Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Drosophila'da Bitki Hareketliliği ve Gıda Geçişinin Ölçülmesi

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61181
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, the Ministry of Education of China, Yangzhou University, 2College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokolün amacı mahsul daralma ölçmek ve Drosophila bağırsak gıda dağılımı ölçmektir.

Abstract

Çoğu hayvan gıda sindirmek için gastrointestinal (GI) yolu kullanın. GI sisteminde yutulan gıda hareketi besin emilimi için gereklidir. Düzensiz GI motilitesi ve mide boşalması birçok hastalığa ve semptomlara neden olur. Güçlü bir genetik model organizma olarak, Drosophila GI motilite araştırmalarında kullanılabilir. Drosophila ürün sözleşmeler ve daha fazla sindirim için midgut içine gıda taşır bir organdır, fonksiyonel bir memeli mide benzer. Sunulan basit ölçüm araçları kullanarak Drosophila kırpma hareketliliği çalışma için bir protokoldür. Mahsul daralmalarını sayma yöntemi, mahsul hareketliliğini değerlendirmek için bir yöntem ve mahsulün gıda geçişi üzerindeki etkisini araştırmak için bir spektrofotometre kullanarak mahsul ve bağırsak arasındaki gıda nın dağılımını tespit etme yöntemi tanımlanmıştır. Yöntem kontrol ve nprl2 mutant sinekler arasındaki ürün hareketliliği farkı tespit etmek için kullanılmıştır. Bu protokol hem uygun maliyetli hem de mahsul hareketliliğine karşı son derece hassastır.

Introduction

Çoğu hayvan, çevreden enerji ve besin leri absorbe etmek için gastrointestinal (GI) yolu adı verilen bir sindirim tüpüne sahiptir. İnsan GI yolu dört bölümden oluşur: yemek borusu, mide, ince bağırsak, ve kalın bağırsak (kolon). Mideden bağırsaklara gıda geçişi besin emilimi için gereklidir. Yaşlanma gibi bazı efektörler, toksik ilaçlar, ve enfeksiyon, bazı hastalıklar ve dispepsi, gastroözofageal reflü hastalığı gibi belirtileri ile ilgili düzensiz GI yol motilitesi ve mide boşalma neden, ve kabızlık1.

Meyve sineği(Drosophila melanogaster)biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir model hayvandır. Daha da önemlisi, insan hastalığı ile ilişkili genlerin yaklaşık% 77 Drosophila2bir homolog var. Drosophila kullanarak araştırma birçok hastalık mekanizmaları anlayışımızda büyük ilerlemeler yaptı. Güçlü bir genetik model organizma olarak, Drosophila yaygın GI yolu araştırmakullanılır 3. Drosophila üç ayrı etki alanları ayrılır basit bir sindirim sistemi vardır: foregut, midgut, ve hindgut4. Mahsul, foregut bir parçası, yutulur gıda depolama için bir site olarak hizmet veren bir çanta gibi bir yapıdır. Midgut uzun bir tüp ve eforlu tabaka ile gıda sindirim ve besin emilimi için site olarak işlevleri, hangi absorptive enterositler oluşur (ECs) ve salgı enteroendokrin (EE) hücreleri5. İlginçtir, Drosophila mide fonksiyonu iki bölüme ayrılır: gıda depolama ve bakır hücre bölgesi (CCR) olarak ürün fonksiyonları bir pH ile son derece asidik bir bölgedir < 36. Drosophilayılında , yutulan gıda başlangıçta ürün taşınır ve daha sonra midgut içine pompalanır7. Böylece, ürün gıda passaging kritik bir rol oynar. Visseral kaslar tarafından zarflı ve vanalar ve sfinkterler karmaşık bir dizi oluşan, ürün sözleşme tutar ve daha fazla sindirim için midgut içine gıda taşıma.

