Summary
El objetivo de este protocolo es medir la contracción de los cultivos y cuantificar la distribución de alimentos en el intestino de Drosophila.
Abstract
La mayoría de los animales utilizan el tracto gastrointestinal (GI) para digerir los alimentos. El movimiento de los alimentos ingeridos en el tracto gastrointestinal es esencial para la absorción de nutrientes. La motilidad GI desordenada y el vaciado gástrico causan múltiples enfermedades y síntomas. Como un potente organismo modelo genético, Drosophila se puede utilizar en la investigación de la motilidad GI. El cultivo Drosophila es un órgano que se contrae y mueve los alimentos a la zona media para una mayor digestión, funcionalmente similar a un estómago de mamífero. Presentado es un protocolo para estudiar la motilidad de cultivo de Drosophila utilizando herramientas de medición simples. Se describe un método para contar las contracciones de los cultivos para evaluar la motilidad de los cultivos y un método para detectar la distribución de los alimentos teñidos de azul entre el cultivo y el intestino utilizando un espectrofotómetro para investigar el efecto del cultivo en la transmisión de alimentos. El método se utilizó para detectar la diferencia en la motilidad de los cultivos entre el control y las moscas mutantes nprl2. Este protocolo es rentable y altamente sensible a la motilidad de los cultivos.
Introduction
La mayoría de los animales tienen un tubo digestivo llamado tracto gastrointestinal (GI) para absorber energía y nutrientes del medio ambiente. El tracto gastrointestinal humano se compone de cuatro partes: el esófago, el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso (colon). El paso de los alimentos desde el estómago hasta el intestino es esencial para la absorción de nutrientes. Algunos efectores, como el envejecimiento, los medicamentos tóxicos y la infección, causan motilidad del tracto gastrointestinal desordenado y vaciado gástrico, que está relacionado con algunas enfermedades y sus síntomas como dispepsia, enfermedad por reflujo gastroesofágico y estreñimiento1.
La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es un animal modelo ampliamente utilizado en la investigación biomédica debido a su fácil manipulación genética. Es importante destacar que alrededor del 77% de los genes asociados con enfermedades humanas tienen un homólogo en Drosophila2. La investigación con Drosophila ha hecho enormes avances en nuestra comprensión de muchos mecanismos de la enfermedad. Como un potente organismo modelo genético, Drosophila es ampliamente utilizado en la investigación del tracto gastrointestinal3. Drosophila tiene un tracto digestivo más simple, que se divide en tres dominios discretos: foregut, midgut, y hindgut4. El cultivo, una parte del foregut, es una estructura similar a una bolsa que sirve como un sitio para el almacenamiento de alimentos ingeridos. El punto medio es un tubo largo y funciona como el sitio para la digestión de alimentos y la absorción de nutrientes a través de la capa epitelial, que consiste en enterocitos absorbentes (CE) y células secretoras enteroendocrinas (EE)5. Curiosamente, la función estomacal en Drosophila se divide en dos partes: el cultivo funciona como almacenamiento de alimentos y la región de células de cobre (CCR) es una región altamente ácida con un pH < 36. En Drosophila,los alimentos ingeridos se trasladan inicialmente al cultivo y posteriormente se bombean a mediados del7. Por lo tanto, el cultivo desempeña un papel crítico en el passaging de alimentos. Envuelto por músculos viscerales y que consiste en una compleja gama de válvulas y esfínteres, el cultivo sigue contrayéndose y moviendo los alimentos a la parte media para una mayor digestión.
Este protocolo permite la detección del movimiento de los alimentos desde el cultivo hasta el punto medio en Drosophila. La contracción de los cultivos se evalúa contando la frecuencia de contracción de los cultivos. Además, el efecto del cultivo en la venta de alimentos se investiga mediante la detección de la distribución de alimentos entre el cultivo y el intestino. Además, la distribución de alimentos se puede utilizar para reflejar el movimiento inmediato de los alimentos o el estado básico de los alimentos utilizando diferentes períodos de alimentación. En conjunto, este protocolo proporciona métodos para evaluar rápidamente la motilidad de los cultivos y la pasión de alimentos en Drosophila.
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Protocol
1. Mantenimiento y preparación de moscas experimentales
- Mantener las moscas en viales que contengan 10 ml de alimentos recién hechos (1% de agar, 2,4% de levadura de cerveza, 3% sacarosa, 5% harina de maíz) en una incubadora a 25 oC con 60% de humedad. Ajuste el ciclo de luz de la incubadora a 12 h de luz: 12-h de oscuridad.
