Summary
Thermische grenzen kunnen voorspellen de omgevingen organismen tolereren, dat is waardevolle informatie in het gezicht van de snelle klimaatverandering. Hier beschreven zijn high-throughput protocollen om kritische thermische minima en warmte knockdown tijd bij insecten te beoordelen. Beide protocollen maximaliseren de doorvoer en minimaliseren de kosten van de tests.
Abstract
Hogere en lagere thermische grenzen van planten en dieren zijn belangrijke voorspellers van hun prestaties, overleving en geografische spreidingen, en zijn essentieel voor het voorspellen van reacties op klimaatverandering. Dit werk beschrijft twee high-throughput protocollen voor het meten van insecten thermische grenzen: een voor de beoordeling van kritische thermische minima (CTmin), en de andere voor de beoordeling van warmte knock down time (KDT) in reactie op een statische hittestressor. In de CTmin test, individuen worden geplaatst in een acryl-jas kolom, onderworpen aan een dalende temperatuur helling, en geteld als ze vallen uit hun zitstokken met behulp van een infrarood sensor. In de hitte KDT test, individuen zijn opgenomen in een 96 put plaat, geplaatst in een incubator ingesteld op een stressvolle, warme temperatuur, en video opgenomen om het tijdstip waarop ze niet meer rechtop kunnen blijven en bewegen te bepalen. Deze protocollen bieden voordelen ten opzichte van veelgebruikte technieken. Beide tests zijn lage kosten en kunnen relatief snel worden voltooid (~ 2 uur). De CTmin test vermindert experimenter fout en kan meten een groot aantal individuen tegelijk. De warmte KDT protocol genereert een video-record van elke test en dus verwijdert experimenter bias en de noodzaak om continu te controleren individuen in real time.
Introduction
Thermische grenzen van insecten
Variatie in omgevingsomstandigheden, met inbegrip van temperatuur, is een belangrijke factor die van invloed is op de prestaties, geschiktheid, overleving en geografische verspreiding van organismen1,2. Boven- en onderwarmtegrenzen bepalen het theoretische bereik van omgevingen die een organisme kan verdragen, en daarom zijn deze grenswaarden belangrijke voorspellers van planten- en dierdistributies, vooral in het licht van de klimaatverandering3,4. Zo zijn protocollen om de thermische grenswaarden nauwkeurig te meten belangrijke instrumenten voor onder andere ecologen, fysiologen, evolutiebiologen en conservatiebiologen.
Als de meest voorkomende en diverse landdieren worden insecten vaak gebruikt voor metingen van thermische limieten. Kritische thermische maxima (CTmax)en kritische thermische minima (CTmin) worden vaak gebruikt om intra- en interspecifieke variatie in thermische tolerantie5,6,7te beoordelen . Terwijl CTmax en CTmin kunnen worden gemeten voor meerdere fenotypes, waaronder groei, reproductieve output en gedrag, worden ze meestal toegepast op motorische functie5,6,7. Zo worden CTmax (ook wel warmte knockdown temperatuur genoemd) en CTmin vaak gedefinieerd als de hoge en lage temperaturen waarbij insecten de motorische functie verliezen en niet rechtop kunnen blijven5,6,7,8,9,10,11. CTmin valt samen met het begin van chill coma, een omkeerbare verlamming veroorzaakt door koude temperaturen6. Terwijl verlamming aan de thermische grenzen vaak omkeerbaar is, leidt voortdurende blootstelling aan deze temperaturen tot ecologische dood5.
Gemeenschappelijke methoden voor het meten van thermische grenswaarden
Er zijn verschillende apparaten gebruikt om thermische limieten te meten (samengevat in Sinclair et al.) 6.Kortom, insecten worden verwarmd of gekoeld in couveuses12,13, containers ondergedompeld in vloeistofbaden11,,14,,15,,16, aluminiumblokken10,,17of gejaste containers18, en bewaakt tot de bewegingsvrijheid ophoudt. Om insecten tijdens de test te monitoren, is de meest voorkomende methode directe observatie, waarbij individuen continu in real time of retrospectief worden gecontroleerd met opgenomen video6,9,10,11,15,17. Hoewel directe observatiemethoden minimale apparatuurvereisten hebben, zijn ze arbeidsintensief en beperken ze de doorvoer. Als alternatief kunnen insecten indirect worden waargenomen door individuen te verzamelen op discrete tijdstippen als ze uit zitstokken6,19,20,,21 vallen of activiteitenmonitorengebruiken 13.
Indirecte methoden voor het meten van thermische grenswaarden zijn over het algemeen een hogere doorvoer en mogelijk minder foutgevoelig dan directe observatiemethoden. De meest voorkomende methode voor indirecte monitoring maakt gebruik van een gejackte temperatuurgecontroleerde kolom6,8,19,20,21. Insecten worden in een kolom met zitstokken geplaatst en de temperatuur van de binnenkamer wordt gecontroleerd door vloeistof uit een temperatuurgestuurd vochtbad door de bekleding van de kolom te pompen. Personen die hun thermische limiet bereiken, vallen van hun baars en worden verzameld bij discrete temperaturen of tijdsintervallen. Hoewel deze methode goed werkt voor CTmin,is het ongeschikt bevonden voor CTmax,omdat vliegen vrijwillig uit de bodem van de kolom lopen wanneer de temperatuur stijgt. De nieuwe methode die hier wordt beschreven omzeilt dit probleem door individueel vliegen te bevatten tijdens geautomatiseerde metingen.
