Summary
Целью этого протокола является измерение сокращения сельскохозяйственных культур и количественная оценка распределения продовольствия в кишечнике дрозофилы.
Abstract
Большинство животных используют желудочно-кишечного тракта (ГИ) для переваривания пищи. Движение проглатываемой пищи в желудочно-кишечном тракте имеет важное значение для усвоения питательных веществ. Неупорядоченое подвижность Г.И. и опорожнение желудка вызывают многочисленные заболевания и симптомы. Как мощная генетическая модель организма, Drosophila может быть использован в исследованиях подвижности GI. Урожай drosophila является органом, который сокращается и перемещает пищу в мидгут для дальнейшего пищеварения, функционально похож на желудок млекопитающих. Представлен протокол для изучения моторики культур Drosophila с помощью простых инструментов измерения. Описан метод подсчета сжатия урожая для оценки подвижности сельскохозяйственных культур и метод обнаружения распределения пищевого окрашенного синего цвета между культурой и кишечником с помощью спектрофотометра для исследования влияния урожая на прохождение пищевых продуктов. Метод был использован для обнаружения разницы в подвижности урожая между контролем и nprl2 мутант мух. Этот протокол является экономически эффективным и очень чувствительным к подвижности сельскохозяйственных культур.
Introduction
Большинство животных имеют пищеварительную трубку, называемую желудочно-кишечного тракта (GI) для поглощения энергии и питательных веществ из окружающей среды. Человеческий желудочно-кишечного тракта состоит из четырех частей: пищевод, желудок, тонкий кишечник, и толстой кишки (толстой кишки). Пищевой проход из желудка в кишечник необходим для усвоения питательных веществ. Некоторые эффекторы, такие как старение, токсичные препараты, и инфекции, вызывают неупорядочение желудочного тракта подвижность и опорожнения желудка, что связано с некоторыми заболеваниями и их симптомы, такие как диспепсия, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, и запор1.
Плодовая муха(Drosophila melanogaster) является широко используемой моделью животных в биомедицинских исследований из-за его легкой генетической манипуляции. Важно отметить, что около 77% генов, связанных с болезнью человека, имеют омолог в Drosophila2. Исследования с использованием Drosophila сделал огромные успехи в нашем понимании многих механизмов болезни. Как мощная генетическая модель организма, Drosophila широко используется в исследованиях желудочно-кишечного тракта3. Drosophila имеет более простой пищеварительный тракт, который делится на три дискретных доменов: форегут, мидгут, и задний4. Урожай, часть foregut, мешок-как структура которая служит как место для ingested хранения еды. Мидгут представляет собой длинную трубку и функционирует как место для пищеварения и усвоения питательных веществ через эпителиальный слой, который состоит из абсорбтивных энтероцитов (ЭК) и секреторных энтероэндокринных (EE) клеток5. Интересно, что функция желудка в Drosophila делится на две части: урожай функции хранения продуктов питания и области медных клеток (CCR) является высококислой области с рН йтт; 36. В Drosophila, попадает пищи первоначально переехал в урожай, а затем закачивается в midgut7. Таким образом, урожай играет важнейшую роль в прохождении продуктов питания. Окутанный висцеральными мышцами и состоящий из сложного массива клапанов и сфинктеров, урожай продолжает сокращаться и переносить пищу в мидгут для дальнейшего пищеварения.
Этот протокол позволяет обнаруживать движение пищи от урожая до середины в Дрозофиле. Сжатие урожая оценивается путем подсчета частоты сокращения урожая. Кроме того, влияние урожая на пищевые пропуска исследуется путем выявления распределения пищи между культурой и кишечником. Кроме того, распределение продовольствия может быть использовано для отражения немедленного перемещения пищи или основного продовольственного статуса с использованием различных периодов кормления. В совокупности этот протокол предоставляет методы для быстрой оценки подвижности сельскохозяйственных культур и пропуска продуктов питания в Дрозофиле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поддержание и подготовка экспериментальных мух
- Поддерживайте мухи в флаконах, содержащих 10 мл свежеприготовленной пищи (1% агар, 2,4% пивных дрожжей, 3% сахарозы, 5% кукурузной муки) в инкубаторе при температуре 25 градусов по Цельсию при 60% влажности. Установите световой цикл инкубатора до 12-h света: 12-h темно.
