Summary
ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。
Abstract
マウス胚性幹細胞(mESC)の神経分化は、神経新生に関与する重要なメカニズムを解明し、再生医療に役立つ可能性のあるツールです。ここでは、組み合わせスクリーニングの戦略を用いて、 インビトロでのmESCからのニューロン分化のための効率的かつ低コストの方法を確立しました。ここで定義された条件の下で、2日間の胚体形成+6日間のレチノイン酸誘導プロトコルは、ネスチン陽性であるよく積み重ねられ、神経突起のようなA2loxおよび129誘導体の形成によって見られるように、mESCから神経前駆細胞(NPC)への迅速かつ効率的な分化を可能にする。胚体の健全な状態とレチノイン酸(RA)が適用される時点は、RA濃度と同様に、その過程で重要である。NPCからニューロンへのその後の分化において、N2B27培地II(神経基底培地によって補完される)は、神経細胞の長期的な維持および成熟をよりよく支えることができる。提示された方法は、高効率、低コスト、操作が容易であり、神経生物学や発生生物学の研究のための強力なツールとなり得る。
Introduction
胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、神経前駆細胞(NPC)に分化し、その後、特定の条件下でニューロンに分化することができる1。ESCベースの神経新生は、神経新生を模倣するための最良のプラットフォームを提供し、したがって、発生生物学研究のための有用なツールとして機能し、潜在的に再生医療2、3を支援する。過去数十年の間に、トランスジェニック法4のような胚性神経新生を誘導するための多くの戦略が報告されている、小分子5を用いて、3Dマトリックス微小環境6を用いて、および共培養技術7を用いた。しかし、これらのプロトコルのほとんどは、条件が制限されているか、操作が困難であるため、ほとんどの研究室での使用には適していません。
mESCからの効率的な神経分化を達成するために、操作が容易で低コストの方法を見つけるために、ここで組み合わせスクリーニング戦略を使用しました。図1に記載されているように、胚性神経新生の全過程を2相に分けた。フェーズIはmESCからNPCへの分化プロセスを指し、第II相はNPCからニューロンへのその後の分化に関連する。容易な操作、低コスト、容易に利用できる材料および高い分化効率の原則に基づいて、フェーズIの7つのプロトコルおよびフェーズIIの3つのプロトコルは、伝統的な付着単層培養システムまたは胚体形成システム8、9に基づいて選択された。両相におけるプロトコルの分化効率を、細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを用いて評価した。各フェーズの最も効率的なプロトコルを組み合わせることで、mESCからの神経分化のための最適化された方法を確立しました。
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Protocol
1. マウス胚性幹細胞培養
- 0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養皿またはプレートを準備します。
- 滅菌した0.1%のゼラチン(水中0.1%w/v)を60mm細胞培養皿に2mL加えます。細胞培養皿のコーティングを確実にするために、穏やかにロックします。
- 37°Cで5%CO2インキュベーターに皿を入れ、1時間コーティングを行います。
- 細胞を播種する前に0.1%ゼラチン溶液を取り除きます。
注:ゼラチンを取り除いた後、コーティングされた皿を乾燥または洗浄する必要はありません。
- マウス胚性幹細胞(A2loxおよび129)培養
- 0.1%のゼラチン中のインキュベートメベック(A2loxおよび129)細胞は、それぞれ5%CO2インキュベーターで37°CのmESC成長培地で60mmの細胞培養皿をコーティングした。MESC成長培地は、85%ノックアウトDMEM/F12、15%ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM βメルカプトエタノール(2ME)、2 mMグルタマックス、2 mMグルタマックスで構成されています。 1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1000 U/mL白血病阻害因子(LIF)、10 nM CHIR-99021(GSK-3阻害剤)および0.33 nM PD0325901(MEK阻害剤)。
注意:β-メルカプトエタノールは可燃性であり、吸入毒性を有する。火災源から離れ、使用時の吸入を避けるためにマスクを着用してください。 - A2loxおよび129のより良い成長のために毎日mESC成長培地を変更してください。
- 細胞が80%合流に達したら、培地を取り除き、0.1%のトリプシンを1 mL加えます。すべての細胞にトリプシンのカバーを確実にするために30 sのために穏やかに揺れる。