Naast de observatiemethode worden twee soorten temperatuurregimes vaak gebruikt om de bovenste thermische grenswaarden te beoordelen. Dynamische testen bestaan uit het geleidelijk verhogen van de temperatuur totdat de motorische functie verloren gaat; die temperatuur is de dynamische CTmax7,8,9,13. In tegenstelling, statische testen bestaan uit een constante stressvolle temperatuur totdat de motorische functie verloren gaat; dat tijdspunt is de heat knockdown time (heat KDT), ook wel de statische CTmax (sCTmax)genoemd in een recent artikel van Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Hoewel CTmax en warmte knockdown tests (warmte KD-testen) statistieken produceren met verschillende eenheden, geeft wiskundige modellering van de twee eigenschappen aan dat ze vergelijkbare informatie geven over warmtetolerantie en beide ecologisch relevant zijn8,9. Dynamische tests leveren een temperatuur op die kan worden vergeleken met de omgevingsomstandigheden, en ze hebben de voorkeur wanneer er grote verschillen zijn in warmtetolerantie, zoals vergelijkingen tussen soorten met zeer verschillende thermische niches. Vanwege het hoge Q10 voor de accumulatie van hitteletsel kan een statische test echter de voorkeur hebben voor het detecteren van kleine effectgroottes, zoals intraspecifieke variatie in warmtetolerantie9. Ook, praktisch gesproken, een statische test vereist minder geavanceerde apparatuur dan een dynamische test.
Doelstelling
Het doel van dit document is om methoden te formaliseren voor CTmin en warmte KD testen die kunnen worden gebruikt in toekomstig onderzoek om de thermische grenzen van motile insecten te beoordelen. De protocollen zijn aangepast aan de eerder vastgestelde methodologieën en zijn ontworpen om een hoge doorvoer, geautomatiseerd en kosteneffectief te zijn. Beide tests kunnen worden voltooid in een korte tijd (~ 2 uur), wat betekent dat meerdere experimenten kunnen worden uitgevoerd in een enkele dag, het produceren van grote hoeveelheden gegevens zonder in te boeten herhaalbaarheid of nauwkeurigheid. Met deze opstelling kan de warmtetolerantie van 96 vliegen tegelijkertijd worden gemeten, terwijl de kolom voor CTmin meer dan 100 vliegen kan bevatten, mits er voldoende oppervlakte is om te onderkomen.
De hoge doorvoermethode voor het observeren van CTmin wijzigt de gemeenschappelijke jaskolommethodologie met de toevoeging van een infraroodsensor om vliegen automatisch te tellen. Het gebruik van een infraroodsensor voor het tellen werd voor het eerst voorgesteld door Shuman et al. in 199623, maar is niet op grote schaal aangenomen. De toevoeging van de infraroodsensor maakt het mogelijk om continue gegevens te genereren in plaats van met discrete intervallen gegevens te verzamelen. Dit protocol minimaliseert ook experimenterfout door handmatige gegevensinvoer te elimineren en de noodzaak om handmatig van verzamelingsbuis onder de gevijzelde kolom op discrete tijdstippen te schakelen.
De hoge doorvoermethode voor het registreren van warmte KDT is gewijzigd uit twee eerdere studies naar warmtetolerantie bij insecten10,12. Individuele vliegen worden opgeslagen in een 96 put plaat in een temperatuur-gecontroleerde incubator en video wordt opgenomen. Dit protocol minimaliseert de bias van de experimentator bij het bepalen van warmte KDT omdat experimenten kunnen worden beoordeeld en geverifieerd door de opname af te spelen. Dit protocol biedt ook een set aangepaste Python-scripts die kunnen worden gebruikt om video-analyse te versnellen. Het gebruik van individuele putten elimineert interferentie die kan optreden wanneer andere personen bewegen of omvallen, wat een probleem kan zijn wanneer groepen individuen worden waargenomen in dezelfde arena10,17. Bovendien zorgt de temperatuurgecontroleerde incubator voor een stabiele temperatuur in alle 96 putten, in tegenstelling tot de temperatuurgradiënt die soms wordt waargenomen in een temperatuurgestuurd aluminiumblok10. Merk ook op dat de 96 goed opname methode kan worden aangepast aan dynamische CTmax en potentieel CTmin (zie Discussie) te meten.