- Для того, чтобы большое количество желаемого генотипа мухи ecloses одновременно, культура молодых мух (1-3 дней) в стандартной пище с сухими дрожжами на поверхности в течение 3 дней. Перенесите взрослых на новый пищевой флакон со стандартной пищей, включая влажные дрожжи, в течение 2 дней, чтобы позволить откладывание яиц. Оставьте яйца в инкубаторе для разработки и передачи взрослых мух на новый флакон, чтобы собрать больше яиц.
- Собирайте закрытых самцов или женщин-мух каждый день и культура их в новых флаконах со стандартной пищей при условии обслуживания до желаемого возраста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить больше летает одного возраста, несколько флаконов желаемого генотипа могут быть настроены одновременно. Флаконы для взрослых летать культуры должны быть изменены каждые 3-5 дней.
2. Подсчет сокращений урожая
- Анестезия мух с CO2 и принять одну муху в вскрытии пластины хорошо, содержащий 200 мл 1x фосфат буферного солевого раствора (PBS, рН No 7,4) состоит из 136,89 мМ NaCl, 2,67 м KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, и 1,76 м КХ2PO4.
- Возьмитесь за грудную клетку с помощью одной пары пинцета, плавно откройте грудную клетку с помощью другой пары пинцета, а затем потяните конец в противоположных направлениях, чтобы открыть живот. Возьмите урожай и кишечник из тела тщательно.
- Подождите, пока муха проснется, а затем визуализировать урожай и подсчитать количество раз, когда она контракты в 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только полная волна на долях урожая засчитана как одно сужение. - Повторите шаг 2.3 для 5x между интервалами 30 s.
- Рассчитайте среднее количество сокращений урожая в минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время подсчета сокращения, муха должна быть жива, и кишечник должен быть нетронутым и прилагается на его передней и задней концах после вскрытия.
3. Приготовление окрашенной пищи
- Взвешивать и растворять синий краситель(Таблица материалов)в PBS с концентрацией 20% (w/v).
- Добавьте 20% синий краситель в вареную пищу для поддержания жидкости (шаг 1.1) с разбавлением 1:40 до конечной концентрации 0,5% (w/v) в процессе охлаждения пищи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синий краситель добавляется перед охлаждением пищи и хорошо перемешивают с перемешиванием. Это необязательно, чтобы растворить синий краситель в PBS; также подходит дистиллированная вода.
4. Кормление мух с окрашенной пищей
- Передача группы одного возраста летит на флаконы с голодной пищей (1% агар в дистиллированной воде) на 4 ч для обеспечения приема пищи.
- Перенесите мух на новые флаконы с едой, окрашенной в синий цвет, и культура мух в нужное время.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время кормления является критическим фактором и зависит от цели исследования. Короткое кормление, в течение времени пищи, проходящей через, может быть использован для оценки скорости подвижности пищи от урожая к кишечнику. В условиях технического обслуживания, пища проходит через около 2 ч. Однако время прохождения может быть связано с культурными условиями. Длительное кормление, до нескольких дней, может быть использовано для оценки постоянного состояния распределения пищи между культурой и кишечником.
5. Рассекирование мух и сбор образцов красителей в сельскохозяйственных культурах и кишечнике
- Обезболить мух со CO2 и взять одну муху в рассекая пластины хорошо содержащие 200 мл 1x PBS.
- Возьмите муху на его грудной клетки с помощью одной пары пинцета и снять голову с тела с помощью другой пары пинцета. Переместите оставшееся тело в новый колодец, содержащий 200 МЛ 1x PBS.
- Вымойте тело 2x, аккуратно встряхивая его в 200 мл 1x PBS с помощью пары пинцетов для очистки красителя, прикрепленного к телу мухи.
- Аккуратно и плавно откройте живот двумя парами пинцета и аккуратно отделите весь кишечник от тела.
- Аккуратно снять урожай со всего кишечника и положить его в трубку с 100 мл 1x PBS.
- Наконец, положить весь кишечник без урожая (далее называют кишки) в другую трубку с 100 мл 1x PBS.
- Измельчить урожай и кишечник, соответственно, в трубках с помощью пипетки советы, чтобы краситель растворяются в PBS.