- トリプシンを化し、1 mLピペットを使用してトリプシンを除去するために約1分間細胞を残します。
- 2 mLのmESC成長培地を皿に加え、ピペットを数回上下に加えて、単一の細胞懸濁液を作ります。
- ヘモサイトメーターを使用して、懸濁液中の細胞の密度をできるだけ正確にカウントします。
- セルを7つのグループに分け、 表1に示す異なるプロトコルを使用して分化を誘導する。
- 0.1%のゼラチン中のインキュベートメベック(A2loxおよび129)細胞は、それぞれ5%CO2インキュベーターで37°CのmESC成長培地で60mmの細胞培養皿をコーティングした。MESC成長培地は、85%ノックアウトDMEM/F12、15%ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM βメルカプトエタノール(2ME)、2 mMグルタマックス、2 mMグルタマックスで構成されています。 1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1000 U/mL白血病阻害因子(LIF)、10 nM CHIR-99021(GSK-3阻害剤)および0.33 nM PD0325901(MEK阻害剤)。
2. mESC から NPC への分化 (フェーズ I)
- 0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養プレートまたはカバーリップを調製します。
- 使用前に、ステップ1.1のように0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートまたはカバーリップを調製します。
- プロトコル 1 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- 0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートの1ウェルあたり2 mLの基底分化培地Iで約2 x 104 mESCsをシード。顕微鏡で細胞密度を確認します。
- 5%CO2インキュベーターで37°Cの細胞を6時間インキュベーターでインキュベートし、取り付けができるようにします。
- 付着後、培養器から細胞を取り出し、2mLのPBSで細胞を2回洗浄する。
- 各ウェルに2mLの基底分化培地I(表1)を加え、細胞をインキュベーターに戻します。
- 8日間分化のために細胞を残します。2日ごとに基礎分化培地Iを交換してください。
- プロトコル 2 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- 1.5 x 106 mESCsを10 mLの基底分化培地Iの非粘着性細菌皿に加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで胚体形成を可能にする。
- 2日後、細胞凝集体を15 mL遠心管に移し、重力で落ち着かせる。
- 上清を取り除き、10mLの新鮮な基底分化培地Iを加え、胚体を再懸濁させる。新しい非粘着性細菌皿にそれらを植え替え、さらに2日間分化を可能にする。
- 顕微鏡下での胚体の形成を確認する(図2A)。
- ステップ 2.3.2-2.3.3 で説明されているように、胚体を収集します。2 mLの基底分化培地で約50個の胚体を0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートに播種する。
- 1 mMオールトランスRAストック(DMSO)を準備し、サブパッケージング後に-80°Cの冷凍庫で光から離れて保管します。
注意:RAは不安定であり、RAストックの準備中に光から遠ざけ、空気接触を減らすことに注意する必要があります。 - RA誘導の場合は、各ウェルに2μLのRAストックを加えて、1μMの最終濃度を作ります。
- プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに4日間分化します。
- 2日ごとに、基底分化培地I(1μM RA)全体を2 mL変更します。
- プロトコル 3 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- 10 mLの基底分化培地I.の非粘着性細菌皿に1.5 x 106 mESCsを植え付け、5%CO2インキュベーターで37°Cで胚体形成のために2日間放置します。
- 顕微鏡下での胚体の形成を確認する(図2B)。
- 細胞凝集体を15 mL遠心管に移し、重力で落ち着かせる。
- 上清を慎重に取り出し、10mLの新鮮な基底分化培地を加え、再中断します。
- 約50個の胚体を2mLの基底分化培地に播種し、0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレート上に十分に塗布した。