Om elk protocol aan te tonen, werden de thermische grenzen van volwassen Drosophila melanogaster vrouwtjes uit geselecteerde lijnen van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) vergeleken24. Deze lijnen werden geselecteerd omdat voorlopige experimenten significante verschillen in thermische tolerantie aangaven. Deze tests bleken robuuste methoden te zijn om verschillen in thermische tolerantie te discrimineren. De volgende twee protocollen, high-throughput CTmin assay (sectie 1) en high-throughput heat KD-test (sectie 2), beschrijven de noodzakelijke acties om CTmin en warmte KDT-gegevens voor elke motile insect levensfase geschikt voor montage in de apparaten, zoals volwassen Drosophila. Voor CTmin is het ook essentieel dat het insect kan baars. Hier wordt elke test aangetoond in volwassen Drosophila melanogaster. Voor andere taxa - of levensfasen6kunnen echter wijzigingen nodig zijn . Kleine veranderingen kunnen onder meer het gebruik van perching materiaal met grotere openingen om grotere exemplaren in de CTmin test of met behulp van een hogere kwaliteit camera om de subtiele KDT van een langzaam bewegende insect of levensfase in de warmte KD test te onderscheiden. Dit protocol beschrijft geen methoden voor het voorbereiden van vliegen, maar het is belangrijk om opfokprotocollen te standaardiseren om herhaalbaarheid te garanderen25 (zie Garcia en Teets26 en Teets en Hahn27). De verstrekte protocollen bevatten informatie over het bouwen en opzetten van de apparaten, het registreren van metingen en een korte beschrijving van de gegevensanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. High-throughput CTmin assay
- De kolom met gejackte kolom monteren (figuur 1A, figuur 2)
- Snijd de breedste (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) en smalste (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) acrylbuizen op gelijke lengte (31,5 cm) met een ijzerzaag (figuur 2A). Deze twee buizen zullen de buitenste en binnenste muren van de jasige kolom.
- Snijd twee ringen (2 cm breed) uit de middelgrote (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) acrylbuis met een ijzerzaag (figuur 2A). Deze twee ringen zullen de afstandhouders tussen de binnenste en buitenste buizen, het creëren van een ruimte tussen de twee lange acryl buizen voor vloeistof te stromen.
- Boor voorzichtig twee gaten in de buitenste (breedste) acrylbuis, een gat aan de bovenkant en een aan de onderkant. Zorg ervoor dat elk gat zich op 3,5 cm van het einde van de buis bevindt. Boor de gaten aan weerszijden van de buis(figuur 2B).
- Om scheuren te verminderen, plaats tape op de buis over de plek van het toekomstige gat en boor heel langzaam op de laagste koppelinstelling van de boor.
- Met behulp van de schroefdraad kraan, draad beide gaten, zodat de slang adapters kunnen worden geschroefd in de twee gaten van de buitenste buis. Om scheuren te verminderen, gebruik smeermiddel, en draad langzaam met de hand.
- Schuif de twee afstandhouders op de binnenjas, een aan elk uiteinde (onder en boven). Laat een kleine ruimte (0,5 cm) tussen de afstand en het uiteinde van de binnenjas(figuur 2B).
- Las de afstandhouders op hun plaats met acrylcement.
- Nadat het cement op de binnenband en spacers sets, schuif deze constructie in de grotere buitenste buis met de gaten. Zorg ervoor dat de buiten- en binnenbanden aan beide uiteinden doorspoelen. De afstandhouders begen zich op 0,5 cm van het einde en vormen kleine loopgraven aan beide uiteinden van de kolom(figuur 2C).
- Las de buitenbuis aan de afstandhouders met behulp van acrylcement, met behulp van verstelbare stalen klemmen om het apparaat bij elkaar te houden. Wacht tot het cement klaar is.
- Rijg de slangadapters in de gaten van de buitenbuis die nu aan de afstandhouders en de binnenband zijn bevestigd.
OPMERKING: De adapters mogen alleen in de buitenste buis rijgen en niet in de open ruimte tussen de binnen- en buitenste buizen. Als de slangadapters te ver naar binnen rijgen, verkort ze dan met een ijzerzaag tot de juiste lengte. - Sluit de slangadapters in hun draden op de buitenbuis af met siliconenkit.
- Vul de twee loopgraven tussen de binnenste en buitenste buizen aan beide uiteinden van de gejackte kolom met siliconen kit.
- Als u de kolom wilt testen, bevestigt u buizen met een diameter van 0,6 cm aan de slangadapters. Sluit de adapter aan de onderkant van de kolom aan op een waterbron met slang en de adapter boven aan de kolom op een afvoer met een ander stuk slang.
- Voer water door het apparaat van de bodem naar de top en controleer op lekken. Als er lekken zijn, identificeren waar ze vandaan komen en verzegelen met siliconen.
- Het instellen van de jaskolom en Drosophila Funnel Monitor (DFM)
- Zet de gejackte kolom vast aan een retortstandaard met een drieledige retortklem. Lijn de kolom verticaal uit met het ene uiteinde open naar het plafond en het andere open naar de labbank(figuur 1B).
- Sluit de vloeistofinvoer en -output van een temperatuurgestuurd gekoeld bad aan op de adaptersproeiers van de kolom met plastic buizen met een diameter van 0,6 cm (figuur 1B). Sluit de vloeistofinvoer aan op het mondstuk onder aan de kolom en de vloeistofuitvoer met het mondstuk boven aan de kolom.