- Para asegurar que un gran número del genotipo deseado vuela eclosión simultáneamente, cultiva moscas jóvenes (1-3 días de edad) en alimentos estándar con levadura seca en la superficie durante 3 días. Transfiera a los adultos a un nuevo vial de alimentos con alimentos estándar, incluida la levadura húmeda, durante 2 días para permitir la puesta de huevos. Deje que los huevos en la incubadora se desarrollen y transfieran moscas adultas a un nuevo vial para recoger más huevos.
- Recoger las moscas macho o hembra ecerradas cada día y cultivarlas en viales nuevos con alimentos estándar en la condición de mantenimiento a la edad deseada.
NOTA: Para obtener más moscas de la misma edad, se pueden configurar simultáneamente varios viales del genotipo deseado. Los viales para el cultivo de moscas adultas deben cambiarse cada 3 o 5 días.
2. Contar las contracciones de los cultivos
- Anestesiar las moscas conCO2 y tomar una mosca en un pozo de placa de disección que contiene 200 l de 1x solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7,4) compuesto por 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4y 1,76 mM KH2PO4.
- Sujeta la mosca en su tórax usando un par de pinzas, abre suavemente el tórax usando otro par de pinzas, y luego tira del extremo en direcciones opuestas para abrir el abdomen. Saca el cultivo y el intestino del cuerpo con cuidado.
- Espere a que la mosca se despierte y luego visualice el recorte y cuente el número de veces que se contrae en 1 min.
NOTA: Sólo una onda completa en los lóbulos de cultivo se cuenta como una contracción. - Repita el paso 2.3 para 5x entre intervalos de 30 s.
- Calcular el número medio de contracciones de cultivo por minuto.
NOTA: Durante el conteo de contracciones, la mosca debe estar viva, y el intestino debe estar intacto y unido en sus extremos anterior y posterior después de la disección.
3. Preparación de alimentos teñidos
- Pesar y disolver el tinte azul (Tabla de Materiales) en PBS a una concentración del 20% (p/v).
- Agregue el tinte azul del 20% en el alimento de mantenimiento de líquido hervido (paso 1.1) con una dilución 1:40 a una concentración final de 0.5% (p/v) durante el proceso de enfriamiento de los alimentos.
NOTA: El tinte azul se añade antes de que el alimento se enfríe y se mezcle bien con la agitación. Es opcional disolver el tinte azul en PBS; agua destilada también es adecuada.
4. Alimentar moscas con alimentos teñidos
- Transfiera grupos de moscas de la misma edad a los viales con alimentos de hambre (1% de agar en agua destilada) durante 4 horas para garantizar la ingesta de alimentos.
- Transfiera las moscas a nuevos viales con alimentos teñidos de azul y las moscas cultivan durante el tiempo deseado.
NOTA: El tiempo de alimentación es un factor crítico y depende del propósito de la investigación. La alimentación corta, dentro del tiempo de paso de los alimentos, se puede utilizar para evaluar la velocidad de la motilidad de los alimentos desde el cultivo hasta el intestino. En las condiciones de mantenimiento, el alimento pasa a través de aproximadamente 2 h. Sin embargo, el tiempo de paso podría estar relacionado con las condiciones de cultivo. La alimentación prolongada, hasta unos pocos días, se puede utilizar para evaluar el estado persistente de distribución de alimentos entre el cultivo y el intestino.
5. Diseccionar moscas y recoger muestras de tinte en cultivos y intestinos
- Anestesar las moscas conCO2 y tomar una mosca en un pozo de placa de disección que contiene 200 l de 1x PBS.
- Sujeta la mosca en su tórax usando un par de pinzas y quita la cabeza del cuerpo usando otro par de pinzas. Mueva el cuerpo restante a un nuevo pozo que contenga 200 l de 1x PBS.
- Lave el cuerpo 2x sacudiéndolo suavemente en 200 ml de 1x PBS usando un par de pinzas para limpiar el tinte unido al cuerpo de la mosca.
- Abra suavemente y suavemente el abdomen usando dos pares de pinzas y separe cuidadosamente todo el intestino del cuerpo.
- Saque con cuidado el cultivo de todo el intestino y colótelo en un tubo con 100 l de 1x PBS.
- Por último, coloque todo el intestino sin cultivo (en lo sucesivo denominado intestino) en otro tubo con 100 l de 1x PBS.
- Moler el cultivo y el intestino respectivamente en tubos utilizando puntas de pipeta para hacer que el tinte se disuelva en el PBS.