- RA誘導の場合は、各ウェルに2μLのRAストックを加えて、1μMの最終濃度を作ります。
- プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに6日間分化します。2日ごとに基礎分化培地I(1μM RA)全体を変更します。
- プロトコル 4 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- シード約 2 x 104 mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。
- 取り付け後、2 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに2mLの基底分化培地Iを加え、37°Cの5%CO2インキュベーターで4日間分化を可能にする。
- RA誘導の場合、2μLの全トランスRAストックを各ウェル(作業濃度は1μM)に加えて、さらに4日間分化を誘導します。
- 全体のプロセスでは、2日ごとに媒体全体を交換してください。
- プロトコル 5 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- シード約 2 x 104 mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。
- 2 mLのPBSで細胞を2回洗います。各ウェルに2mLの基底分化培地Iを加え、37°Cの5%CO2インキュベーターで2日間分化を可能にする。
- その後のRA誘導では、各ウェルに2μLのRAストックを加えて1μMの最終濃度を作り、プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに6日間分化を誘発します。
- 全体のプロセスでは、2日ごとに媒体全体を交換してください。
- プロトコル 6 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- N2B27培地IIの10mLに非粘着性細菌皿に1.5 x 10 6 mESCsを植物1.5 x 106 mESC(表1)胚体形成を可能にする。
- 2日目 に、ステップ2.3.2-2.3.3に記載されているように細胞凝集体を収集し、新鮮なN2B27培地IIの10 mLを使用して胚体を再中断する。
- それらを新しい非粘着性の細菌皿に再植え、37°Cの5%CO2インキュベーターでさらに2日間分化を可能にする。 顕微鏡下で胚体の形成を確認してください。
- 4日目 に、胚の体を収集します。種子は、N2B27培地IIの2 mLで0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレート上にウェルあたり約50胚体。
- 各ウェルに2μLの全トランスRAストックを加え、さらに4日間分化を誘導します。2日ごとに媒体全体(N2B27培地IIを1μM RA)に交換してください。
- プロトコル 7 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
- シード約 2 x 104 mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。
- PBSで細胞を2回洗います。次いで、各ウェルに2mLのN2B27培地IIを加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで8日間分化を可能にする。
- N2B27培地II全体を2日ごとに変更します。
3. 細胞形態観察
- 反転位相コントラスト光顕微鏡下で、上記7群の分化状況を毎日確認する。
- ランダムに少なくとも12のフィールドを選択し、D8上の各グループの形態変化を記録するために写真を撮ります。
4. 免疫蛍光染色
- サンプル調製:0.1%ゼラチンコーティングカバーリップにmESCsをシードし、ステップ2で述べたプロトコルを使用して8日間分化を可能にします。
- すいす:8日目 に、培養器からサンプルを取り出し、吸引によって分化培地を取り除きます。1 mLのPBSで細胞を5分間穏やかにすすいだ。
- 固定:各サンプルに4%パラホルムアルデヒドの1 mLを加え、室温(RT)で20分間細胞を固定します。
- すすい: 固定後、1 mLのPBSで細胞を3回、それぞれ5分間静かにすすいだ。
- 透過:各サンプルにPBSに0.2%TritonX-100の1 mLを加え、RTで8分間放置します。
- すすい: 透過後、1 mLのPBSで細胞を3回、それぞれ5分間静かにすすいだ。
- ブロッキング:各サンプルにPBSに10%のヤギ血清1mLを加え、RTで1時間インキュベートして非特異的な相互作用を遮断します。
- 一次抗体によるインキュベーション
- PBSで5%のヤギ血清を使用して、抗ネスチン抗体を1:100の比率で希釈します。
- 希釈した抗体を500μL異なるサンプルに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。
