Summary
Målet med detta protokoll är att mäta gröda kontraktion och kvantifiera livsmedelsdistribution i Drosophila tarmen.
Abstract
De flesta djur använder mag -tarmkanalen (GI) för att smälta mat. Förflyttning av inmat i mag-tarmkanalen är viktigt för näringsupptagning. Störd GI motilitet och magtömning orsaka flera sjukdomar och symtom. Som en kraftfull genetisk modell organism, Drosophila kan användas i GI motility forskning. Drosophila grödan är ett organ som kontrakt och flyttar mat i midgut för ytterligare matsmältning, funktionellt liknar en däggdjur mage. Presenteras är ett protokoll för att studera Drosophila gröda motilitet med hjälp av enkla mätverktyg. En metod för att räkna sammandragningar av grödor för att utvärdera växtmotilitet och en metod för att upptäcka fördelningen av livsmedel som färgats blått mellan grödan och tarmen med hjälp av en spektrofotometer för att undersöka grödans inverkan på matpassering beskrivs. Metoden användes för att upptäcka skillnaden i gröda motilitet mellan kontroll och nprl2 mutant flugor. Detta protokoll är både kostnadseffektivt och mycket känsligt för gröda motilitet.
Introduction
De flesta djur har ett matsmältningsrör som kallas mag-tarmkanalen (GI) för att absorbera energi och näringsämnen från miljön. Den mänskliga mag-tarmkanalen består av fyra delar: matstrupen, magen, tunntarmen, och tjocktarmen (kolon). Mat passage från magen till tarmen är viktigt för näringsämne absorption. Vissa effektorer, såsom åldrande, giftiga läkemedel, och infektion, orsaka störd mag-tarmkanalen motilitet och magtömning, som är relaterade till vissa sjukdomar och deras symtom såsom dyspepsi, gastroesofageal refluxsjukdom, och förstoppning1.
Fruktflugan (Drosophila melanogaster) är en allmänt använd modell djur i biomedicinsk forskning på grund av dess enkla genetiska manipulation. Viktigt, cirka 77% av gener som är associerade med mänskliga sjukdomar har en homolog i Drosophila2. Forskning med Drosophila har gjort enorma framsteg i vår förståelse av många sjukdomsmekanismer. Som en kraftfull genetisk modell organism, Drosophila används ofta i mag-tarmkanalen forskning3. Drosophila har en enklare mag-tarmkanalen, som är uppdelad i tre diskreta domäner: förbent, midgut, och hindgut4. Grödan, en del av utseguten, är en påse-liknande struktur som fungerar som en plats för intas mat lagring. Midgut är ett långt rör och fungerar som platsen för matsmältningsnedsmältning och näringsupptagning genom epitelskiktet, som består av absorptiva enterocyter (ECs) och sekretoriska enteroendokrina (EE) celler5. Intressant nog är magfunktionen i Drosophila uppdelad i två delar: grödan fungerar som förvaring av livsmedel och kopparcellregionen (CCR) är en mycket sur region med ett pH < 36. I Drosophilaflyttas den intagda maten ursprungligen till grödan och pumpas därefter in i mellangut7. Således spelar grödan en avgörande roll i mat passaging. Omsluten av viscerala muskler och består av ett komplext utbud av ventiler och sfinkter, håller grödan upphandlande och flytta mat i midgut för ytterligare matsmältning.
Detta protokoll möjliggör detektion av mat rörelse från grödan till midgut i Drosophila. Grödakontraktion utvärderas genom att räkna gröda kontraktion frekvens. Dessutom undersöks grödans inverkan på livsmedelspassering genom att upptäcka livsmedelsfördelningen mellan gröda och tarm. Dessutom kan livsmedelsdistributionen användas för att återspegla omedelbar matrörelse eller grundläggande livsmedelsstatus med hjälp av olika utfodringsperioder. Sammantaget ger detta protokoll metoder för att snabbt utvärdera gröda motilitet och mat passaging i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Upprätthålla och förbereda experimentella flugor
- Håll flugor i flaskor som innehåller 10 ml nygjord mat (1% agar, 2,4% bryggerijäst, 3% sackaros, 5% majsmjöl) i en inkubator vid 25 °C med 60% luftfuktighet. Ställ in inkubatorns ljuscykel på 12-h ljus:12-h mörkt.