Bu protokol Drosophilamidgut için ürün gıda hareketinin tespiti için izin verir. Mahsul daralması, mahsul daralma sıklığı sayılarak değerlendirilir. Buna ek olarak, gıda passaging üzerinde ürün etkisi bitki ve bağırsak arasındaki gıda dağılımı tespit edilerek araştırılır. Ayrıca, gıda dağılımı farklı beslenme dönemleri kullanılarak acil gıda hareketi veya temel gıda durumunu yansıtmak için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, bu protokol hızla Drosophilaürün hareketliliği ve gıda passaging değerlendirmek için yöntemler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Deneysel sineklerin bakımı ve hazırlanması

  1. 10 mL taze gıda (%1 agar, %2,4 bira mayası, %3 sakaroz, %5 mısır unu) içeren şişelerde sinekleri %60 nem oranına sahip 25 °C'de bir kuvözde muhafaza edin. Kuvözdeki ışık döngüsünü 12 saat aydınlığa ayarlayın:12-h karanlık.
  2. İstenilen genotip çok sayıda aynı anda ecloses sağlamak için, kültür genç sinekler (1−3 gün eski) 3 gün boyunca yüzeyinde kuru maya ile standart gıda sinekler . Yumurta yumurtlamak için 2 gün boyunca, ıslak maya da dahil olmak üzere standart gıda ile yeni bir gıda şişeiçin yetişkin aktarın. Geliştirmek ve daha fazla yumurta toplamak için yeni bir şişe yetişkin sinekler aktarmak için kuvözde yumurta bırakın.
  3. Eclosed erkek veya kadın sinekler her gün toplamak ve istenilen yaşa bakım koşullarında standart gıda ile yeni şişeler onları kültür.
    NOT: Daha fazla aynı yaş sinekleri elde etmek için, aynı anda istenilen genotip birden fazla şişe kurulabilir. Yetişkin sinek kültürü için şişeler her 3−5 günde bir değiştirilmelidir.

2. Mahsul kasılmaları sayma

  1. CO2 ile sinekler anestezik ve 136,89 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4ve 1,76 mM KH2PO4oluşan 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH = 7,4) 200 μL içeren bir diseksiyon plakası içine bir sinek almak .
  2. Cımbız bir çift kullanarak toraks da sinek kavramak, sorunsuz cımbız başka bir çift kullanarak toraks açın, ve sonra karın açmak için ters yönde ucunu çekin. Ekinve bağırsakları dikkatlice vücuttan alın.
  3. Sineğin uyanmasını bekleyin ve sonra mahsulü görselleştirin ve 1 dk içinde kaç kez büzüldürün sayısını sayın.
    NOT: Sadece ekin loblarında tam bir dalga bir kasılma olarak sayılır.
  4. 30 s aralıkları arasında 5x için adım 2.3 tekrarlayın.
  5. Dakikada ortalama kırpma kasılmaları sayısını hesaplayın.
    NOT: Kontraksiyon sayımı sırasında sinek canlı olmalı ve bağırsak sağlam olmalı ve diseksiyon dan sonra ön ve posterior uçlarında eklenmelidir.

3. Boyalı gıda hazırlanması

  1. PBS'deki mavi boyayı(Malzeme Tablosu)%20 (w/v) konsantrasyonunda tartın ve çözündürün.
  2. Gıda soğutma işlemi sırasında %0,5 (w/v) son konsantrasyonuna 1:40 seyreltme ile haşlanmış sıvı bakım gıdasına (adım 1.1) %20 mavi boya ekleyin.
    NOT: Mavi boya, gıda soğumadan önce eklenir ve karıştırılarak iyice karıştırılır. PBS'deki mavi boyayı eritmek isteğe bağlıdır; distile su da uygundur.

4. Boyalı gıda ile sinek besleme

  1. Aynı yaştaki sineklerin gruplar açlık gıda ile şişelere transfer (distile suda% 1 agar) için 4 saat gıda alımını sağlamak için.
  2. Sinekleri maviye boyanmış yiyecek ve kültür ile yeni şişelere aktarın.
    NOT: Beslenme süresi kritik bir faktördür ve araştırma amacına bağlıdır. Kısa beslenme, gıda geçerken zaman içinde, ürün bağırsak gıda hareketliliği hızını değerlendirmek için kullanılabilir. Bakım koşullarında, gıda yaklaşık 2 saat içinde geçer. Ancak, geçiş zamanı kültür koşulları ile ilgili olabilir. Uzun beslenme, birkaç güne kadar, ürün ve bağırsak arasındaki kalıcı gıda dağıtım durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.

