Summary
Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.
Abstract
La differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali del topo (mESC) è un potenziale strumento per chiarire i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi e potenzialmente aiutare nella medicina rigenerativa. Qui, abbiamo stabilito un metodo efficiente e a basso costo per la differenziazione neuronale dagli mESC invitro, utilizzando la strategia dello screening combinatorio. Nelle condizioni qui definite, la formazione del corpo embrionale di 2 giorni + il protocollo di induzione dell'acido retinoico di 6 giorni consente una differenziazione rapida ed efficiente dagli MESC alle cellule precursori neurali (NPC), come visto dalla formazione di derivati A2lox e 129 ben impilati e simili a neurite che sono positivi alla Nestin. Lo stato sano dei corpi embrioidi e il momento in cui viene applicato l'acido retinoico (RA), così come le concentrazioni di RA, sono fondamentali nel processo. Nella successiva differenziazione dai NPC ai neuroni, N2B27 medium II (integrato da mezzo neurobasale) potrebbe supportare meglio il mantenimento e la maturazione a lungo termine delle cellule neuronali. Il metodo presentato è altamente efficienza, a basso costo e facile da usare e può essere un potente strumento per la neurobiologia e la ricerca sulla biologia dello sviluppo.
Introduction
Le cellule staminali embrionali (ESC) sono pluripotenti e possono differenziarsi in cellule precursori neurali (NPC) e successivamente in neuroni in determinate condizioni1. La neurogenesi basata su ESC fornisce la migliore piattaforma per imitare la neurogenesi, fungendo così da strumento utile per gli studi di biologia dello sviluppo e potenzialmente aiutare nella medicinarigenerativa 2,3. Negli ultimi decenni, sono state riportate molte strategie per indurre la neurogenesi embrionale, come il metodo transgenico4, utilizzandopiccolemolecole 5,utilizzando un microambiente a matrice 3D6e la tecnica di co-coltura7. Tuttavia, la maggior parte di questi protocolli sono condizioni limitate o difficili da usare, quindi non sono adatti per l'uso nella maggior parte dei laboratori.
Per trovare un metodo facile da usare e a basso costo per ottenere un'efficiente differenziazione neurale dagli MESC, qui è stata utilizzata una strategia di screening combinatorio. Come descritto nella figura 1, l'intero processo di neurogenesi embrionale è stato diviso in 2 fasi. La fase I si riferisce al processo di differenziazione dagli mESC ai PNG, e la fase II si riferisce alla successiva differenziazione dai PNG ai neuroni. Sulla base dei principi di facile funzionamento, basso costo, materiali facilmente disponibili e alta efficienza di differenziazione, sono stati scelti sette protocolli nella fase I e tre protocolli nella fase II in base al tradizionale sistema di coltura monostrato aderente o al sistema di formazione del corpo embrionale8,9. L'efficienza di differenziazione dei protocolli in entrambe le fasi è stata valutata utilizzando l'osservazione della morfologia cellulare e il test di immunofluorescenza. Combinando il protocollo più efficiente di ogni fase, abbiamo stabilito il metodo ottimizzato per la differenziazione neurale dagli mESC.
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Protocol
1. Coltura delle cellule staminali embrionali del topo
- Preparare piatti o piatti di coltura cellulare ricoperti di gelatina 0,1%.
- Aggiungere 2 mL di gelatina sterilizzata allo 0,1% (0,1% w/v in acqua) a piatti di coltura cellulare da 60 mm. Dondolare delicatamente per garantire un rivestimento uniforme delle stoviglie di coltura cellulare.
- Mettere i piatti in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e lasciare il rivestimento per 1 h.
- Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0,1% prima di seminare le cellule.
NOTA: Dopo aver rimosso la gelatina, non è necessario asciugare o lavare i piatti rivestiti.