- För att säkerställa att ett stort antal av den önskade genotypen flyger ecloses samtidigt, odla unga flugor (1−3 dagar gamla) i vanlig mat med torrjäst på ytan i 3 dagar. Överför de vuxna till en ny matflaska med standardmat inklusive våt jäst, i 2 dagar för att tillåta äggläggning. Lämna äggen i inkubatorn för att utveckla och överföra vuxna flugor till en ny injektionsflaska för att samla in fler ägg.
- Samla de slutna manliga eller kvinnliga flugorna varje dag och odla dem i nya flaskor med standardmat vid underhållstillståndet till önskad ålder.
OBS: För att få fler fler samma ålder flugor, flera flaskor av önskad genotyp kan ställas in samtidigt. Injektionsflaskan för vuxen flugkultur bör ändras var 3−5 dag.
2. Räkna sammandragningar av grödor
- Söva flugorna med CO2 och ta en fluga i en dissekeringsplatta väl innehållande 200 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH = 7,4) bestående av 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4och 1,76 mM KH2PO4.
- Ta tag i flugan vid bröstkorgen med ett par pincett, öppna bröstkorgen smidigt med ett annat par pincett och dra sedan änden i motsatta riktningar för att öppna buken. Ta grödan och tarmen ut från kroppen noggrant.
- Vänta tills flugan vaknar och visualisera sedan grödan och räkna antalet gånger den kontrakt i 1 min.
OBS: Endast en fullständig våg på grödan lober räknas som en sammandragning. - Upprepa steg 2.3 för 5x mellan 30 s intervall.
- Beräkna det genomsnittliga antalet grödakontraktioner per minut.
OBS: Under kontraktionen räkna, flugan bör vara vid liv, och tarmen bör vara intakt och fäst vid dess främre och bakre ändar efter dissekering.
3. Förbereda färgmat
- Väg och lös upp det blå färgämnet (Tabell över material) i PBS vid en koncentration av 20% (w/v).
- Tillsätt 20 % blått färgämne i det kokta flytande underhållsfoder (steg 1.1) med en spädning på 1:40 till en slutlig koncentration på 0,5 % (w/v) under livsmedelskylningsprocessen.
OBS: Det blå färgämnet tillsätts innan maten svalnar och blandas väl med omrörning. Det är frivilligt att lösa upp det blå färgämnet i PBS; destillerat vatten är också lämpligt.
4. Utfodring flugor med färgat livsmedel
- Överför grupper av samma åldern flyger till injektionsflaskan med svältmat (1% agar i destillerat vatten) i 4 timmar för att säkerställa födointag.
- Överför flugorna till nya flaskor med mat färgat blått och odla flugorna för önskad tid.
OBS: Matningstiden är en kritisk faktor och beror på forskningssyftet. Kort utfodring, inom tiden för mat som passerar, kan användas för att utvärdera hastigheten på matmotilitet från gröda till tarm. Vid underhållsförhållandena passerar maten genom ca 2 h. Tiden för att passera kan dock vara relaterad till kulturförhållanden. Lång utfodring, upp till några dagar, kan användas för att utvärdera långlivade mat distribution status mellan gröda och tarm.
5. Dissekera flugor och samla in färgprover i gröda och tarm
- Söva flugorna med CO2 och ta en fluga i en dissekeringsplatta väl innehållande 200 μL 1x PBS.
- Ta tag i flugan vid bröstkorgen med ett par pincett och ta huvudet av kroppen med hjälp av ett annat par pincett. Flytta den återstående kroppen till en ny brunn som innehåller 200 μL 1x PBS.
- Tvätta kroppen 2x genom att försiktigt skaka den i 200 μL av 1x PBS med hjälp av ett par pincett för att rengöra färgen fäst vid flugkroppen.
- Försiktigt och smidigt öppna buken med hjälp av två par pincett och försiktigt separera hela tarmen från kroppen.
- Ta försiktigt av grödan från hela tarmen och lägg den i ett rör med 100 μL 1x PBS.
- Slutligen, lägg hela tarmen utan gröda (nedan kallad tarm) i ett annat rör med 100 μL av 1x PBS.
- Slipa grödan respektive tarmen i rör med hjälp av pipettspetsar för att göra färgen upplösas i PBS.
- Upprepa steg 5.1−5.7 tills tillräckligt med grödor och tarmar samlas in för det experiment som utformats.