5. Sineklerin kesilmesi ve mahsul ve bağırsaklarda boya örneklerinin toplanması

  1. CO2 ile sinekleri anestezik ve 1x PBS 200 μL içeren bir kesme plakası içine bir sinek almak.
  2. Bir çift cımbız kullanarak torakstaki sineği kavrayın ve başka bir cımbız kullanarak kafasını vücuttan alın. Kalan gövdeyi 200 μL 1x PBS içeren yeni bir kuyuya taşıyın.
  3. Sinek gövdesine bağlı boyayı temizlemek için bir çift cımbız kullanarak 1x PBS'nin 200 μL'sinde hafifçe sallayarak vücudu 2kat yıkayın.
  4. Yavaşça ve sorunsuz cımbız iki çift kullanarak karın açın ve dikkatle vücuttan tüm bağırsak ayırın.
  5. Dikkatle tüm bağırsak mahsul çıkarmak ve 1x PBS 100 μL ile bir tüp içine koyun.
  6. Son olarak, 1x PBS 100 μL ile başka bir tüp içinde kırpma olmadan tüm bağırsak (bundan sonra gut olarak anılacaktır) koyun.
  7. Boyapbs çözünür yapmak için pipet ipuçları kullanarak tüpler sırasıyla kırpma ve bağırsak grind.
  8. Tasarlanan deney için yeterli mahsul ve bağırsak toplanana kadar adımları 5.1−5.7'yi tekrarlayın.
    NOT: Mahsul ve bağırsak tamamen homojenleştirilmeli ve tüm boya tamponda çözülmelidir. Araştırma amaçlı olarak, bir veya birden fazla bitkileri veya bağırsakları tek bir tüp içinde toplanabilir.

6. Mahsul ve bağırsakboya miktarlarının hesaplanması

  1. Numune tüplerini 1 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüj edin ve 90°L supernatant'ı 96 kuyu plakasının kuyularına aktarın.
  2. Standart olarak 1 x 10-7 g/mL'den 1 x 10-4 g/mL'ye kadar olan konsantrasyonlarda bir dizi mavi boya seyreltme yapın.
  3. 96 kuyu plakasının kuyularına bir dizi 90 μL standart ekleyin.
  4. Numunelerin ve standartların emiciliğini bir plaka spektrofotometresi ile 630 nm olarak ölçün.
  5. Standart bir eğri oluşturmak için, standartların her biri için emicive konsantrasyonun bir çizgi grafiği çizin. Sonra örneklerdeki boya konsantrasyonu hesaplamak için kullanılan denklemi almak için noktalar üzerinden en uygun bir çizgi çizin.
  6. Numune konsantrasyonunu 0,1 mL ile çarparak boya miktarını hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mahsul daralma oranını saymak ve boyalı gıda dağılımını saptamak için kullanılan bu yöntemler, gıda hareketliliği üzerindeki mahsul işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Mahsul daralması, yiyecekleri bağırsaklara itme sıklığını yansıtır. Kısa bir beslenme döneminden sonra sinekteki boyanın dağılımı, mahsulden midguta hemen gıda geçişine işaret ediyor.

Rapamisin kompleksi 1 (TORC1) hedef besin ve hücre metabolizması aracılık bir ana regülatör. TORC1 inhibisyonu Drosophilada dahil olmak üzere birçok organizmada ömrünü uzatır. TORC1 bir inhibitörü olarak, nprl2 mutant sinek TORC1 ve GI sindirim kusurları hiperaktivasyon görüntüler8,9. Bir nprl2 mutant ürün boyutu normaldir 3 gün eski ve 15 günlük ken, genetik arka plan kontrolü ile karşılaştırıldığında büyütülmüş (yw)8. Mahsul hareketliliğini değerlendirmek için 3 günlük nprl2 mutant sinekler ve yw kontrolleri kullanıldı. Her kırpma beş kez sayıldı ve ortalama değer kullanıldı(Ek Tablo 1). Beş tekrar sırasında mahsul daralması sayıları benzerdi, bu da PBS'nin kısa beslemelerde mahsul fizyolojisini etkilemeyebileceğini ve mahsul daralması sayımı için uygun olduğunu düşündürmektedir. Nprl2 mutasyonu mahsul daralma oranını önemli ölçüde azalttı(Şekil 1).