- Repita los pasos 5.1 a 5.7 hasta que se recojan suficientes cultivos y tripas para el experimento diseñado.
NOTA: El cultivo y el intestino deben ser totalmente homogeneizados, y todo el tinte debe disolverse en el tampón. Para fines de investigación, uno o varios cultivos o intestinos se pueden recoger en un tubo.
6. Cálculo de las cantidades de tinte en cultivos y intestinos
- Centrifugar los tubos de muestra a la velocidad más alta durante 1 min y transferir 90 l de sobrenadante a los pocillos de una placa de 96 pozos.
- Hacer una serie de diluciones de tinte azul a concentraciones de 1 x 10-7 g/mL a 1 x 10-4 g/mL como estándares.
- Añada una serie de estándares de 90 l a los pocillos de la placa de 96 pozos.
- Mida la absorbancia de las muestras y las normas a 630 nm con un espectrofotómetro de placas.
- Para crear una curva estándar, trace un gráfico de líneas de absorbancia frente a concentración para cada una de las normas. A continuación, dibuje una línea de mejor ajuste a través de los puntos para obtener la ecuación utilizada para calcular la concentración de tinte en las muestras.
- Calcular la cantidad de tinte multiplicando la concentración de la muestra por 0,1 ml.
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Representative Results
Estos métodos para contar la tasa de contracción de los cultivos y detectar la distribución de alimentos teñidos se pueden utilizar para evaluar la función de los cultivos en la motilidad alimentaria. La contracción del cultivo refleja la frecuencia de empujar los alimentos al intestino. La distribución del tinte en la mosca después de un corto período de alimentación indica el paso inmediato de los alimentos desde el cultivo hasta el punto medio de la custo.
El objetivo del complejo de rapamicina 1 (TORC1) es un regulador maestro que media el metabolismo de nutrientes y células. La inhibición de TORC1 prolonga la vida útil en muchos organismos, incluyendo Drosophila. Como inhibidor de TORC1, la mosca mutante nprl2 muestra hiperactivación de toRC1 y defectos de digestión GI8,,9. El tamaño del cultivo en un mutante nprl2 es normal a los 3 días de edad y agrandado a los 15 días de edad, en comparación con su control genético de fondo (yw)8. Para evaluar el ensayo de motilidad de cultivos, se utilizaron moscas mutantes nprl2 de 3 días de edad y controles de yw. Cada cultivo se contó cinco veces y se utilizó el valor medio(Tabla complementaria 1). El número de la contracción del cultivo durante las cinco repeticiones fue similar, lo que sugiere que PBS podría no afectar la fisiología de los cultivos en alimentos cortos y es adecuado para el recuento de contracciones de cultivos. La mutación nprl2 disminuyó significativamente la tasa de contracción de los cultivos(Figura 1).
Al igual que el estómago de los mamíferos, el cultivo de Drosophila sigue contando para mover los alimentos al intestino. Para confirmar aún más la función de Nprl2 en el cultivo, se detectó el movimiento de los alimentos. Las moscas fueron alimentadas con alimentos teñidos durante 30 minutos y diseccionadas inmediatamente para detectar la cantidad de tinte en el cultivo y el intestino usando espectrofotometría. Como se muestra en la Figura 2A, las cantidades de tinte azul en los cultivos de control y mutantes nprl2 fueron similares, de conformidad con el tamaño de cultivo comparable previamente reportado8. Los mutantes nprl2 tenían menos tinte en el intestino, que puede estar asociado con la disminución de la tasa de contracción (Figura 2B).
Figura 1: Diferencia de contracción de cultivo entre los machos mutantes de control y nprl2. Las moscas macho de 3 días de edad fueron diseccionadas, y la tasa de contracción de los cultivos fue contada. La frecuencia de contracción del recorte de cada mosca se muestra como un punto de datos. Las barras de error representan SD desde el punto de datos indicado. , P < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferencia de distribución de alimentos entre el control y los machos mutantes nprl2 después de un corto tiempo de alimentación. Las moscas macho de 3 días de edad fueron alimentadas con alimentos que contenían un 0,5% de tinte azul durante 30 minutos y luego diseccionadas inmediatamente para detectar la cantidad de tinte. (A) La cantidad de tinte en el cultivo. (B) La cantidad de tinte en el intestino sin cultivo. **, P < 0.01; NS, no es significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla suplementaria 1: Los datos originales de la contracción de cultivos utilizados en la Figura 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En Drosophila los alimentos ingeridos se mueven del cultivo al intestino para la digestión. Durante este proceso, los nutrientes se absorben, y los desechos se expulsan fuera del cuerpo como heces. Por lo tanto, la comparación de la ingestión de alimentos junto con la eyección de las heces se puede utilizar para evaluar aproximadamente la velocidad del movimiento de los alimentos en el cuerpo. El método de alimentador capilar (CAFE) se utiliza ampliamente para medir la ingestión de alimentos10,11. El método de recuento de números de heces se puede utilizar para estimar la cantidad de creación de heces12. Sin embargo, el movimiento de alimentos en el cuerpo de Drosophila está bajo el control de muchos factores, incluyendo la motilidad de los cultivos. La función de recorte no se puede evaluar fácilmente utilizando métodos de recuento de CAFE y heces. Este protocolo puede evaluar cuantitativamente la motilidad de los cultivos y la transferencia de alimentos desde el cultivo hasta el intestino en Drosophila.