OBS: Grödan och tarmen ska vara helt homogeniserade och allt färgämne ska lösas upp i bufferten. För forskningsändamål kan en eller flera grödor eller tarmar samlas i ett rör.
6. Beräkning av färgmängder i gröda och tarm
- Centrifugera provrören med den högsta hastigheten i 1 min och överför 90 μl supernatant till brunnarna på en 96-brunnsplatta.
- Gör en serie blå färgspädningar vid koncentrationer från 1 x 10-7 g/ml till 1 x 10-4 g/ml som standard.
- Tillsätt en serie 90 μL-standarder till brunnarna på 96-brunnsplattan.
- Mät provernas och standardernas absorbans vid 630 nm med en plattspektrofotometer.
- Om du vill skapa en standardkurva ritar du ett linjediagram över absorbans kontra koncentration för var och en av standarderna. Dra sedan en linje av bäst passform genom de punkter för att få ekvationen används för att beräkna färgämnet koncentrationen i proverna.
- Beräkna mängden färgämne genom att multiplicera provkoncentrationen med 0,1 ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa metoder för att räkna gröda kontraktion och upptäcka färgade livsmedel distribution kan användas för att utvärdera gröda funktion på livsmedelsmotilitet. Grödan kontraktion återspeglar frekvensen av att driva mat i tarmen. Fördelningen av färgämne i flugan efter en kort utfodringsperiod indikerar omedelbar matpassering från gröda till midgut.
Mål för rapamycin komplex 1 (TORC1) är en mästare regulator som förmedlar närings-och cellmetabolism. TORC1 hämning förlänger livslängden i många organismer, inklusive Drosophila. Som hämmare av TORC1 visar nprl2-mutantflugan hyperaktivering av TORC1- och GI-rötningsdefekter8,9. Grödans storlek i en nprl2 mutant är normal vid 3 dagar gammal och förstoras vid 15 dagar gammal, jämfört med dess genetiska bakgrundskontroll(yw)8. För att utvärdera grödan motilitet analys, 3-dagars gamla nprl2 mutant flugor och yw kontroller användes. Varje gröda räknades fem gånger och medelvärdet användes (tilläggstabell 1). Antalet gröda kontraktion under de fem repetitionerna var liknande, vilket tyder på att PBS inte kan påverka grödan fysiologi i korta utfodringar och är lämplig för gröda kontraktion räkna. Nprl2-mutationen minskade signifikant graden av vegetabiliekontraktion ( figur1).
I likhet med däggdjur magen, håller Drosophila gröda upphandlande att flytta maten i tarmen. För att ytterligare bekräfta funktionen av Nprl2 på grödan upptäcktes matrörelse. Flugorna matades med färgad mat i 30 min och dissekerades omedelbart för att upptäcka mängden färgämne i grödan och tarmen med hjälp av spektrofotometri. Som visas i figur 2Avar de blå färgämnena i grödorna för kontroll och nprl2 mutanter likartade, i överensstämmelse med den tidigare rapporterade jämförbara grödan storlek8. Nprl2 mutanter hade mindre färgämne i tarmen, som kan associeras med den minskade kontraktionen (Figur 2B).
Figur 1: Skillnaden mellan gröda och nprl2-mutanter. Den 3-dagars-gamla manliga flugor dissekerades, och grödan kontraktion var räknat. Frekvensen för grödakontraktion för varje flyg visas som en datapunkt. Felstaplar representerar SD från den angivna datapunkten. , P < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Skillnad mellan livsmedelsfördelning mellan kontroll och nprl2-mutanta hanar efter en kort matningstid. De 3-dagars-gamla manliga flugorna matades med mat som innehåller 0,5% blått färgämne i 30 min och dissekeras sedan omedelbart för att upptäcka färgämnet. (A)Färgämnet i grödan. (B)Färgämnet i tarmen utan gröda. **, P & 0,01; NS, inte betydande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggstabell 1: De ursprungliga uppgifterna om vegetabiliekontraktion som används i figur 1. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I Drosophila intas mat flyttar från grödan till tarmen för matsmältningen. Under denna process absorberas näringsämnena, och avfallet utvisas ur kroppen som avföring. Således, jämföra mat intag tillsammans med avföring utkast kan användas för att grovt bedöma hastigheten på matrörelser i kroppen. Metoden för kapillärmatare (CAFE) används ofta för att mäta intag av livsmedel10,11. Metoden för avföring antal inventering kan användas för att uppskatta mängden avföring skapande12. Emellertid, matrörelsen i Drosophila kroppen är under kontroll av många faktorer, inklusive gröda motilitet. Crop funktion kan inte enkelt utvärderas med CAFE och avföring räkna metoder. Detta protokoll kan kvantitativt utvärdera gröda motilitet och mat passaging från gröda till tarm i Drosophila.
Gröda motilitet är viktigt för mat passaging och Drosophila överlevnad. Vissa genmutationer eller virusinfektioner som påverkar växtfunktionen resulterar i minskad livslängd7,,13,14. Detta protokoll kan användas för att kontrollera och utvärdera mutanter och läkemedel som påverkar grödan motilitet. Grödan kontraktion räkna används för att upptäcka gröda motilitet frekvens och spektrofotometri mäta livsmedelsdistribution i gröda och tarm används för att förutsäga gröda motilitet effektivitet. Dessa två metoder är lätta att utföra och mycket känsliga. Dessutom kan spektrofotometri metoden ändras för att upptäcka livsmedelsanvändning i Drosophila. Till exempel, mat intag inom en kort tid kan utvärderas genom att upptäcka färgämnet i hela tarmen. Den kontinuerliga livsmedelsfördelningsstatus mellan gröda och tarm kan bedömas genom att upptäcka färgämnen i flugorna matas med färgämne mat för några dagar.
Det finns några tekniska överväganden i detta protokoll. För metoden för beräkning av grödans kontraktion är det viktigt att dissekera och ta ut grödan noggrant i PBS-bufferten. Saltlösning är inte grödans fysiologiska miljö. Grödan måste förbli ansluten till kroppen, och flugan måste vara levande och vaken; Annars förlorar grödan möjligheten att ingå avtal. Det föreslås att räkna gröda kontraktion i intakt flugor samt13. För spektrofotometri metoden, separation av grödor från dissekeras GI och deras överföring till en 96 väl tallrik efter mat färgämne utfodring bör göras noggrant och snabbt. Färgen används för att ange mängden mat i grödan och tarmen. Under dissekeringsprocessen bör grödan och tarmen vara i kontakt. Om färgämnet läcker in i dissekeringsmediet kan provet inte användas. Med övning kan en skicklig tekniker avsluta dissekering och skördeseparation inom 30 s.
Tidigare användes dessa metoder för att utvärdera grödan motilitet i 15-dagars gamla nprl2 mutant flugor som hade förstorade grödor8. I detta fall kvantifierades grödan kontraktion och mat distribution i 3-dagars gamla nprl2 mutanter med normal gröda storlek. I linje med den minskade grödan kontraktion takt, nprl2 mutanter visas mindre mat färgämne i tarmen. Dessa resultat tyder på att nprl2 mutanter har vissa defekter i gröda motilitet även vid en ung ålder. YW bakgrunden användes som en vild typ kontroll eftersom det är den genetiska bakgrunden till nprl2 mutant. För andra experimentkan stammar som Canton S och w118användas som kontroller. Andra grupper använder en annan dissekeringslösning (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 m CaCl2,8 mM MgCl2, 35,5 mM sackaros, pH = 7,1) för att upptäcka växtkontraktion13,,14,15. Den minskningshastighet som finns i kontrollflugorna i denna studie är lägre än den som rapporterats av Solari et al.15, men högre än Chtarbanova et al.14 och Peller et al.13. Denna skillnad kan orsakas av olika genetiska bakgrunder eller dissekering media.
I alla, blå färgämne spektrofotometri tillsammans med gröda kontraktion kan effektivt användas för att utvärdera gröda motilitet. Protokollet presenteras här bidrar till att göra Drosophila en bra modell för mag tract fysiologi studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (NO. BK20181456) och Sex talanger toppar projektet i Jiangsu-provinsen (Nr. SWYY-146).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Thermo fisher | 269620 | |
| Brillant Blue FCF | Solarbio | E8500 | also called FD&C Blue No. 1 |
| Centrifuge | Thermo fisher | Heraeus Pico 17 | |
| Spectrophotometer | Spectra Max | cMax plus | |
| Tweezers | Dumont | 11252-30 |
References
- Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
- Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
- Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
- Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
- Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
- Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
- Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).