Memeli midesine benzer şekilde, Drosophila mahsulü de yiyecekleri bağırsaklara taşımak için kasışlılık yapmaya devam ediyor. Nprl2'nin mahsul üzerindeki işlevini daha da doğrulamak için gıda hareketi tespit edildi. Sinekler 30 dakika boyunca boyalı gıda ile beslendi ve spektrofotometri kullanarak ürün ve bağırsak boya miktarını tespit etmek için hemen kesildi. Şekil 2Agösterildiği gibi , kontrol ve nprl2 mutantların bitkileri mavi boya miktarları benzer, daha önce bildirilen karşılaştırılabilir ürün boyutu ile tutarlı8. Nprl2 mutantları azalmış kasılma oranı ile ilişkili olabilir bağırsak, daha az boya vardı (Şekil 2B).

Figure 1
Şekil 1: Kontrol ve nprl2 mutant erkekler arasındaki kırpma daralma farkı. 3 günlük erkek sinekler kesildi ve mahsul daralma oranı sayıldı. Her sineğin kırpma daralma sıklığı bir veri noktası olarak görüntülenir. Hata çubukları belirtilen veri noktasından SD'yi temsil eder. , P < 0,001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kısa bir beslenme süresinden sonra kontrol ve nprl2 mutant erkekler arasındaki gıda dağılımı farkı. 3 günlük erkek sinekler 30 dakika boyunca %0,5 mavi boya içeren yiyeceklerle beslendi ve boya miktarını tespit etmek için hemen parçalara ayırdı. (A) Mahsuldeki boya miktarı. (B) Ekin olmadan bağırsakboya miktarı. **, P < 0.01; NS, önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Şekil 1'de kullanılan kırpma daralması orijinal verileri Figure 1. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila sindirilir gıda sindirim için bağırsak için ürün hamle yutulur. Bu işlem sırasında, besin emilir, ve atık dışkı olarak vücuttan atılır. Böylece, dışkı ejeksiyon ile birlikte gıda yutma karşılaştırarak kabaca vücuttagıda hareketinin hızını değerlendirmek için kullanılabilir. Kılcal besleyici yöntemi (CAFE) yaygın gıda alımını ölçmek için kullanılır10,11. Dışkı sayı sayma yöntemi dışkı oluşturma miktarını tahmin etmek için kullanılabilir12. Ancak, Drosophila vücutta gıda hareketi birçok faktörün kontrolü altındadır, ürün hareketliliği de dahil olmak üzere. Kırpma fonksiyonu CAFE ve dışkı sayma yöntemleri kullanılarak kolayca değerlendirilemez. Bu protokol, Drosophila'damahsulden bağırsaklara geçen mahsul hareketliliğini ve gıdayı nicel olarak değerlendirebilir.

Kırpma hareketliliği gıda passaging ve Drosophila hayatta kalmak için gereklidir. Kırpma fonksiyonunu etkileyen bazı gen mutasyonları veya virüs enfeksiyonları yaşam süresinin azalmasına neden olur7,13,14. Bu protokol, ürün hareketliliğini etkileyen mutantları ve ilaçları taramak ve değerlendirmek için kullanılabilir. Mahsul daralma sayma ürün hareketliliği sıklığını tespit etmek için kullanılır ve ürün ve bağırsak gıda dağılımını ölçen spektrofotometri ürün hareketliliği verimliliğini tahmin etmek için kullanılır. Bu iki yöntemin gerçekleştirilen kolay ve son derece hassas. Ayrıca, spektrofotometri yöntemi Drosophilagıda kullanımını tespit etmek için değiştirilebilir. Örneğin, kısa bir süre içinde gıda alımı tüm bağırsak boya miktarı tespit edilerek değerlendirilebilir. Mahsul ve bağırsak arasındaki sürekli gıda dağılımı durumu birkaç gün için boya gıda ile beslenen sinekler boya miktarları tespit edilerek değerlendirilebilir.