- Повторите шаги 5.1'5.7 до тех пор, пока достаточно культур и кишки собраны для эксперимента разработан.
ПРИМЕЧАНИЕ: Урожай и кишечник должны быть полностью гомогенизированы, и все красители должны быть растворены в буфере. Для исследовательских целей, один или несколько культур или кишки могут быть собраны в одной трубке.
6. Расчет количества красителей в сельскохозяйственных культурах и кишечнике
- Центрифуга пробных труб на самой высокой скорости в течение 1 мин и передача 90 мл супернатанта в скважины 96 скважин пластины.
- Сделать серию голубых красителей разбавления в концентрациях от 1 х 10-7 г/мл до 1 х 10-4 г/мл в качестве стандартов.
- Добавьте серию стандартов 90 МЛ в скважины 96-й скважины.
- Измерьте абсорбции образцов и стандартов на 630 нм с помощью спектрофотометра пластины.
- Чтобы создать стандартную кривую, настипите линейный график абсорбции против концентрации для каждого из стандартов. Затем нарисуйте линию лучше всего подходят через точки, чтобы получить уравнение, используемое для расчета концентрации красителя в образцах.
- Рассчитайте количество красителя путем умножения концентрации образца на 0,1 мл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эти методы для подсчета скорости сокращения урожая и выявления окрашенных продуктов питания могут быть использованы для оценки функции сельскохозяйственных культур на подвижность пищевых продуктов. Сокращение урожая отражает частоту толкания пищи в кишечник. Распределение красителя в мухе после короткого периода кормления указывает на немедленное прохождение пищи от урожая к середине.
Цель рапамицина комплекса 1 (TORC1) является мастер регулятор, который опосредует питательные вещества и клеточный метаболизм. Ингибирование TORC1 продлевает продолжительность жизни во многих организмах, включая дрозофилу. Как ингибитор TORC1, nprl2 мутант летать отображает гиперактивации TORC1 и Г.И. пищеварения дефектов8,9. Размер урожая в nprl2 мутант является нормальным на 3 дней и увеличена на 15 дней, по сравнению с его генетическим фоновым контролем(yw)8. Для оценки анализа подвижности урожая использовались 3-дневные мухи-мутанты nprl2 и элементы управления yw. Каждая культура была подсчитана пять раз, и среднее значение было использовано(Дополнительная таблица 1). Число сжатия урожая в течение пяти повторов были одинаковыми, что свидетельствует о том, что PBS может не влиять на физиологию урожая в коротких кормлениях и подходит для подсчета сокращения урожая. Мутация nprl2 значительно снизила скорость сокращения урожая(рисунок 1).
Подобно желудку млекопитающих, урожай Drosophila продолжает сокращаться, чтобы переместить пищу в кишечник. Для дальнейшего подтверждения функции Nprl2 на урожай было обнаружено движение продуктов питания. Мух кормили окрашенными продуктами в течение 30 минут и сразу же вскрывали, чтобы определить количество красителя в урожае и кишечнике с помощью спектрофотометрии. Как показано на рисунке 2A, синий краситель количества в сельскохозяйственных культур контроля и nprl2 мутантов были похожи, в соответствии с ранее сообщалось сопоставимый размер урожая8. У мутантов nprl2 было меньше красителя в кишечнике, что может быть связано со снижением скорости сокращения(рисунок 2B).
Рисунок 1: Разница в сокращении урожая между контролем и самцами-мутантами nprl2. 3-дневные самцы мух были вскрыты, и коэффициент сокращения урожая был подсчитан. Частота сокращения урожая каждой мухи отображается в качестве точки данных. Бары ошибок представляют SD из указанной точки данных. , З lt; 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Разница в распределении продуктов питания между контролем и самцами-мутантами nprl2 после короткого времени кормления. 3-дневный самец мух кормили с пищей, содержащей 0,5% синий краситель в течение 30 минут, а затем немедленно вскрыли, чтобы обнаружить количество красителя. (A) Количество красителя в урожае. (B)Количество красителя в кишечнике без урожая. В, й lt; 0.01; NS, не значительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная таблица 1: Оригинальные данные о сокращении урожая, используемые на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В Drosophila попадает пища перемещается из урожая в кишечник для пищеварения. Во время этого процесса, питательные вещества поглощаются, и отходы выгоняются из организма, как фекалии. Таким образом, сравнение приема пищи вместе с выбросом кала может быть использовано для приблизительного оценки скорости движения пищи в организме. Метод капиллярной кормушки (CAFE) широко используется для измерения приема пищи10,,11. Метод подсчета кала число может быть использован для оценки количества кала создания12. Тем не менее, движение пищи в организме Drosophila находится под контролем многих факторов, в том числе подвижность урожая. Функция сельскохозяйственных культур не может быть легко оценена с помощью методов подсчета CAFE и кала. Этот протокол может количественно оценить подвижность сельскохозяйственных культур и пищевые продукты, переходят от урожая к кишечнику в Drosophila.
Подвижность урожая имеет важное значение для пропуска пищи и выживания дрозофилы. Некоторые генные мутации или вирусные инфекции, влияющие на функцию сельскохозяйственных культур, приводят к снижению продолжительности жизни7,,13,,14. Этот протокол может быть использован для проверки и оценки мутантов и препаратов, которые влияют на подвижность урожая. Подсчет сокращения урожая используется для определения частоты подвижности сельскохозяйственных культур, а спектрофотометрия, измеряющая распределение продовольствия в сельскохозяйственных культурах и кишечнике, используется для прогнозирования эффективности подвижности сельскохозяйственных культур. Эти два метода просты в выполнении и очень чувствительны. Кроме того, метод спектрофотометрии может быть изменен для обнаружения использования пищи в Drosophila. Например, прием пищи в течение короткого времени может быть оценен путем обнаружения количества красителя во всем кишечнике. Непрерывное распределение пищи статус между культурой и кишечником можно оценить путем обнаружения количества красителей в мух подается с красителем пищи в течение нескольких дней.
В этом протоколе есть несколько технических соображений. Для метода подсчета сокращения урожая необходимо тщательно вскрыть и вынести урожай в буфер PBS. Солевой раствор не является физиологической средой урожая. Урожай должен оставаться связанным с телом, и муха должна быть жива и бодрствовала; в противном случае урожай теряет способность сокращаться. Предлагается подсчитать сокращение урожая у нетронутых мух, а также13. Для метода спектрофотометрии, отделение культур от расчлененных Г.И. и их передачи в 96 хорошо пластины после кормления пищевой краситель должно быть сделано тщательно и быстро. Краситель используется для обозначения количества пищи в урожай и кишечник. Во время процесса вскрытия, урожай и кишечник должны быть в контакте. Если краситель просачивается в средства вскрытия, образец не может быть использован. С практикой, квалифицированный техник может закончить вскрытие и разделение урожая в течение 30 с.
Ранее эти методы использовались для оценки подвижности урожая у 15-дневных мух-мутантов nprl2, которые увеличили посевына 8. В этом случае были количественно определены сокращение урожая и распределение продовольствия в 3-дневном мутанте nprl2 с нормальным размером урожая. В соответствии со снижением скорости сокращения урожая, nprl2 мутантов отображается меньше пищевой краситель в кишечнике. Эти результаты показывают, что мутанты nprl2 имеют некоторые дефекты в подвижности сельскохозяйственных культур даже в молодом возрасте. Фон yw был использован как дишенный контроль типа потому что он генетический предпосылка мутанта nprl2. Для других экспериментов, штаммы, как Кантон S и w118, могут быть использованы в качестве элементов управления. Другие группы используют другой раствор вскрытия (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35.5 mM сахароза, рН No 7.1) для обнаружения сокращения урожая13,,14,15. Скорость сокращения урожая, найденная в контрольных мух в этом исследовании ниже, чем сообщили Solari и др.15, но выше, чем Chtarbanova и др.14 и Пеллер и др.13. Эта разница может быть вызвана различными генетическими фонами или средствами вскрытия.
В целом, спектротометрия синего красителя вместе с сокращением урожая может быть эффективно использована для оценки подвижности сельскохозяйственных культур. Протокол, представленный здесь, помогает сделать Drosophila хорошей моделью для исследования физиологии желудочно-кишечного тракта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 31872287), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (NO). BK20181456) и проект "Шесть пиков талантов" в провинции Цзянсу (Нет. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