- Coltura delle cellule staminali embrionali del topo (A2lox e 129)
- Incubare le cellule mESC (A2lox e 129) nell'incubatore di coltura cellulare 0,1% rivestito di gelatina da 60 mm in un mezzo di crescita mESC rispettivamente a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%. Il mezzo di crescita mESC è costituito per l'85% da DMEM/F12, per il 15% da sostituti del siero knock-out (KSR), per 0,1 mM β-mercaptoetanolo (2ME), 2 mM glutaMAX, 1% amminoacido non essenziale (NEAA), 1% penicillina/streptomicina (P/S), 1000 U/mL fattore inibitorio della leucemia (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibitore GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibitore MEK).
ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è infiammabile e presenta tossicità per inalazione. Tenere lontano dalle fonti di fuoco e indossare una maschera per evitare l'inalazione durante l'uso. - Cambia quotidianamente il mezzo di crescita mESC per una migliore crescita di A2lox e 129.
- Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL dello 0,1% di tripside al piatto. Dondolare delicatamente per 30 s per garantire una copertura uniforme della tripside su tutte le cellule.
- Lasciare le celle per circa 1 minuto per tripinaree quindi rimuovere la tripina utilizzando pipetta da 1 mL.
- Aggiungere più volte 2 mL di mezzo di crescita mESC al piatto, pipetta su e giù più volte per effettuare una sospensione a cella singola.
- Contare la densità delle cellule nella sospensione nel modo più accurato possibile usando l'emocitometro.
- Dividere le celle in 7 gruppi e indurre la differenziazione utilizzando protocolli diversi indicati nella tabella 1.
- Incubare le cellule mESC (A2lox e 129) nell'incubatore di coltura cellulare 0,1% rivestito di gelatina da 60 mm in un mezzo di crescita mESC rispettivamente a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%. Il mezzo di crescita mESC è costituito per l'85% da DMEM/F12, per il 15% da sostituti del siero knock-out (KSR), per 0,1 mM β-mercaptoetanolo (2ME), 2 mM glutaMAX, 1% amminoacido non essenziale (NEAA), 1% penicillina/streptomicina (P/S), 1000 U/mL fattore inibitorio della leucemia (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibitore GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibitore MEK).
2. Differenziazione dai MESC ai PNG (fase I)
- Preparare 0,1% piatti di coltura cellulare rivestiti di gelatina o coverlips.
- Prima dell'uso, preparare 0,1% di gelatina rivestita con 6 piastre o coverlips come nel passaggio 1.1.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 1(tabella 1)
- Seme circa 2 x 104 mESC in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo nelle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Controllare la densità cellulare al microscopio.
- Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5% per 6 ore per consentire l'attacco.
- Dopo l'attacco, eserti dalle cellule dall'incubatrice e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS.
- Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I (Tabella 1) a ciascun pozzo e rimettere le cellule nell'incubatrice.
- Lasciare le cellule per la differenziazione per 8 giorni. Sostituire il mezzo di differenziazione basale I ogni 2 giorni.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 2(tabella 1)
- Aggiungere 1,5 x 106 mESC in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I per consentire la formazione del corpo embrionale a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.
- Dopo 2 giorni, trasferire gli aggregati cellulari in tubi di centrifuga da 15 ml e lasciarli depositare per gravità.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione basale fresco I per risospendire i corpi embrioidi. Ripiantarli in un nuovo piatto batterico non adeso e consentire la differenziazione per altri 2 giorni.
- Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio (Figura 2A).
- Raccogliere corpi embrio embrioni come descritto nei passaggi 2.3.2-2.3.3. Semina circa 50 corpi embriobi in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo su piastre a 6 porci ricoperte di gelatina allo 0,1%.
- Preparare 1 mM di materiale RA tutto trans (in DMSO) e conservare lontano dalla luce in un congelatore a -80 °C dopo il sub-imballaggio.
NOTA: RA è instabile e si dovrebbe prestare attenzione a tenerlo lontano dalla luce e ridurre il contatto con l'aria durante la preparazione del materiale RA. - Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM.
- Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e differenziare per altri 4 giorni.