Bu protokolde birkaç teknik husus vardır. Kırpma daralma sayma yöntemi için, pbs tampon unda kırpma dikkatle incelemek ve çıkarmak esastır. Tuzlu çözelti mahsulün fizyolojik ortamı değildir. Ekin vücuda bağlı kalmalı ve sinek canlı ve uyanık olmalıdır; aksi takdirde, ürün sözleşme yeteneğini kaybeder. Bu bozulmamış sinekler de13mahsul daralma saymak için önerilmektedir. Spektrofotometri yöntemi için, parçalara ayrılan GI'den mahsullerin ayrılması ve gıda boyası yemi yedikten sonra 96 kuyulu bir tabağa aktarılması dikkatli ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Boya ürün ve bağırsak gıda miktarını belirtmek için kullanılır. Diseksiyon işlemi sırasında, ürün ve bağırsak temas olmalıdır. Boya diseksiyon ortamına sızarsa, örnek kullanılamaz. Uygulama ile, yetenekli bir teknisyen 30 s içinde diseksiyon ve ürün ayırma bitirebilirsiniz.

Daha önce, bu yöntemler bitkileri8genişletilmiş vardı 15 günlük nprl2 mutant sinekler mahsul hareketliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu durumda, normal mahsul boyutuna sahip 3 günlük nprl2 mutantlarında mahsul daralması ve gıda dağılımı ölçüldü. Azalan mahsul daralma oranı ile tutarlı, nprl2 mutantlar bağırsakta daha az gıda boyası gösterdi. Bu sonuçlar nprl2 mutantlar genç yaşta bile kırpma hareketliliği bazı kusurları olduğunu göstermektedir. Nprl2 mutant genetik arka plan olduğu için yw arka plan vahşi bir tip kontrol olarak kullanılmıştır. Diğer deneyler için, Canton S ve w118gibi suşları, kontrol olarak kullanılabilir., Diğer gruplar farklı bir diseksiyon çözeltisi kullanırlar (123 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 35.5 mM sakaroz, pH = 7.1) mahsul daralması tespit etmek için13,14,15. Bu çalışmada kontrol sinekler bulunan mahsul daralma oranı Solari ve ark tarafından bildirilen dahadüşük15, ancak Chtarbanova ve ark14 ve Peller ve ark13daha yüksektir . Bu farklılık farklı genetik arka planlar veya diseksiyon ortamı neden olabilir.

Toplamda, kırpma daralması ile birlikte mavi boya spektrofotometri verimli kırpma hareketliliği değerlendirmek için kullanılabilir. Burada sunulan protokol Drosophila GI sistem fizyolojisi çalışması için iyi bir model yapmak için yardımcı olur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31872287), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (NO) tarafından desteklenmiştir. BK20181456) ve Jiangsu Eyaleti'nde Altı yetenek zirveleri projesi (No. SWYY-146).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Thermo fisher 269620
Brillant Blue FCF Solarbio E8500 also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge Thermo fisher Heraeus Pico 17
Spectrophotometer Spectra Max cMax plus
Tweezers Dumont 11252-30

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kusano, M., et al. Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases. Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).
  2. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  3. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology. Disease Models & Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).
  4. Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. The Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).
  5. Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
  6. Strand, M., Micchelli, C. A. Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).
  7. Ren, J., et al. Beadex affects gastric emptying in Drosophila. Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).
  8. Xi, J., et al. The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila. Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).
  9. Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster. G3. 6 (12), Bethesda. 3859-3867 (2016).
  10. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  11. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).
  12. Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).
  13. Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila. Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).
  14. Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).
  15. Solari, P., et al. Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry. PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).

Tags

Biyoloji Sayı 159 ürün gastrointestinal Drosophila,spektrofotometri kasılma bağırsak
<em>Drosophila'da</em> Bitki Hareketliliği ve Gıda Geçişinin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cai, J., Xi, J., Wei, Y. Measuring… More

Cai, J., Xi, J., Wei, Y. Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila. J. Vis. Exp. (159), e61181, doi:10.3791/61181 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter