a velocidade do movimento alimentar no corpo. O método de alimentador capilar (CAFE) é amplamente utilizado para medir a ingestão de alimentos10,11. O método de contagem de números de fezes pode ser usado para estimar a quantidade de fezes de criação12. No entanto, o movimento alimentar no corpo de Drosophila está sob o controle de muitos fatores, incluindo a motilidade da cultura. A função de cultura não pode ser facilmente avaliada usando métodos de contagem de CAFÉ e fezes. Este protocolo pode avaliar quantitativamente a motilidade da cultura e a passagem de alimentos da cultura para o intestino em Drosophila.
A motilidade da cultura é essencial para a passagem de alimentos e a sobrevivência da Drosophila. Algumas mutações genéticas ou infecções por vírus que afetam a função da cultura resultam na diminuição da vida útil7,,13,14. Este protocolo pode ser usado para tela e avaliação dos mutantes e drogas que afetam a motilidade da cultura. A contagem de contração da cultura é usada para detectar a frequência de motilidade da cultura e a espectrofotometria que mede a distribuição de alimentos na cultura e no intestino é usada para prever a eficiência da motilidade da cultura. Estes dois métodos são fáceis de executar e altamente sensíveis. Além disso, o método espectrofotometria pode ser modificado para detectar o uso de alimentos em Drosophila. Por exemplo, a ingestão de alimentos em um curto espaço de tempo pode ser avaliada detectando a quantidade de corante em todo o intestino. O status contínuo de distribuição de alimentos entre a cultura e o intestino pode ser avaliado detectando as quantidades de corante nas moscas alimentadas com alimentos corantes por alguns dias.
Há algumas considerações técnicas neste protocolo. Para o método de contagem de contração da cultura, é essencial dissecar e retirar a cultura cuidadosamente no tampão PBS. A solução salina não é o ambiente fisiológico da cultura. A cultura deve permanecer conectada ao corpo, e a mosca deve estar viva e acordada; caso contrário, a cultura perde a capacidade de contrair. Sugere-se contar contração de cultura em moscas intactas, bem como13. Para o método espectrofotometria, a separação das culturas do GI dissecado e sua transferência para um prato de 96 poços após a alimentação de corante alimentar deve ser feita com cuidado e rapidez. O corante é usado para indicar a quantidade de alimento na cultura e no intestino. Durante o processo de dissecção, a cultura e o intestino devem estar em contato. Se o corante vazar para a mídia de dissecção, a amostra não poderá ser usada. Com a prática, um técnico qualificado pode terminar a dissecação e a separação da cultura dentro dos 30 anos.
Anteriormente, esses métodos eram utilizados para avaliar a motilidade da cultura em moscas mutantes nprl2 de 15 dias de idade que haviam ampliado as culturas8. Neste caso, a contração da cultura e a distribuição de alimentos em mutantes nprl2 de 3 dias de idade com tamanho normal da cultura foram quantificadas. Consistente com a diminuição da taxa de contração da cultura, os mutantes nprl2 exibiram menos corante alimentar no intestino. Esses resultados sugerem que os mutantes nprl2 têm alguns defeitos na motilidade da cultura mesmo em uma idade jovem. O fundo yw foi usado como um controle do tipo selvagem porque é o fundo genético do mutante nprl2. Para outros experimentos, cepas como Canton S e w118,, podem ser usadas como controles. Outros grupos utilizam uma solução de dissecação diferente (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35,5 mM de sacarose, pH = 7,1) para detectar contração da cultura13,14,,15. A taxa de contração da cultura encontrada nas moscas de controle neste estudo é inferior à relatada por Solari et al.15, mas maior que Chtarbanova et al.14 e Peller et al.13. Essa diferença pode ser causada pelos diferentes antecedentes genéticos ou mídia de dissecção.
Ao todo, a espectrofotometria de corante azul juntamente com a contração da cultura pode ser usada eficientemente para avaliar a motilidade da cultura. O protocolo aqui apresentado ajuda a tornar o Drosophila um bom modelo para o estudo de fisiologia do trato GI.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (nº 31872287), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (NO). BK20181456) e Seis talentos picos projeto na província de Jiangsu (No. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
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