- Cambiare l'intero mezzo di differenziazione basale I (con 1 μM RA) ogni 2 giorni.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 3(tabella 1)
- Piantare 1,5 x 106 mESC in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I. Lasciare per 2 giorni per la formazione del corpo embrionale a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.
- Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio (Figura 2B).
- Trasferire gli aggregati cellulari in tubi di centrifuga da 15 ml e lasciarli depositare per gravità.
- Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione basale fresco I per risospendirli.
- Seminare circa 50 corpi embrioidi in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo su piastre a 6 porci ricoperte di gelatina allo 0,1%.
- Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM.
- Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e differenziare per altri 6 giorni. Cambiare l'intero mezzo di differenziazione basale I (con 1 μM RA) ogni 2 giorni.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 4(tabella 1)
- Seme circa 2 x 104 mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.
- Dopo l'attacco, lavare le celle due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 4 giorni nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C.
- Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA completamente trans in ogni pozzo (la concentrazione di lavoro è di 1 μM) per indurre la differenziazione per altri 4 giorni.
- Nell'intero processo, sostituire l'intero mezzo ogni 2 giorni.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 5(tabella 1)
- Seme circa 2 x 104 mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.
- Lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 2 giorni nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C.
- Per la successiva induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 del 5% a 37 °C per indurre la differenziazione per altri 6 giorni.
- Nell'intero processo, sostituire l'intero mezzo ogni 2 giorni.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 6(tabella 1)
- Piantare 1,5 x 106 mESC in una piastra batterica non adesiva in 10 mL di N2B27 medium II(tabella 1)per consentire la formazione di corpi embrioidi.
- Il 2° giorno, raccogliere gli aggregati cellulari come descritto nei passaggi 2.3.2-2.3.3 e resuspend i corpi embrioidi utilizzando 10 mL di N2B27 medio II fresco.
- Ripiantarli in un nuovo piatto batterico non adeso e consentire la differenziazione per altri 2 giorni nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio.
- Il 4,raccogliere corpi embrionale. Semina circa 50 corpi embriombrioidi per pozzo su piatti a 6 po 'rivestiti di gelatina 0,1% con 2 mL di N2B27 medium II.
- Aggiungere 2 μL di materiale RA completamente trans in ogni pozzo e indurre la differenziazione per altri 4 giorni. Sostituire l'intero mezzo (N2B27 medium II con 1 μM RA) ogni due giorni.
- Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 7(tabella 1)
- Seme circa 2 x 104 mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.
- Lavare le celle due volte con PBS. Quindi, aggiungere 2 mL di N2B27 medium II ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 8 giorni a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.
- Cambiare l'intero N2B27 medium II ogni 2 giorni.
3. Osservazione della morfologia cellulare
- Controllare lo stato di differenziazione dei suddetti 7 gruppi al giorno sotto un microscopio a contrasto di fase invertito.
- Seleziona casualmente almeno 12 campi e scatta foto per registrare i cambiamenti morfologici di ogni gruppo su D8.
4. Colorazione immunofluorescenza
- Preparazione del campione: Semi mESC su coverlips rivestiti di gelatina allo 0,1% e consentire la differenziazione per 8 giorni utilizzando i protocolli menzionati nella fase 2.
- Risciacquo: L'8 ° giorno, prelevare i campioni dall'incubatore e rimuovere il mezzo di differenziazione per aspirazione. Risciacquare delicatamente le cellule una volta con 1 mL di PBS per 5 minuti.
- Fissazione: Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% a ciascun campione e fissare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Risciacquo: Dopo la fissazione, sciacquare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS 3 volte, per 5 minuti ciascuna.
- Permeabilizzazione: Aggiungere 1 mL dello 0,2% di TritonX-100 in PBS a ciascun campione e lasciare per 8 minuti a RT.
- Risciacquo: Dopo la permeabilità, sciacquare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS 3 volte, per 5 minuti ciascuna.
- Blocco: Aggiungere 1 mL di siero di capra al 10% in PBS a ciascun campione e incubare a RT per 1 h per bloccare eventuali interazioni non specifiche.