- すいす: 抗体を取り除き、1 mLのPBSを3回ずつ8分間静かにすすいます。
- 二次抗体によるインキュベーション
- PBSで5%のヤギ血清を使用して1:500の比率でアレクサフルオール488標識ヤギ抗マウスIgGを希釈します。
- 希釈した抗体を500 μL異なるサンプルに塗布し、RTで2時間暗くインキュベートします。
注:蛍光二次抗体を適用した後、暗闇の中ですべての後続のステップを実行して、蛍光消光を防ぎます。
- すいす: 二次抗体を取り出し、1 mLのPBSをそれぞれ8分間3回静かにすすいます。
- 核染色および実装
- DAPI取り付け媒体を1滴ずつクリーンなマイクロスライドに置きます。
- プレートからサンプルを慎重に取り出し、セルを下にしてDAPI取り付け媒体の上にサンプルを置きます。RTで5分間暗闇の中に置いておきます。
- 吸収性紙で余分なDAPI取り付け媒体を取り除きます。
- 蛍光顕微鏡観察
- 蛍光顕微鏡下に標本を置き、適切なフィルターを使用してDAPIおよびAlexa Fluor 488の信号を検出します。
- 各サンプルに対して 10 ~ 15 種類の異なるビジュアル フィールドを均等に選択し、CCD カメラで画像を記録します。
5. NPCからニューロンへの分化(第II相)
- 最も高い分化効率を持つステップ2.4で詳述されているように、プロトコル3(8日間、 表1)を使用してフェーズIの分化の下でmESC誘導体を準備する( 図3を参照)。
注:フェーズIの分化後、健康で高収率のNPCを確保するために、上記の細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを使用して品質管理を行う必要があります。 - 種子約5 x 105 mESC誘導体を、0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレート上に十分に当たり基礎分化培地Iの2 mL以内に含む。mESC誘導体を、それぞれフェーズIIプロトコル1、プロトコル2、プロトコル3として3つのグループにランダムに分割する。
- プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。2 mLのPBSで2回洗います。
- 2 mLの基底分化培地I,N2B27培地I及びN2B27培地II(表2)をそれぞれ、上記群の各ウェルに加える。
- プレートをインキュベーターに入れ、さらに10日間分化します。対応する媒体を2日ごとに変更します。
- 分化の状態を確認し、手順 3 で述べたように形態学的変化を記録します。
- 18日目に、ニューロンの生成(β-tubulin III陽性)を評価し、ステップ4で使用する3つのプロトコルの分化効率を決定する。
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Representative Results
2日間の胚体形成+ 6日間のRA誘導は、MESCのNPCへの分化(フェーズI)を導くのに最適です。MESCsのNPCへの分化を最も促進する最適なプロトコル(フェーズI)を決定するために、A2loxと129 mESCsの両方で7つのプロトコルをテストし、各群の分化状況を光顕微鏡で監視した。 図3Aに示すように、ほとんどのA2loxおよび129誘導体は「2日間の胚体形成+6日間のRA誘導」処置(フェーズI-プロトコル3)の下で、よく積み重ねられた、そして神経突起様の形態を示し、NPCの形成を示した。しかし、「4日間の胚体形成+4日間のRA誘導」処置(第I-プロトコル2)を有する細胞は、不良およびアポトーシス状態を示し、これは胚体内の栄養不足に起因する可能性がある。単層培養はRA誘導(フェーズI-プロトコル4および5)と組み合わせることで、mESCの分化を指示することもできるが、神経突起様細胞の割合はフェーズI-プロトコル3ほどではなかった。一方、フェーズI-プロトコル6および7のほとんどのA2loxおよび129誘導体は、より小さな細胞体を示し、アポトーシスを受ける傾向があり、N2B27培地IIは胚性神経新生を効果的にサポートできないと示唆した。
さらにNPCの形成を確認するために、各群のNestin+細胞(NPCのマーカー)の割合を免疫蛍光アッセイを用いて検出した。 図3Bでは、フェーズI-プロトコル3のNestin+細胞の割合が最も高く、A2loxおよび129誘導体の±4.33%と69.33%±最大77.67に達した。全体として、フェーズ I プロトコル 3 は、MESC の NPC への差別化を指示する上で最も効果的です。
N2B27培地IIは、NPCからニューロンへの分化を最も効果的に誘導することができる(フェーズII)。フェーズIIの分化における3つのプロトコルを検討した。図4Aに示すように、形態学的観察は、第II相プロトコル3におけるほとんどのA2loxおよび129誘導体(N2B27培地IIによる分化)が、18日目までに明確な神経突起および細胞体拡張を有する最も長期のニューロン様構造を現し、神経新生の効率的な発生を示した。免疫蛍光アッセイはニューロンの生成をさらに確認し、β-Tubulin III+細胞の割合は、それぞれ67.75±4.01%および58.73±、A2loxおよび129誘導体でD18上で(図4B)。
より明確にするために、胚性神経新生に対する最適化された方法の概略図を 図5に示す。簡単に言えば、1.5 x 106 mESCsは、10 mLの基底分化培地Iの非粘着性細菌皿に播種され、2日間胚体形成を可能にする。次いで、胚体を収集し、0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに植え、ウェルあたり50個の胚体を濃度とする。一方、RA(1 μM)はさらに6日間添加されます。8日目から18日目まで、RAが除去され、N2B27培地IIが適用され、NPCからニューロンへのその後の分化を指示する。このような組み合わせ方法により、堅牢なニューロンは18日目に形成することができます。
図1:胚性神経新生プロセスの図。この図はLiら10から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胚体の形態(A)胚体を4日間培養した。(B) 2日間培養した胚体。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: A2lox と 129 mESCs を使用したフェーズ I の分化における 7 つのプロトコルの効率比較(A) 8日目のA2loxおよび129 mESCs誘導体の形態学的解析。上部パネル:A2lox誘導体;下部パネル: 129誘導体.(B) NPCの形成に対する蛍光免疫検出(ネスチン+、グリーン)核をDAPIで青色に標識した。上部パネル: D8上のA2lox誘導体;下部パネル: D8上の129の誘導体。各グループのNestin+細胞の割合はヒストグラムで示された。各列は、3つの独立した実験±平均SEMを表す。*, p≤0.05;**、p≤0.01.この図はLiら10.から変更されています。
図4:フェーズIIの分化における3つのプロトコルの効率比較。(A) 18日目のA2loxおよび129 mESCs誘導体の形態学的解析上部パネル:A2lox誘導体;下部パネル: 129誘導体.(B) ニューロンの形成に対する蛍光免疫検出 (β-tubulin III+, 赤色).核をDAPIで青色に標識した。上部パネル:D18上のA2lox誘導体;下部パネル: D18上の129誘導体。各群のβ-チューブリンIII+細胞の割合はヒストグラムで示した。各 列 は、3つの独立した実験の平均±SEMを表す。*, p≤0.05; **、p≤0.01.この図はLiら10から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:インビトロでのmESCからの神経細胞分化に最適化された方法の簡単なモデルこの図は、Liet al.10から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 分化フェーズI(8d) | ||
| プロトコル | メディア | |
| プロトコル 1 | 自然分化:基礎分化培地のみ | 基礎分化培地 I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| プロトコル 2 | 4日間の胚体形成+ 4日間のRA誘導 | |
| プロトコル 3 | 2日間の胚体形成+ 6日間のRA誘導 | |
| プロトコル 4 | RA誘導と組み合わせた単層培養:4d(-RA)4d(+RA) | |
| プロトコル 5 | RA誘導と結合した単層培養: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| プロトコル 6 | N2B27培地IIで誘発される胚体形成(4d)と分化 | N2B27培地II:49%DMEM/F12+ 1%N2 + 48% 神経基底培地 + 2% B27 +1%グルタマックス+ 0.1mM 2ME |
| プロトコル 7 | N2B27培地IIを用いた単層培養 | |
表1:フェーズIの差別化で使用される7つのプロトコルの詳細。 このテーブルは Li ら10から変更されました。
| 分化フェーズII(10d) | ||
| プロトコル | メディア | |
| プロトコル 1 | 自然分化:基礎分化培地のみ | 基底分化媒体 I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| プロトコル 2 | N2B27培地Iによる分化 | N2B27培地 I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%グルタマックス +0.1mM 2ME |