- Snijd twee 3 cm dikke ronde schuim isolerende pluggen (dezelfde omtrek als de opening van het binnenste compartiment van de kolom). Zorg ervoor dat de stekkers goed passen en sluit de binnenste kolom wanneer deze aan beide uiteinden wordt geplaatst(figuur 1B).
- Doorboor een gat door het midden van een van de pluggen en rijg het kale uiteinde van een thermokoppel door het gat ongeveer 5 cm en veilig met tape. Sluit het andere uiteinde van het thermokoppel aan op een thermokoppel datalogger.
- Sluit de thermokoppeldatalogger aan op de computer.
- Wig twee stukken plastic goot bewaker (5 cm x 7 cm, met ~ 0,5 cm diameter openingen) in de kolom om te functioneren als zitmateriaal. Plaats een stuk beschermkap 2/3rds vanaf de bovenkant van de kolom en het andere 1/3rd vanaf de bovenkant van de kolom (Figuur 1B).
- Zet de onderste stekker (zonder thermokoppel) en de bovenste stekker (met een thermokoppel) vast. Wanneer de stekker boven aan de kolom wordt geplaatst, moet u ervoor zorgen dat het thermokoppel de zijkanten van de kolom niet raakt.
- Pas de hoogte van de kolom op de retort stand, zodat er een 25 cm afstand tussen de onderkant van de kolom en de bank boven.
- Zet een retortring (5 cm diameter) vast aan de retortstandaard 5 cm onder de onderkant van de kolom en draai de ring naar de zijkant van de kolom.
- Stel de DFM direct op de retortring(figuur 1B). Sluit alle elektronische componenten aan: de voeding, de stroomvoorzieningsinterface en de computer volgens het protocol van de fabrikant.
- Zodra de componenten zijn aangesloten, volg het protocol van de fabrikant om de installatie van de DFM- en DFM-software af te ronden.
- CtMin Test
- Draai de ingangs- en uitgangskleppen van het vloeistofbad naar de open posities.
- Druk op de aan/uit-knop om het temperatuurgestuurde vloeistofbad in te schakelen en druk vervolgens op de afspeelknop om een programma uit te voeren dat de temperatuur van het bad verhoogt en handhaaft tot 25 °C. Geef het vochtbad en de kolom 5-10 min om 25 °C te bereiken en te onderhouden.
- Verwijder de stekker aan de bovenkant van de kolom en vervang deze door een trechter (5,08 cm diameter; zie figuur 1C).
- Tik vliegen van hun voedsel flacon in de kolom.
- Verwijder de trechter en vervang deze snel door de bovenste stekker, let op dat vliegen niet ontsnappen. Geef de vliegen 5 min te vestigen, af en toe tikken op de onderste stekker aan te moedigen de vliegen te klimmen.
- Druk op de startknop op het vloeistofbad en begin met het CTmin ramping programma (25 °C gedurende 5 min; 25 °C tot 10 °C bij 0,5 °C/min; 10 °C gedurende 2 min; vervolgens 10 °C tot -10 °C bij 0,25 °C/min).
OPMERKING: Andere varianten van dit CTmin ramping protocol kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeksvraag (bijvoorbeeld vergelijkingen van de effecten van verschillende hellingspercentages op CTmin28). - Klik op open de thermocouple opnamesoftware op de computer en klik vervolgens op het pictogram Opnemen om te beginnen met het opnemen van de temperatuur in de kolom elke seconde voor de duur van de test. Zorg ervoor dat elke temperatuurregistratie een tijdstempel bevat die specifiek is voor de tweede, zodat temperatuurgegevens later kunnen worden samengevoegd met gegevens van de DFM.
- Voeg 5 mL ethanol toe aan een kegelvormige centrifugebuis van 15 mL en plaats deze in een rek onder de kolom.
- Af en toe tik je op de onderste stekker van de kolom om vliegen op de bodem te verleiden om te klimmen. De meeste vliegen zullen op een baars of in de buurt van de bovenkant van de kolom door 15 °C.
- Bij 15 °C, verwijder de onderste stekker en verzamel alle vliegen nog op de onderste stekker in de ethanol. Tellen en er rekening mee dat deze vliegen werden verzameld op 15 °C, maar hun CTmin is onbekend.
OPMERKING: De temperatuur waarbij de onderste stekker wordt verwijderd, moet vóór de test worden bepaald en op basis van de voorspeldeCT-min van de testsoort of behandeling. Voor deze test werd 15 °C gekozen op basis van de CTmin van deze specifieke DGRP-lijnen die in voorlopige tests werden aangetroffen. - Plaats een glazen trechter met een buitendiameter met een buitendiameter in de DFM. Pas de retortring, DFM en trechter zo aan dat ze zich onder de kolom bevinden. Zorg ervoor dat de lip van de trechter de onderkant van de kolom volledig afdicht(figuur 1D).
- Plaats de onderkant van de trechter in de 15 mL-opvangbuis(figuur 1D).
- Open de DFM-software op de computer door op het pictogram Software te klikken. De software zal onmiddellijk beginnen met het opnemen van de tijd / datum waarop vliegen hun CTminbereiken. Vliegen die hun CTmin te bereiken verliezen neuromusculaire functie en vallen uit hun zitstokken, en daarna via de DFM.
