Summary
在这里，我们建立了一种低成本和易于操作的方法，将胚胎干细胞快速高效分化为神经元。该方法适用于实验室的推广，是神经学研究的有用工具。
Abstract
小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经生成的关键机制并可能有助于再生医学的潜在工具。在这里，我们建立了一种高效和低成本的神经元分化方法，从mESC体外， 使用组合筛选的策略。根据此处定义的条件，2 天胚胎体形成 – 6 天视网膜酸诱导协议允许从 mESC 快速有效地分化为神经前体细胞 （NPC），如形成堆叠良好和中性状 A2lox 和 129 个内斯汀阳性衍生物所示。胚胎体的健康状态和使用网膜酸 （RA） 的时间点以及 RA 浓度在此过程中至关重要。在随后从NPC向神经元的分化中，N2B27中II（辅以神经基质介质）可以更好地支持神经元细胞的长期维持和成熟。该方法效率高、成本低、操作方便，是神经生物学和发育生物学研究的有力工具。
Introduction
胚胎干细胞（ESCs）是多能的，可以分化成神经前体细胞（NPC），随后在某些条件下进入神经元1。基于ESC的神经生成提供了模仿神经生成的最佳平台，从而作为发展生物学研究的有用工具，并可能有助于再生医学2，3。在过去的几十年里，许多诱导胚胎神经生成的策略被报道，如转基因方法4，使用小分子5，使用3D矩阵微环境6，和共生技术7。但是，这些协议大多条件有限或难以操作，因此不适合在大多数实验室中使用。
为了找到一种操作简单、成本低廉的方法，实现与 mESC 的有效神经分化，这里使用了组合筛查策略。如图1所述，胚胎神经生成的整个过程分为两个阶段。第一阶段是指从 mESC 到 NPC 的分化过程，第二阶段涉及从 NPC 到神经元的后续分化。基于操作方便、成本低、材料易用、分化效率高的原则，根据传统的单层培养系统或胚胎体形成系统8、9，选择了第一阶段的7个协议和第二阶段的3个协议。利用细胞形态观察和免疫荧光检测，评估了两个阶段协议的分化效率。通过结合每个阶段最有效的协议，我们建立了神经分化与 mESC 的优化方法。
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Protocol
1. 小鼠胚胎干细胞培养
- 准备 0.1% 明胶涂层细胞培养皿或盘子。
- 加入2 mL的灭菌0.1%明胶（0.1%w/v在水中）到60毫米细胞培养皿。轻轻摇动，确保细胞培养皿均匀涂层。
- 将菜肴放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，并允许涂层 1 小时。
- 在播种细胞之前取出0.1%的明胶溶液。
注意：去除明胶后，无需干燥或清洗涂层的盘子。
- 小鼠胚胎干细胞（A2lox和129）培养
- 在 0.1% 明胶中孵化 mESC （A2lox 和 129） 细胞，分别在 5% CO2 孵化器中以 37 °C 在 mESC 生长介质中涂上 60 mm 细胞培养皿。mESC 增长介质包括 85% 淘汰 DMEM/F12、15% 淘汰血清置换 （KSR）、0.1 m β甲醇 （2ME）、2 mM 谷胱甘肽、 1%非必需氨基酸（NEAA）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）。
警告：β甲醇易燃，具有吸入毒性。远离火源，戴上口罩，避免在使用时吸入。 - 每天更改 mESC 增长介质，以更好地促进 A2lox 和 129 的增长。
- 当细胞达到80%的汇合时，取出介质，在菜中加入1 mL的0.1%的试金石。轻轻摇动30s，以确保所有细胞上均覆盖试金石。
- 离开细胞约1分钟 ，尝试蛋白化，然后使用1 mL移液器去除试金石。
- 在菜中加入 2 mL 的 mESC 生长介质，上上下下几次移液器，使单个细胞悬架。
- 使用血细胞计尽可能准确地计算悬架中细胞的密度。
- 将细胞分成7组，使用 表1中显示的不同方案诱导分化。
- 在 0.1% 明胶中孵化 mESC （A2lox 和 129） 细胞，分别在 5% CO2 孵化器中以 37 °C 在 mESC 生长介质中涂上 60 mm 细胞培养皿。mESC 增长介质包括 85% 淘汰 DMEM/F12、15% 淘汰血清置换 （KSR）、0.1 m β甲醇 （2ME）、2 mM 谷胱甘肽、 1%非必需氨基酸（NEAA）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）。
2. 从中小企业到NPC的差异化（第一阶段）
- 准备 0.1% 明胶涂层细胞培养板或盖片。
- 使用前，准备 0.1% 明胶涂层 6 井板或盖片，如第 1.1 步。
- 使用协议 1 （表 1）进行第一阶段分化
- 种子约2 x 104 mESCs在2 mL的基底分化介质I每口井在0.1%明胶涂层6井板。检查显微镜下的细胞密度。
- 在 5% CO2 孵化器中以 37 °C 孵育细胞 6 小时，以便附件。
- 附着后，从孵化器中取出细胞，用2 mL的PBS清洗细胞两次。
- 在每个井中加入2 mL的基底分化介质I（表1），并将细胞放回孵化器。
- 离开细胞进行8天的分化。每2天更换一次基底分化介质I。
- 使用协议 2 （表 1） 进行第一阶段分化
- 在 10 mL 的基底分化介质 I 中加入 1.5 x 106 mESCs 到非粘性细菌盘中，以便在 5% CO2 孵化器中以 37 °C 形成胚胎体。
- 2天后，将细胞聚集物转移到15mL离心管中，让它们通过重力沉降。
- 去除超纳坦，加入10mL的新鲜基底分化介质I，以重新悬浮胚胎体。将它们重新种植到一个新的非粘性细菌盘中，并允许分化2天。
- 检查显微镜下胚胎体的形成（图2A）。
- 收集步骤 2.3.2-2.3.3 中描述的胚胎体。种子约50胚胎体在2mL的基底分化介质I每口井到0.1%明胶涂层6井板。
- 准备 1 mm 全跨 RA 库存（在 DMSO 中），并在分包装后将光线存放在 -80 °C 冰柜中。
注意：RA是不稳定的，在准备RA库存时，应注意使其远离光线和减少空气接触。 - 对于 RA 感应，在每个油井中加入 2 μL 的 RA 库存，最终浓度为 1 μM。
- 将板放入 37 °C 的 5% CO2 孵化器中，再分化 4 天。
- 每2天更换2 mL的基底分化介质I（带1μM RA）。
- 使用协议 3 （表 1） 分化第一阶段
- 将 1.5 x 106 mESCs 种植到 10 mL 的基底分化介质 I 中，在 5% CO 2 孵化器中以 37 °C 的胚胎体形成2 天。
- 检查显微镜下胚胎体的形成（图2B）。
- 将细胞聚集物转移到15 mL离心管中，让它们通过重力稳定下来。
- 小心地取出超纳坦，加入10 mL的新鲜基底分化介质I来重新悬浮它们。
- 种子约50胚胎体到2 mL的基底分化介质I每口井到0.1%明胶涂层6井板。
- 对于 RA 感应，在每个油井中加入 2 μL 的 RA 库存，最终浓度为 1 μM。
- 将板放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，再分化 6 天。每 2 天更换一次整个基底分化介质 I（带 1 μM RA）。
- 使用协议 4 （表 1） 进行第一阶段分化
- 种子约 2 x 104 mESCs 在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。将板放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，以便附件 6 小时。
- 附件后，用2 mL的PBS清洗细胞两次。将 2 mL 的基底分化介质 I 添加到每个井中，并在 37 °C 的 5% CO2 孵化器中分化 4 天。
- 对于 RA 感应，在每个井中添加 2 μL 的全跨 RA 库存（工作浓度为 1 μM），以诱导分化再持续 4 天。
- 在整个过程中，每2天更换一次整个媒体。
- 使用协议 5 （表 1） 进行第一阶段分化
- 种子约 2 x 104 mESCs 在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。将板放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，以便附件 6 小时。
- 用 2 mL 的 PBS 清洗细胞两次。将 2 mL 的基底分化介质 I 添加到每个井中，并在 37 °C 的 5% CO 2 孵化器中进行2 天的分化。
- 对于后续的 RA 感应，在每口油井中加入 2 μL 的 RA 库存，使最终浓度为 1 μM。 将板放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，以诱导分化再持续 6 天。
- 在整个过程中，每2天更换一次整个媒体。
- 使用协议 6 （表 1） 进行第一阶段分化
- 在N2B27介质II（表1）的10mL中将1.5 x 106 mESCs植物成非粘性细菌盘，以允许胚胎体的形成。
- 第2天，收集步骤2.3.2-2.3.3中描述的细胞聚合物，并使用10 mL的新鲜N2B27介质II重新悬生胚胎体。
- 将它们重新种植到一个新的非粘性细菌盘中，并在37°C的5%CO2 孵化器中再分化2天。 检查显微镜下胚胎体的形成。
- 第4 天，收集胚胎体。种子约50胚胎体每井0.1%明胶涂层6井板与2 mL的N2B27中等II。
- 将 2 μL 的全跨 RA 库存添加到每个井中，并诱导分化再持续 4 天。每两天更换一次整个介质（N2B27 介质 II 与 1 μM RA）。
- 使用协议 7 （表 1） 进行第一阶段分化
- 种子约 2 x 104 mESCs 在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。将板放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，以便附件 6 小时。
- 用PBS清洗细胞两次。然后，在每个油井中添加 2 mL 的 N2B27 介质 II，并在 5% CO2 孵化器中在 37 °C 下进行 8 天的分化。
- 每2天更换一次整个N2B27介质II。
3. 细胞形态观察
- 每天在倒相对比光显微镜下检查上述7组的分化状态。
- 随机选择至少 12 个字段并拍照以记录 D8 上每个组的形态变化。
4. 免疫荧光染色
- 样品制备：0.1%明胶涂层盖片上的种子 mESC，并允许使用第 2 步中提及的协议进行 8 天的分化。
- 冲洗：第8天 ，从孵化器中取出样品，并按吸入去除分化介质。用 1 mL 的 PBS 轻轻冲洗细胞一次 5 分钟。
- 固定：在每个样品中添加4%的准甲醛的1mL，并在室温下固定细胞20分钟（RT）。
- 冲洗：固定后，用1 mL的PBS轻轻冲洗细胞3次，每次5分钟。
- 渗透：在 PBS 中添加 1 mL 的 0.2% 三元 X-100，并在 RT 中保留 8 分钟。
- 冲洗：渗透后，用1mL的PBS轻轻冲洗细胞3次，每次5分钟。
- 阻止：在PBS中添加1 mL的10%山羊血清到每个样本中，并在RT孵育1小时，以阻止任何非特定的相互作用。
- 与原发性抗体的孵化
- 使用PBS中5%的山羊血清以1：100的比例稀释抗内斯汀抗体。
- 将500μL的稀释抗体涂抹到不同的样品上，并在4°C下孵育过夜。
- 冲洗：去除抗体，用1mL的PBS轻轻冲洗样品，每次8分钟。
- 二次抗体孵育
- 在PBS中使用5%的山羊血清，以1：500的比例稀释Alexa Fluor 488标签的山羊抗鼠IgG。
- 将500μL的稀释抗体涂抹在不同的样品上，并在RT中在黑暗中孵育2小时。
注：应用荧光二次抗体后，在黑暗中执行所有后续步骤，以防止荧光淬火。
- 冲洗：去除二次抗体，用1 mL的PBS轻轻冲洗样品，每次8分钟。
- 核污渍和安装
- 将一滴 DAPI 安装介质放置在干净的微滑板上。
- 小心地从板中取出样品，并将样品放在 DAPI 安装介质顶部，细胞面朝下。在黑暗中离开 5 分钟在 Rt 。
- 用吸和纸去除多余的 DAPI 安装介质。
- 荧光显微镜观察
- 将标本置于荧光显微镜下，使用适当的过滤器检测 DAPI 和 Alexa Fluor 488 的信号。
- 为每个样本均匀随机地选择 10-15 个不同的视场，并使用 CCD 摄像机记录图像。
5. 从 NPC 到神经元的差异（第二阶段）
- 使用协议 3（8 天，表 1）在 I 阶段分化下准备 mESC 衍生工具，详见步骤 2.4，具有最高的分化效率（见图 3）。
注：第一阶段分化后，应采用上述细胞形态观察和免疫荧光检测进行质量控制，以确保NPC健康高产。 - 种子约 5 x 105 mESC 衍生物在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。随机将 mESC 衍生工具分为 3 组，分别是第二阶段协议 1、协议 2 和协议 3。
- 将板放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，以便附件 6 小时。用2 mL的PBS清洗两次。
- 在上述组的每口井中分别添加2 mL的基底分化介质I、N2B27介质I和N2B27介质II（表2）。
- 将板放入孵化器中，并允许再区分 10 天。每2天更换一次相应的介质。
- 检查分化状态并记录第 3 步中提到的形态变化。
- 在第18天，评估神经元的生成（β-Tubulin III阳性），并确定第4步中使用的3个协议的分化效率。
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Representative Results
2 天胚胎体形成 + 6 天 RA 感应最能指导 MESC 分化到 NPC （第一阶段）。为了确定最能促进将 mESC 分化为 NPC（第一阶段）的最佳方案，在 A2lox 和 129 mESC （表 1）上测试了 7 个协议，并使用光显微镜监测了每个组的分化状态。如 图3A所示，在"2天胚胎体形成+6天RA诱导"治疗下，大多数A2lox和129个衍生物（第一阶段协议3）显示堆积良好和中性状形态，这表明NPC的形成。然而，接受"4天胚胎体形成+4天RA诱导"治疗的细胞（第一阶段协议2）显示出不良和凋亡状态，这可能是由于胚胎体内缺乏营养。单层培养与RA诱导（第一阶段协议4和5）相结合，也可以指导 mESC 的分化，而类似中子细胞的比例不如第一阶段协议 3 中的比例。同时，I-protocol 6和7阶段的大多数A2lox和129个衍生物显示细胞体较小，并且倾向于发生凋亡，这表明N2B27介质II不能有效地支持胚胎神经生成。
为了进一步确认NPC的形成，使用免疫荧光检测检测检测了雀巢细胞（NPC的标记）在每个组中的百分比。在 图3B中，第三阶段的Nestin®细胞比例最高，达到77.67±A2lox和129衍生品的4.33%和69.33±2.33%。总的来说，第一阶段协议3最能指导将中小企业的分化为非典型肺炎。
N2B27介质II可以最有效地诱导从NPC到神经元的分化（第二阶段）。审查了第二阶段分化的三项议定书。如 图4A所示，形态学观察显示，第二阶段协议3（与N2B27介质II的分化）中的大多数A2lox和129个衍生物在第18天出现的最长神经元状结构，具有清晰的中和细胞体延伸，表明神经生成的有效发生。免疫荧光检测进一步证实了神经元的生成，在A2lox和D18（图4B）的129个衍生物中，β-Tubulin III+细胞的百分比分别高达67.75±4.01%和58.73±7.25%。
为了更清晰，胚胎神经生成优化方法的示意图显示在 图5中。简言之，1.5 x 106 mESCs 在 10 mL 的基底分化介质 I 中播种到非粘性细菌盘中，并允许胚胎体形成 2 天。然后，胚胎体被收集并植入0.1%的明胶涂层的6井板中，每口井的浓度为50个胚胎体。同时，RA （1 μM） 再添加 6 天。从第 8 天到第 18 天，RA 被移除，N2B27 介质 II 用于将随后从 NPC 分化到神经元。有了这种组合方法，在第18天可以形成强大的神经元。
图1：胚胎神经生成过程图。这个数字已经从李等人修改了10。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：胚胎体的形态。（A） 胚胎体培养4天。（B） 胚胎体培养2天。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：使用A2lox和129 mESC对I阶段分化的7个协议进行效率比较。（A） 第8天对A2lox和129 mESCs衍生工具的形态分析。上面板：A2lox衍生工具;下面板：129个衍生品。（B） 为形成NPC（内斯汀+，绿色）的免疫荧光检测。核被标记为蓝色与DAPI。上面板：D8上的A2lox衍生工具;下面板：D8上的129个衍生工具。通过直方图显示每个组的 Nestin® 细胞百分比。每个列都表示三个独立实验的平均±SEM。*，p≤0.05： *，p≤0.01。 这个数字已经从Li等人修改了，请点击这里查看这个数字的较大版本。
图4：关于第二阶段分化的3个协议的效率比较。（A） 第18天对A2lox和129 mESC衍生工具的形态学分析。上面板：A2lox衍生工具;下面板：129个衍生品。（B） 神经元形成的免疫荧光检测（β-图布林III+，红色）。核被标记为蓝色与DAPI。上面板：D18上的A2lox衍生工具;下面板：D18上的129个衍生品。直方图显示了每组β-图布林III+细胞的百分比。每个列表示三个独立实验的平均± SEM。*，p≤0.05： *，p≤0.01。 这个数字已经从李等人修改了10。请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：体外神经元分化优化方法简介这个数字已经从Lietal.10修改。 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 分化阶段 I （8d） | ||
| 协议 | 媒体 | |
| 协议1 | 自然分化：仅限基底分化介质 | 基础分化介质 I： DMEM/F12 +15%FBS = 1%NEAA=010万 2ME = 1%P/S |
| 协议2 | 4 天胚胎体形成 + 4 天 RA 感应 | |
| 协议3 | 2天胚胎体形成+6天RA感应 | |
| 协议4 | 单层文化与 RA 感应相结合： 4d （-RA） 4d （+RA） | |
| 协议5 | 单层文化与 RA 感应相结合： 2d （-RA） 6d （+RA） | |
| 协议6 | 胚胎体形成 （4 d） 和分化诱导与 N2B27 中等 II | N2B27 介质 II： 49% DMEM/F12 + 1% N2 = 48% 神经基质介质 + 2% B27 +1%胶质MAX+ 0.1m 2ME |