- Incubazione con anticorpo primario
- Diluire l'anticorpo anti-nestina con un rapporto di 1:100 usando il 5% di siero di capra in PBS.
- Applicare 500 μL di anticorpi diluiti su diversi campioni e incubare durante la notte a 4 °C.
- Risciacquare: Rimuovere l'anticorpo e risciacquare delicatamente i campioni con 1 mL di PBS 3 volte per 8 minuti ciascuno.
- Incubazione con anticorpo secondario
- Diluire l'IgG anti-topo di capra etichettato Alexa Fluor 488 con un rapporto di 1:500 usando il 5% di siero di capra in PBS.
- Applicare 500 μL di anticorpo diluito su diversi campioni e incubare al buio per 2 ore a RT.
NOTA: Dopo aver applicato anticorpi secondari fluorescenti, eseguire tutti i passaggi successivi al buio per evitare la tempra a fluorescenza.
- Risciacquare: Rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare delicatamente i campioni con 1 mL di PBS 3 volte per 8 minuti ciascuno.
- Colorazione e montaggio nucleare
- Posizionare una goccia di supporto di montaggio DAPI sul microslide pulito.
- Eslevare con cura i campioni dalle piastre e posizionare il campione sopra il supporto di montaggio DAPI con la cella a faccia in giù. Lasciare al buio per 5 minuti a RT.
- Rimuovere il mezzo di montaggio DAPI in eccesso con carta assorbente.
- Osservazione della microscopia a fluorescenza
- Posizionare i campioni sotto la microscopia a fluorescenza e rilevare il segnale per DAPI e Alexa Fluor 488 utilizzando filtri adeguati.
- Scegli in modo uniforme e casuale 10-15 campi visivi diversi per ogni campione e registra le immagini con una fotocamera CCD.
5. Differenziazione dai PNG ai neuroni (Fase II)
- Preparare i derivati mESC nell'ambito della differenziazione di fase I utilizzando il protocollo 3 (8giorni, tabella 1 ) come descritto nella fase 2.4, che ha la massima efficienza di differenziazione (cfr. figura 3).
NOTA: Dopo la differenziazione della fase I, il controllo di qualità deve essere effettuato utilizzando l'osservazione della morfologia cellulare e il saggio di immunofluorescenza sopra menzionato, per garantire un NPC sano e ad alto rendimento. - Seme circa 5 x 105 derivati mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 porci rivestite con gelatina allo 0,1%. Dividi casualmente le derivate mESC in 3 gruppi, rispettivamente come protocollo di fase II 1, protocollo 2 e protocollo 3.
- Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore. Lavarli due volte con 2 mL di PBS.
- Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I, N2B27 medio I e N2B27 medio II (tabella 2), rispettivamente, a ciascun pozzo dei gruppi di cui sopra.
- Posizionare le piastre nell'incubatore e lasciare differenziare per altri 10 giorni. Cambiare il mezzo corrispondente ogni 2 giorni.
- Controllare lo stato di differenziazione e registrare i cambiamenti morfologici come menzionato nel passaggio 3.
- Il giorno 18, valutare la generazione di neuroni (β-Tubulina III positivo) e determinare l'efficienza di differenziazione dei 3 protocolli utilizzando nel passaggio 4.