- Controleer of alle vliegen hun CTmin hebben bereikt als de temperatuur daalt door het controleren van de bovenste stekker en zitstokken om te zien of er nog vliegen zijn nog steeds neergestreken (dat wil zeggen, nog steeds behoud van neuromusculaire functie). De proef eindigt wanneer alle vliegen hebben hun CTminbereikt .
- Pas aan het einde van de proef de DFM aan en trechter weg van de kolomopening. Sommige vliegen kunnen hun CTmin bereiken, maar blijven vastzitten in de kolom (d.w.z. ingeklemd in een baars of bungelend aan een enkele tarsale haak). Open de bovenste stekker en verwijder deze vliegen. De CTmin van deze vliegen is onbekend.
- Combineer de .txt-uitvoerbestanden van de thermokoppelopnamesoftware (d.w.z. temperatuur, datum en tijd) en de DFM-software (d.w.z. het aantal vliegen door de trechter, datum en tijd) met behulp van de opdracht Samenvoegen in RStudio. Voeg de twee bestanden samen op basis van de variabele gedeelde datum/tijd.
2. Hoge doorvoer warmte KD test
- Montage en voorbereiding van apparaten
- Bevestig met een lijm het stalen geweven gaas (~1,5 mm diafragma) aan de onderkant van een 96 put no-bottom plaat.
- Bevestig magneten aan de tegenovergestelde zijden van de bodem van een 96 goed no-bottom plaat met een hete lijm pistool en hete lijm (Figuur 3).
- Om een aangepaste septum deksel met lijm film ontworpen voor 96 put platen ambachtelijke, plak twee films kleverige zijden samen om een geribbelde plastic vel te vormen.
- Plaats de plastic platen over de 96 put plaat en gebruik tape om het te hechten aan alle vier de zijden van de plaat. Snijd bij de opening van elke put op de plaat een 'x' in het plastic vel met een stanleymes (d.w.z. 96 totaal x's).
- Verdoven vliegen met CO2 en laad ze individueel in elke put van de gewijzigde 96 goed no-bottom plaat met een aspirator en septum deksel. Haal het septumdeksel van de 96 putplaat terwijl de vliegen verdoofd zijn met CO2 en vervang het door een strak passend duidelijk deksel.
- Plaats de 96 goed no-bottom plaat geladen met vliegen en met een duidelijke nauwsluitende deksel op voedsel. Zorg ervoor dat de vliegen ten minste2 48 uur hebben tussen CO 2-verdovendering en het begin van de test (stap 2.2.1-2.2.5).
OPMERKING: De bodem van de gemodificeerde 96 put no-bottom platen is gemaakt van gaas, zodat vliegen verdoofd met CO2 kan worden geladen en links op voedsel voor ten minste 48 uur voordat een proef begint. Elke plastic container >8,5 cm breed x 13 cm lang die ten minste 2 cm diep is om een 1 cm diepe laag voedsel te huisvesten, kan worden gebruikt. - Bevestig een webcam aan de onderkant van de binnenkant van een temperatuurgestuurde incubator met tape. Richt de camera direct omhoog (figuur 4). Zet een couveuseplank ongeveer 10 cm boven de camera vast.
OPMERKING: De webcam wijst omhoog en registreert de 96 putplaat van onderaf om ervoor te zorgen dat zoveel mogelijk van het putoppervlak in beeld is (bijvoorbeeld niet uit het zicht worden geblokkeerd door de putwanden van de plaat). Wanneer de vliegen hun KDT bereiken, vallen ze naar de bodem van de put; in dit geval, de kant het dichtst bij de webcam, en zijn daarom in het zicht, ongeacht hoe ver hun goed is vanuit het centrum van het zicht. - Sluit de webcam aan op een computer.
- Bevestig met tape een wit vel papier (8,5 cm x 13 cm; het exacte gebied van de bodem van de 96 putplaat) aan de onderkant van de plank(figuur 4). Zorg ervoor dat het papier het hele frame vult wanneer het wordt bekeken via de webcam.
- Plaats een lichtbron in de couveuse. Gebruik papier of andere materialen om de verlichting te dempen en verblinding te minimaliseren.
OPMERKING Stap 2.1.10 is specifiek voor elke incubator omdat verlichting en reflecties verschillen tussen couveuses. Het doel is om voldoende verlichting in de couveuse te hebben om een goed contrast te bieden tussen de vliegen in elke put en het witte vel papier achter de plaat wanneer bekeken met de webcam.
- Het uitvoeren van de warmte KD test
- Zet de couveuse op 37,5 °C en wacht ongeveer 30 minuten om de couveuse de tijd te geven om de gewenste temperatuur te bereiken en te behouden. De exacte temperatuur zal afhangen van het insect dat wordt beoordeeld en eventuele andere tijdsoverwegingen.
- Plaats de 96 putplaat omgekeerd in de couveuse, zodat de onderkant van de plaat (mesh kant) tegen het wit papier op de bodem van de lade(figuur 4). Let op de oriëntatie van de putten (kolom- en rijnamen) op de lade en in het frame van de webcam. Gekleurde tape langs de zijkanten van de 96 put plaat en randen van het witte stuk papier kan de oriëntatie te verifiëren(figuur 4).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de temperatuur van de couveuse overeenkomt met de temperatuur in de 96 putplaat door de temperatuur in de plaat vast te leggen met een thermokoppel tijdens een testproef van de warmte KD-test. Het is ook verstandig om te controleren of er een verwaarloosbare variatie in temperatuur is tussen de putten van de 96 putplaat met meerdere thermokoppels voordat u de warmte KD-test uitvoert. - Sluit de couveusedeur.
- Klik op Opnemen op de video-opnamesoftware.
- Na 2 uur, controleer de opname om te zien dat alle vliegen hun laatste rustplaats hebben bereikt en gestopt met bewegen. Zodra alle vliegen zijn gestopt met bewegen, klikt u op Stoppen op de video-opnamesoftware. Voor de hier geteste genotypen, gefokt bij 25 °C, bereiken de meeste vliegen hun KDT met 60 min bij 37,5 °C (zie ook Jørgensen et al.9).
- Gooi de vliegen weg.
- Gebruik de aangepaste Python-scripts(Aanvullende coderingsbestanden 1-3) om de tijd in de video te benaderen wanneer vliegen hun warmte KDT bereiken.
LET OP: Stap 2.2.7 is optioneel. Om de video-analyse te versnellen, zijn een set aangepaste Python-scripts ontwikkeld om veranderingen in pixeldichtheid in de loop van de tijd in elke put te meten (zie Aanvullend coderingsbestand). Wanneer de vliegen stoppen met bewegen, is de pixeldichtheid constant en kan een plot van deze gegevens worden gebruikt om de geschatte tijd in de video te lokaliseren wanneer vliegen worden neergehaald. Hoewel het mogelijk is om dit script te gebruiken om gegevensanalyse te automatiseren, leiden momenteel kleine onvolkomenheden in de video tot kleine verschillen tussen veranderingen in pixeldichtheid en de echte KD-tijd. - Klik op het videobestand openen en neem de KDT van elke vlieg in elke put. De meest consistente maatregel van warmte KDT tussen proeven en waarnemers is het opnemen van het tijdstip waarop een vlieg bereikt zijn laatste rustplaats.
- Volg de video in omgekeerde richting, gericht op een enkele put, en wijzend op het tijdstip waarop de vlieg eerst beweegt uit zijn laatste rustplaats. Herhaal dit proces voor elke put.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De thermische grenswaarden (d.w.z. CTmin en warmte KDT) van vrouwen van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) werden gemeten om de gegevens met hoge doorvoer aan te tonen die uit de twee beschreven protocollen werden gegenereerd. CTmin werd gessayd met behulp van de DGRP-lijnen 714 (n = 37) en 913 (n = 45). Heat KDT werd gessayd en vergeleken met de DGRP lijnen 189 (n = 42) en 461 (n = 42), en videobestanden werden handmatig geanalyseerd. De totale tijd van de experimenten, met inbegrip van het bekijken van de video, duurde <2 h voor elk protocol.
Vrouwtjes van de DGRP-lijn 913 hadden aanzienlijk lagere gemiddelde CTmin-temperaturen dan vrouwen uit de DGRP-lijn 714 (figuur 5A; Wilcoxon rang som test, W = 1585, P < 0,001). De twee lijnen hadden duidelijk verschillende verdelingen van CTmin: lijn 913 had een CTmin van 5,00 ± 1,35 °C (gemiddelde ± SD) en lijn 714 had een CTmin van 9,60 ± 1,53 °C.
De KDT-serie bij 37,5 °C verschilde aanzienlijk tussen de vrouwtjes uit de DGRP-lijnen 73 en 461 (figuur 5B; Wilcoxon rang som test, W = 1658,5, P < 0,001). Hoewel er variatie was in de KDT van beide lijnen, werden verschillen in warmte KDT's tussen lijnen gemakkelijk gedetecteerd. Lijn 73 had een 14,8 min langer gemiddelde KDT dan lijn 461 (Lijn 73 gemiddelde KDT, 55.58 ± 6.92 min; Lijn 461 betekent KDT, 40,78 ± 6,64 min).
Figuur 1: Het instellen van de jaskolom voor de CTmin test. (A) Geassembleerde kolom met jas. (B) Jasige kolom met boven-en onderkant stekkers afdichting van de binnenste kamer. Het thermokoppel wordt door een gat in de bovenste stekker draad. De DFM is gemonteerd op een retort ring onder de kolom en verplaatst naar de zijkant. (C) Start van een CTmin test. De bovenste stekker werd verwijderd en vliegen werden gegoten in de binnenste kamer via een trechter op de bovenste opening van de kolom. (D) Jasje kolom en DFM tijdens een CTmin test. De onderste stekker werd uit de kolom verwijderd en de DFM en trechter werden onder de kolom geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Technische illustratie van de gevestde kolom. (A) Elk stuk acrylbuizen op lengte gesneden: i) twee afstandsringen die tot 3,5 cm lang worden gesneden (stap 1.1.2):ii). de breedste acrylslang die tot 31,5 cm wordt gesneden (stap 1.1.1); en iii de smalste acrylbuizen die tot 31,5 cm (stap 1.1.1) worden gesneden. (B) Twee gaten (in grijs) geboord in het breedste stuk acryl buizen, 3,5 cm van elk uiteinde en aan weerszijden (i; stap 1.1.2). Montage van het smalste stuk acrylbuizen met de twee afstandsringen (ii; stap 1.1.6 en 1.1.7). (C) De ingevulde jaskolom na stap 1.1.8-1.1.12. Slangadapters zijn grijs aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Onder (links) en boven (rechts) zicht op de 96 goed no-bottom plaat. Staal geweven gaas is bevestigd aan de onderkant van een gewijzigde 96 goed no-bottom plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Incubator setup voor een warmte KD test. (A) Webcam en podium opgezet op een afstand. (B) Webcam en stage setup in de incubator voordat een proef begint. De webcam is bevestigd aan de vloer van de incubator en de lade is ~ 10 cm boven de webcam. (C) Oriëntatie van de 96 put plaat op het witte podium boven de webcam tijdens een warmte KD test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Lagere en bovenste thermische limieten van bepaalde lijnen uit het Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP). (A) CTmin-waarden van twee DGRP-lijnen. (B) Heat KDT van twee DGRP lijnen bij 37,5 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Activiteitsuitvoer uit de videoanalysescripts van een testgegevensset. Elk perceel vertegenwoordigt de activiteitsgegevens van één put van een 96 putplaat. In totaal werden 84 monsters getest en getoond. Nou ID is gelabeld aan de rechterkant van elk histogram. Klik hier om dit cijfer te bekijken.
Aanvullend coderingsdossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsdossier 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsdossier 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De twee hierboven beschreven methoden genereren gegevens met een hoge doorvoer van ecologisch relevante statistieken voor hogere en lagere thermische limieten. Deze protocollen bouwen voort op eerder vastgestelde methoden die gemeenschappelijk zijn voor onderzoek naar insectenthermische grenswaarden (samengevat in Sinclair et al.) 6. Beide protocollen kunnen worden voltooid in een korte tijd (~ 2 uur per stuk), produceren gegevenssets met grote steekproefgroottes, niet opofferen herhaalbaarheid of nauwkeurigheid, en het minimaliseren van experimenter fout door het elimineren van handmatige gegevens opname en invoer (CTmin test), of door het creëren van back-up video-opnamen van elke test (warmte KD test).
Representatieve resultaten werden gegenereerd door de thermische grenswaarden van volwassen vrouwen te vergelijken met geselecteerde lijnen van de DGRP24. Beide tests toonden significante verschillen in thermische tolerantie tussen lijnen. De effectgrootte tussen de lijnen in elk van deze tests was relatief groot, wat op zijn beurt een betrouwbare differentiatie van groepen met visuele en statistische vergelijkingen mogelijk maakte. Het grote verschil in KDT tussen de twee DGRP-lijnen benadrukt een potentieel voordeel van een statische test ten opzichte van een dynamische ramping-test; statische tests kunnen beter in staat zijn om kleinere verschillen tussen groepen te detecteren dan dynamische tests9. De twee DGRP lijnen onderworpen aan de warmte KD test verschilde in gemiddelde KDT met 14,8 min. Ter referentie, met behulp van een dynamisch ramping protocol, Rolandi et al.13 toonde aan dat het verschil van de hoogste en laagste CTmax waarden van 34 DGRP lijnen was slechts 1,42 °C, of <6 min met een 0,25 °C / min helling.
Ten opzichte van andere methoden, zijn er verschillende voordelen aan zowel de CTmin test en warmte KD test hier beschreven. Geautomatiseerd tellen in deCT-mintest vermindert de hoeveelheid tijd die een experimentator besteedt aan het apparaat, waardoor de hoeveelheid tijd die kan worden besteed aan andere taken wordt verhoogd. De kosten voor het bouwen van de acryl-jas kolom is ~ $ 50, in vergelijking met de geschatte $ 400 aan een op maat gemaakte glazen jas kolom te kopen. Voor de warmte KD-test, video-opname elimineert de noodzaak voor directe waarnemingen in real time en neemt een kleine hoeveelheid fysieke ruimte per monster. Andere protocollen, zoals die gebruikt door Jørgensen et al.9, gebruik maken van een groot aquarium voor het bekijken van individuen ondergedompeld in aparte flesjes, maar deze methode vereist goed opgeleide onderzoekers om snel te controleren flesjes voor beweging en een grote hoeveelheid ruimte voor het apparaat. Rolandi et al.13 gebruikt infrarood sensoren om beweging of gebrek aan beweging te detecteren bij CTmax in 96 goed platen, terwijl deze warmte KD test maakt gebruik van een goedkope webcam (~ $ 70) voor het detecteren van beweging. Deze camera kan subtiele bewegingen detecteren die gemist kunnen worden door een infraroodactiviteitsmonitor.