| 协议7 | 单层文化与N2B27中等II | |
表1：第一阶段分化中使用的7个协议的详细信息。 这张桌子已经从李等人的10号修改了。
| 分化阶段二（10d） | ||
| 协议 | 媒体 | |
| 协议1 | 自然分化：仅限基底分化介质 | 基础分化介质 I： DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +010万 2ME = 1%P/S |
| 协议2 | 与N2B27介质I的分化 | N2B27 中等 I： DMEM/F12 + 1%N2 = 2%B27 = 1%胶质MAX +0.1m 2ME |
| 协议3 | 与 N2B27 中等 II 的分化 | N2B27 介质 II： 49% DMEM/F12 + 1% N2 = 48% 神经基质介质 + 2% B27 +1%胶质MAX+ 0.1m 2ME |
表2：第二阶段分化中使用的3个协议的详细信息。 这张桌子已经从李等人的10号修改了。
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Discussion
在本研究中，我们建立了一种简单而有效的神经元分化方法，具有成本低、材料易用等功能。在这种方法中，2天的胚胎体形成，然后是6天的RA诱导，可以有效地促进mESC在NPC中的分化（第一阶段协议3）。对于二期分化，N2B27介质II（II-协议3）最有效地诱导从NPC分化为神经元。为确保成功，应更多地注意几个关键步骤。
首先，胚胎体的健康状态是整个分化过程的关键。三维胚胎体的形成通常用于指导ESC8的分化。在这项研究中，我们调查了胚胎体的适当悬浮培养时间。如 图2所示，在这种条件下，在悬浮培养2天后，形成具有明亮核心的圆形胚胎体。然而，当培养4天，许多胚胎身体粘附在一起，核心变得黑暗，表明细胞在核心的凋亡。随后的分化进一步证实了长期胚胎体形成的更坏影响。在一些报道的研究中，胚胎体的悬浮培养可以持续长达10天，使用低FBS浓度的介质或没有FBS11。研究中胚胎体形成时间的缩短可能是由于 FBS 浓度较高 （15%）这里使用，并已证明15%的FBS可以更好地促进胚胎体的形成和分化。
其次，RA 的应用时间点和 RA 工作集中度对于 mESC 的细胞命运决定至关重要。RA是维生素A的衍生物，是最重要的形态原体之一，具有多发性作用12。RA可以调节多种信号通路，影响ESC13、14的细胞命运决定。报告显示，在早期分化阶段对中东和会的短期治疗可防止自发分化，并维持中东经共体15的自我更新能力。另一些人则认为，RA可以调节生殖细胞分化和神经分化与ESC，这是时间点依赖16，17，18。在此处介绍的条件下，RA在胚胎体形成后的第2天添加，适合将分化引导到NPC中。同时，RA 的工作集中度也至关重要。低RA浓度（约10 nM）可诱发mESC分化成内皮状细胞，而高RA浓度（1-5 μM）更可能诱导分化成NPC 13、14、15、16、17、18、19。由于RA的使用，人们期望有一个审计效果：前脑神经元的分化将很少见，后脑和脊髓命运的神经元将发生20，21。此外，RA 是一种易于获得且成本低廉的代理，使用此协议可以为大多数实验室节省研究资金。
第三，在此处提出的条件下，在第一阶段分化后产生的 NPC 可以在适当的条件下存储和通过。使用干细胞库的高细胞密度冷冻保存（+2 x 106）可以有效地减少冷冻造成的细胞损伤，从而获得较高的恢复率。同时，研究中产生的NPC可以使用N2B27介质（49% DMEM/F12 + 1% N2 + 48% 神经平衡介质 + 2% B27）通过细胞密度超过5×105/cm2。在低细胞密度（小于0.5 x 105/cm2）下，NPC倾向于区分。这种细胞冷冻保存和恢复可以给研究带来极大的便利。
此外，神经基础介质对于二期分化至关重要。神经基质介质专为神经元细胞的长期维护和成熟而设计。如N2B27介质II（表2）所列，神经基质介质的加入可以更好地支持从NPC到神经元的分化。
总的来说，我们报告了一种高效和低成本的神经元分化方法，从体外mESC，使用组合筛选的策略。已建立的方法非常容易实施，适合大多数实验室使用。这种优化的方法可以成为神经生物学和发育生物学研究的有力工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（第31501099号）和中国湖北省教育厅中青年（第31501099号）的支持。Q20191104）。我们感谢武汉科技大学邓文生教授提供小鼠胚胎干细胞系A2lox。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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