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Representative Results
La formazione del corpo embrionale di 2 giorni + l'induzione ra di 6 giorni funziona meglio per dirigere la differenziazione degli MESC in NPC (Fase I). Per determinare il protocollo ottimale che promuove meglio la differenziazione degli MESC in NPC (fase I), sono stati testati 7 protocolli sia su A2lox che su 129 mESC(tabella 1)e lo stato di differenziazione di ciascun gruppo è stato monitorato utilizzando il microscopio a luce. Come mostrato nella figura 3A, la maggior parte dei derivati A2lox e 129 sotto il trattamento di "formazione del corpo embrionale di 2 giorni + induzione RA di 6 giorni" (protocollo di fase I 3) ha mostrato morfologie ben impilate e simili a neurite, che indicano la formazione di NPC. Tuttavia, le cellule con trattamento di "formazione del corpo embrionale di 4 giorni + induzione RA di 4 giorni" (protocollo di fase I 2) hanno mostrato uno stato povero e apoptotico, che può essere dovuto alla mancanza di nutrienti all'interno dei corpi embrionali. La coltura monostrato combinata con l'induzione RA (phase I-protocol 4 e 5) poteva anche dirigere la differenziazione degli mESC, mentre la proporzione di cellule simili a neurite non era tanto quella nel protocollo di fase I 3. Nel frattempo, la maggior parte dei derivati A2lox e 129 nel protocollo di fase I 6 e 7 mostravano corpi cellulari più piccoli e tendevano a subire l'apoptosi, suggerendo che N2B27 medium II non poteva supportare efficacemente la neurogenesi embrionale.
Per confermare ulteriormente la formazione di NPC, la percentuale di cellule Nestin+ (marcatore per NPC) in ciascun gruppo è stata rilevata utilizzando un saggio di immunofluorescenza. Nella figura 3B, la percentuale di cellule Nestin+ nel protocollo di fase I 3 è stata la più alta e ha raggiunto fino a 77,67 ± 4,33% e 69,33 ± 2,33% rispettivamente in derivati A2lox e 129. Collettivamente, il protocollo di fase I-protocol 3 funziona meglio per indirizzare la differenziazione degli MSES in NPC.
N2B27 medium II può indurre più efficacemente la differenziazione dai PNG ai neuroni (Fase II). Sono stati esaminati tre protocolli nella differenziazione della fase II. Come mostrato nella figura 4A, l'osservazione morfologica ha mostrato che la maggior parte dei derivati A2lox e 129 nel protocollo di fase II 3 (differenziazione con N2B27 medium II) sono apparse le strutture neuronali più prolungate con neuriti chiari ed estensioni del corpo cellulare entro il giorno 18, indicando l'efficienza della neurogenesi. I test di immunofluorescenza hanno ulteriormente confermato la generazione di neuroni, con la percentuale di cellule β-Tubulina III+ fino a 67,75 ± 4,01% e 58,73 ± 7,25%, rispettivamente, in A2lox e 129 derivati su D18 (Figura 4B).
Per renderlo più chiaro, nella figura 5 è mostrato un diagramma schematico del metodo ottimizzato per la neurogenesi embrionale. In breve, 1,5 x 106 mESC vengono seminati in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I e consentono la formazione del corpo embrionale per 2 giorni. Quindi, i corpi embrioidi vengono raccolti e piantati nelle piastre a 6 pozzi rivestite di gelatina allo 0,1% con la concentrazione di 50 corpi embrioidi per pozzo. Nel frattempo, RA (1 μM) viene aggiunto per altri 6 giorni. Dal giorno 8 al giorno 18, RA viene rimosso e N2B27 medium II viene applicato per dirigere la successiva differenziazione dai PNG ai neuroni. Con un tale metodo combinato, i neuroni robusti possono essere formati il giorno 18.
Figura 1: Diagramma del processo di neurogenesi embrionale. Questa cifra è stata modificata da Li etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La morfologia dei corpi embrioidi. (A) Corpi embrioidi coltivati per 4 giorni. (B) Corpi embrionale coltivati per 2 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto dell'efficienza dei 7 protocolli sulla differenziazione di fase I mediante A2lox e 129 mESC. (A) Analisi morfologica dei derivati A2lox e 129 mESC il giorno 8. Pannello superiore: derivati A2lox; Pannello inferiore: 129 derivati. (B) Rilevazione dell'immunofluorescenza per la formazione di NPC (Nestin+, verde). I nuclei erano etichettati blu con DAPI. Pannello superiore: derivati A2lox su D8; Pannello inferiore: 129 derivati su D8. Le percentuali di celle Nestin+ di ogni gruppo sono state mostrate dall'istogramma. Ogni colonna rappresenta la media±SEM di tre esperimenti indipendenti. *, p≤0,05; **, p≤0,01. Questa cifra è stata modificata da Li etal.