| プロトコル 3 | N2B27培地IIによる分化 | N2B27培地II:49%DMEM/F12+ 1%N2 + 48% 神経基底培地 + 2% B27 +1%グルタマックス+ 0.1mM 2ME |
表2: フェーズIIの分化で使用される3つのプロトコルの詳細 このテーブルは Li ら10から変更されました。
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Discussion
本研究では、低コストで容易に得られる物質を用いて、mESCからの神経細胞分化の簡便かつ効果的な方法を確立した。この方法では、2日間の胚体形成後に6日間のRA誘導が行われ、MESCsのNPCへの分化を効果的に促進することができる(フェーズI-プロトコル3)。第II相分化のために、N2B27培地II(フェーズII-プロトコル3)は、NPCからニューロンへの分化を最も効果的に誘導する。成功を確実にするためには、いくつかの重要なステップにもっと注意を払う必要があります。
第一に、胚体の健全な状態は、全分化プロセスの鍵である。三次元胚体形成は、通常、ESC8の分化を指示するために使用される。本研究では、胚体の適切な懸濁培養時間を調べた。 図2に示すように、この状態で2日間の懸濁培養後に明るいコアを有する円形胚体が形成された。しかし、4日間培養すると、多くの胚体が互いに付着し、かつコアが暗くなり、コア中の細胞のアポトーシスを示す。その後の分化により、長期の胚体形成の悪化効果がさらに確認された。いくつかの報告された研究では、胚体の懸濁培養は、FBS濃度が低い培地を使用するか、FBS11なしで、10日間持続する可能性がある。研究における胚性身体形成の時間の短縮は、FBS濃度が高いためである可能性がある(15%)ここで使用され、15%FBSがより良い胚体の形成および分化を促進することができることが証明されている。
第二に、RAが適用される時点とRAの働き濃度は、mESCの細胞運命決定にとって重要である。ビタミンAの誘導体であるRAは、多雄性作用12を有する最も重要なモルフォゲンの1つである。RAは、複数のシグナル経路を調節し、ESC13,14の細胞運命決定に影響を与える。初期分化段階でRAを用いたmESCの短期治療は、自発的分化を妨げ、mESCs15の自己再生能力を維持することを示した。他の人は、RAが、時間ポイント依存性16、17、18であるESCからの生殖細胞分化と神経分化の両方を調節できることを示唆した。ここで提示した条件では、胚体形成後2日目に添加したRAは、NPCへの分化を導くのに適している。一方、RAの働き濃度も重要です。低いRA濃度(〜10nM)は、内胚葉様細胞へのmESCの分化を誘導し、一方、高いRA濃度(1〜5μM)は、NPC13、14、15、16、17、18、19に分化を誘導する可能性が高い。RAの使用により、1つは、コード化効果を期待するだろう。前脳ニューロンへの分化はめったに見られないだろうし、後脳と脊髄の運命のニューロンを生み出す20,21.さらに、RAは簡単に入手でき、低コストのエージェントであり、このプロトコルを使用すると、ほとんどの研究室の研究資金を節約することができます。
第三に、ここで提示される条件では、第1相分化後に生成されたNPCを適切な条件で保存し、通過させることができる。幹細胞バンカーを使用して高い細胞密度(>2 x 106)で凍結保存すると、凍結によって引き起こされる細胞損傷を効果的に減少させ、高い回収率を得ることができます。一方、研究で生成されたNPCは、N2B27培地(49%DMEM/F12+1%N2+48%神経基底培地+2%B27)を用いて、5 x 105/cm2以上の細胞密度で継代することができる。低いセル密度(0.5 x 105/cm2未満)では、NPCは差別化を起こしやすい。このような細胞凍結保存と回復は、研究に大きな利便性をもたらすことができます。
さらに、神経基底培地は、第II相分化に不可欠である。神経基底培地は、神経細胞の長期維持および成熟のために特別に設計されている。N2B27培地II(表2)に記載されているように、ニューロ基底培地の添加は、NPCからニューロンへの分化をより良くサポートすることができる。
全体として、組み合わせスクリーニングの戦略を用いて、インビトロでのmESCからのニューロン分化のための効率的かつ低コストの方法を報告した。確立された方法は、実装が非常に簡単であり、ほとんどの研究室での使用に適しています。このような最適化された方法は、神経生物学や発生生物学の研究のための強力なツールとなり得る。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(No. 31501099)と中国湖北省教育部の中高年と若者(No.Q20191104)。そして、武漢科学技術大学のウェンシェン・デン教授が、マウス胚性幹細胞株A2loxを提供してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
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