La motilidad de los cultivos es esencial para el paso de alimentos y la supervivencia de Drosophila. Algunas mutaciones genéticas o infecciones por virus que afectan la función de los cultivos dan lugar a una disminución de la vida útil7,,13,14. Este protocolo se puede utilizar para examinar y evaluar los mutantes y fármacos que afectan la motilidad de los cultivos. El recuento de contracción de cultivos se utiliza para detectar la frecuencia de la motilidad de los cultivos y la espectrofotometría que mide la distribución de alimentos en cultivos e intestinos se utiliza para predecir la eficiencia de la motilidad de los cultivos. Estos dos métodos son fáciles de realizar y altamente sensibles. Además, el método de espectrofotometría se puede modificar para detectar el uso de alimentos en Drosophila. Por ejemplo, la ingestión de alimentos en poco tiempo se puede evaluar detectando la cantidad de tinte en todo el intestino. El estado de distribución continua de alimentos entre el cultivo y el intestino se puede evaluar mediante la detección de las cantidades de tinte en las moscas alimentadas con alimentos de tinte durante unos días.
Hay algunas consideraciones técnicas en este protocolo. Para el método de recuento de contracciones de cultivos, es esencial diseccionar y sacar el cultivo cuidadosamente en el tampón PBS. La solución salina no es el entorno fisiológico del cultivo. El cultivo debe permanecer conectado al cuerpo, y la mosca debe estar viva y despierta; de lo contrario, el cultivo pierde la capacidad de contraer. Se sugiere contar la contracción de los cultivos en moscas intactas, así13. Para el método de espectrofotometría, la separación de los cultivos de la IG diseccionada y su transferencia en un plato de 96 pozos después de la alimentación de tintes alimentarios debe hacerse con cuidado y rapidez. El tinte se utiliza para indicar la cantidad de alimentos en el cultivo y el intestino. Durante el proceso de disección, el cultivo y el intestino deben estar en contacto. Si el tinte se filtra en el medio de disección, la muestra no se puede utilizar. Con la práctica, un técnico experto puede terminar la disección y la separación de cultivos dentro de 30 s.
Anteriormente, estos métodos se utilizaban para evaluar la motilidad de los cultivos en moscas mutantes nprl2 de 15 días de edad que tenían cultivos agrandados8. En este caso, se cuantificó la contracción de los cultivos y la distribución de alimentos en mutantes nprl2 de 3 días de edad con el tamaño normal de los cultivos. De acuerdo con la disminución de la tasa de contracción de los cultivos, los mutantes nprl2 mostraron menos tinte alimentario en el intestino. Estos resultados sugieren que los mutantes nprl2 tienen algunos defectos en la motilidad de los cultivos incluso a una edad temprana. El fondo yw fue utilizado como un control de tipo salvaje porque es el fondo genético del mutante nprl2. Para otros experimentos, cepas como Canton S y w118, podrían utilizarse como controles. Otros grupos utilizan una solución disección diferente (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35,5 mM sucrose, pH a 7,1) para detectar la contracción de los cultivos13,14,15. La tasa de contracción de los cultivos que se encuentra en las moscas de control en este estudio es inferior a la reportada por Solari et al.15, pero superior a Chtarbanova et al.14 y Peller et al.13. Esta diferencia puede ser causada por los diferentes orígenes genéticos o medios de disección.
En general, la espectrofotometría de tinte azul junto con la contracción del cultivo se pueden utilizar eficientemente para evaluar la motilidad del cultivo. El protocolo presentado aquí ayuda a hacer de Drosophila un buen modelo para el estudio de fisiología del tracto gastrointestinal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No 31872287), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (NO. BK20181456) y el proyecto Seis picos de talento en la provincia de Jiangsu (No. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
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