Figura 4: Confronto dell'efficienza dei 3 protocolli sulla differenziazione della fase II. (A) Analisi morfologica dei derivati A2lox e 129 mESC il giorno 18. Pannello superiore: derivati A2lox; Pannello inferiore: 129 derivati. (B) Rilevazione dell'immunofluorescenza per la formazione di neuroni (β-tubulina III+, rosso). I nuclei erano etichettati blu con DAPI. Pannello superiore: derivati A2lox su D18; Pannello inferiore: 129 derivati su D18. Percentuali di cellule β-tubulina III+ di ciascun gruppo sono state indicate dall'istogramma. Ogni colonna rappresenta la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. *, p≤0,05; **, p≤0,01. Questa cifra è stata modificata da Li etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Breve modello del metodo ottimizzato per la differenziazione neuronale dai mESC in vitro Questa cifra è stata modificata da Lietal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fase di differenziazione I (8d) | ||
| Protocolli | Media | |
| protocollo n. 1 | Differenziazione naturale: con mezzo di differenziazione basale ho solo | Mezzo di differenziazione basale I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protocollo 2 | Formazione di corpi embrioidi di 4 giorni + induzione RA di 4 giorni | |
| protocollo 3 | Formazione di corpi embrioidi di 2 giorni + induzione RA di 6 giorni | |
| protocollo n. 4 | Coltura monostrato combinata con induzione RA: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protocollo 5 | Coltura monostrato combinata con induzione RA: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| protocollo 6 | Formazione embrionale dei corpi (4 d) e differenziazione indotta con N2B27 medio II | N2B27 medio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Mezzo neurobasale + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
| protocollo n. 7 | Coltura monostrato con N2B27 medium II | |
Tabella 1: Dettagli dei 7 protocolli utilizzati nella differenziazione della fase I. Questa tabella è stata modificata da Li etal.
| Fase di differenziazione II (10d) | ||
| Protocolli | Media | |
| protocollo n. 1 | Differenziazione naturale: con mezzo di differenziazione basale ho solo | Mezzo di differenziazione basale I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protocollo 2 | Differenziazione con N2B27 medium I | N2B27 medio I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0,1 mM 2ME |
| protocollo 3 | Differenziazione con N2B27 medium II | N2B27 medio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Mezzo neurobasale + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
Tabella 2: Dettagli dei 3 protocolli utilizzati nella differenziazione della fase II. Questa tabella è stata modificata da Li etal.
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Discussion
Nel presente studio, abbiamo stabilito un metodo semplice ed efficace per la differenziazione neuronale dagli mESC, con materiali a basso costo e facilmente ostruibili. In questo metodo, 2 giorni di formazione del corpo embrionale seguiti da 6 giorni di induzione ra possono promuovere efficacemente la differenziazione degli MESC in NPC (protocollo di fase I 3). Per la differenziazione di fase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induce più efficacemente la differenziazione dai PNG ai neuroni. Per garantire il successo, si dovrebbe prestare maggiore attenzione a diverse fasi critiche.
In primo luogo, lo stato sano dei corpi embrionale è la chiave per l'intero processo di differenziazione. La formazione tridimensionale del corpo embrionale viene solitamente utilizzata per dirigere la differenziazione degli ESC8. In questo studio, abbiamo studiato il tempo di coltura della sospensione corretto dei corpi embrioidi. Come mostrato nella figura 2, i corpi embriomi rotondi con nuclei luminosi si sono formati dopo la coltura di sospensione per 2 giorni in questa condizione. Tuttavia, quando coltivati per 4 giorni, molti corpi embrionali aderiscono l'uno all'altro e i nuclei diventano scuri, indicando l'apoptosi delle cellule nei nuclei. La successiva differenziazione ha ulteriormente confermato l'effetto peggiore della formazione prolungata del corpo embrionale. In alcuni studi riportati, la coltura di sospensione dei corpi embrioidi potrebbe durare fino a 10 giorni, utilizzando un mezzo con concentrazione FBS inferiore o senza FBS11. Il tempo ridotto per la formazione del corpo embrionale nello studio può essere dovuto alla maggiore concentrazione di FBS (15%) utilizzato qui, ed è stato dimostrato che il 15% di FBS può promuovere meglio la formazione e la differenziazione dei corpi embrioidi.