Verder werd een set aanpasbare scripts ontwikkeld om KDT snel te schatten in de warmte KD-test(Additionaly Coding File 1-3). Deze scripts kunnen worden gebruikt om tijd te besparen door het verkrijgen van een ruwe benadering van warmte KDT in elke goed voor het bekijken van de video, en met een hogere videokwaliteit deze scripts kunnen mogelijk automatiseren gegevensopname. Er zijn drie scripts geleverd om de video te verwerken: FirstFrame.py (Aanvullende coderingsdossier 1),die het eerste beeldframe van de video definieert; WellDefine.py (Aanvullende codering Bestand 2), die elke afzonderlijke put van de 96 put plaat definieert in het eerste beeldframe; en MotionDetect.py (Aanvullende codering bestand 3), die het videobestand transformeert naar een activiteit signaal door het berekenen van de verandering in pixeldichtheid tussen sequentiële frames. De enige input voor het programma is het videobestand, en de uitvoer bevat overzichtsstatistieken en een gegevensset van tijdreeksen van activiteit per put(figuur 6). Verschillen in pixeldichtheid tussen videoframes worden getransformeerd met behulp van een grijswaardenfilter om de afmetingen van de afbeelding te verminderen, een Gaussian low pass-filter om beeldruis te verminderen en een verwijdingmorfologische bewerking om de randen van bewegende objecten te vergroten. In dit geval wordt activiteit gedefinieerd als het absolute verschil in pixelwaarden tussen sequentiële frames. De warmteKDT kan vervolgens worden geschat als de index van het laatste frame met een activiteitswaarde groter dan nul. Het frame waarin de activiteit voor het laatst werd geregistreerd in put g12 van een voorbeeldgegevensset (figuur 6) was bijvoorbeeld net na 2.000 s (33.33 min), zoals aangegeven door een vlakke lijn. Een waarnemer kan dan de digitale video afspelen en snel de Heat KDT van goed g12 vinden met deze tijdstempel.
Met kleine wijzigingen en het oplossen van problemen zijn er extra toepassingen voor beide tests, met name met de warmte KD-test. De video-opname setup kan worden gewijzigd om statische koude knockdown tijden op te nemen, chill coma hersteltijd, of potentieel dynamische CTmax en CTmin waarden. Chill coma hersteltijd is de hoeveelheid tijd die het duurt een individu om beweging te hervatten na koude stress29. Daarom kan chill coma hersteltijd worden gemeten met deze setup door het induceren van chill coma in de 96 put plaat, dan met behulp van de video-setup om de hersteltijd in de incubator op te nemen. Ten slotte, met zorgvuldige fine-tuning, dynamische CTmax of CTmin kan worden opgenomen in een programmeerbare oprit incubator. Zorgvuldige aandacht voor de temperatuur in elk van de 96 putten zou een punt van zorg zijn, omdat lichte variaties in temperatuur in de incubator kunnen worden vergroot tussen putten als de temperatuur verandert.
Bij het uitvoeren van de CTmin- of warmteK.-test moet rekening worden gehouden met verschillende overwegingen. Eerst en vooral kan de kwaliteit, leeftijd, geslacht, levensfase, genetische achtergrond en eerdere ervaring van een insect thermische grenswaarden6,13,,30,31beïnvloeden., Voor beide tests moeten proefpersonen motile zijn. Ten tweede kan voor elk CTmin-apparaat slechts één groep tegelijk worden gessayd. Daarom moeten variabelen zoals dagvariatie in thermische tolerantie32,33 in aanmerking worden genomen bij het vergelijken van behandelingen. Een oplossing voor dit probleem is het uitvoeren van CTmin testen van meerdere behandelingsaandoeningen met meerdere apparaten op hetzelfde moment. Ten derde zijn sommige soorten mogelijk niet geschikt voor één of beide tests. Sommige soorten kunnen bijvoorbeeld niet gemakkelijk klimmen of vliegen naar zitstokken in de CTmin-test of de activiteit bij hoge temperaturen staken voordat hun warmte KDT wordt bereikt, wat het moeilijk zou maken om een knockdown-tijd te onderscheiden. Ten slotte, om nauwkeurige vergelijkingen in de warmte KD-test te waarborgen, is het van cruciaal belang dat de criteria voor KDT (stap 2.2.8) consistent is tussen replica's, waarnemers, proeven, enz. Om verschillende insectensoorten aan te passen, kunnen wijzigingen aan een van de testapparaten nodig zijn. Mogelijke wijzigingen omvatten het gebruik van verschillende soorten zitstokken voor de CTmin test, met behulp van celkweek platen met minder putten en meer ruimte (48, 24, 12, of 6 putten) in plaats van de 96 put plaat om grotere insecten tegemoet te komen, of het aanpassen van de temperatuur die wordt gebruikt voor de warmte KD test om een knockdown tijd die niet te snel of te traag te zorgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Ellie McCabe voor hulp bij het grootbrengen. Dit werk wordt ondersteund door het United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 en National Science Foundation subsidie OIA-1826689 aan N.M.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing - 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