In secondo luogo, il momento in cui viene applicata ra e la concentrazione di lavoro RA sono fondamentali per la determinazione del destino cellulare degli mESC. RA, un derivato della vitamina A, è uno dei morfogeni più importanti con azioni pleiotropiche12. RA può regolare più vie del segnale e influenzare la determinazione del destino cellulare degli ESC13,14. I rapporti hanno dimostrato che il trattamento a breve termine degli mESC con RA durante la fase iniziale di differenziazione ha impedito la differenziazione spontanea e ha mantenere la capacità di autori ricambio degli mESC15. Altri hanno suggerito che ra potrebbe regolare sia la differenziazione delle cellule germinali che la differenziazione neurale dagli ESC, che sono dipendenti dal puntodi tempo 16,17,18. Nella condizione qui presentata, RA aggiunto il 2 ° giornodopo la formazione del corpo embrionale è appropriato per dirigere la differenziazione in NPC. Nel frattempo, anche la concentrazione di lavoro di RA è fondamentale. Basse concentrazioni di RA (~10 nM) possono indurre la differenziazione degli mESC in cellule simili all'endoderma, mentre alte concentrazioni di RA (1-5 μM) hanno maggiori probabilità di indurre la differenziazione in NPC13,14,15,16,17,18,19. A causa dell'uso di RA, ci si aspetterebbe un effetto di cauddalizzazione; la differenziazione in neuroni cerebrali di fronte sarebbe raramente osservata e i neuroni che producono destini del cervello posteriore e del midollo spinalesi verificherebbero 20,21. Inoltre, RA è un agente facilmente disponibile e a basso costo e l'uso di questo protocollo può risparmiare fondi di ricerca per la maggior parte dei laboratori.
In terzo luogo, nella condizione qui presentata, i PNG generati dopo la differenziazione della fase I possono essere immagazzinati e passaggi in condizioni adeguate. La crioconservazione ad alta densità cellulare (>2 x 106) utilizzando il bancalino a cellule staminali può ridurre efficacemente i danni cellulari causati dal congelamento per ottenere un elevato tasso di recupero. Nel frattempo, i PNG generati nello studio possono essere passaggi utilizzando mezzo N2B27 (49% DMEM/ F12+ 1% N2 + 48% Mezzo neurobasale + 2% B27) con una densità cellulare superiore a 5 x 105/ cm2. Sotto bassa densità cellulare (meno di 0,5 x 105/cm2),i PNG tendono a differenziarsi. Tale crioconservazione e recupero cellulare può portare grande comodità alla ricerca.
Inoltre, il mezzo neurobasale è essenziale per la differenziazione di fase II. Il mezzo neurobasale è progettato specificamente per il mantenimento e la maturazione a lungo termine delle cellule neuronali. Come elencato in N2B27 medium II (Tabella 2), l'aggiunta di mezzo neurobasale potrebbe supportare meglio la differenziazione dai PNG ai neuroni.
Collettivamente, abbiamo segnalato un metodo efficiente e a basso costo per la differenziazione neuronale dai mESC in vitro, utilizzando le strategie di screening combinatorio. Il metodo stabilito è molto facile da implementare ed è adatto per l'uso da parte della maggior parte dei laboratori. Un tale metodo ottimizzato può essere un potente strumento per la neurobiologia e la ricerca sulla biologia dello sviluppo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31501099) e dalla Mezza età e Dai Giovani del Dipartimento dell'Istruzione della Provincia di Hubei, Cina (n. trimestre 20191104). E ringraziamo il professor Wensheng Deng alla Wuhan University of Science and Technology per aver fornito le linee di cellule staminali embrionali del topo A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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