Summary
Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.
Abstract
Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC' ler) nöral farklılaşması, nörogenezde yer alan temel mekanizmaların aydınlatıcı ve rejeneratif tıbba potansiyel olarak yardımcı olan potansiyel bir araçtır. Burada, kombinatoryal tarama stratejisinikullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem oluşturduk. Burada tanımlanan koşullar altında, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük retinoik asit indüksiyon protokolü, Nestin pozitif olan iyi istiflenmiş ve neurit benzeri A2lox ve 129 türevin oluşumunda görüldüğü gibi, MESC'lerden sinirsel öncül hücrelere (NPC' ler) hızlı ve verimli bir şekilde farklılaşmaya izin sağlar. Embriyoid cisimlerin sağlıklı durumu ve retinoik asidin (RA) uygulandığı zaman noktası ve RA konsantrasyonları bu süreçte kritik öneme sahiptir. Daha sonraki NPC'lerden nöronlara farklılaşmada, N2B27 orta II (Nörobakal ortam tarafından desteklenmiştir) nöronal hücrelerin uzun süreli bakımını ve olgunlaşmasını daha iyi destekleyebilir. Sunulan yöntem yüksek verimlilik, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır ve nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.
Introduction
Embriyonik kök hücreler (ESC' ler) pluripotenttir ve nöral öncül hücrelere (NPC' ler) ve daha sonra belirli koşullar altında nöronlara farklılaşabilir1. ESC tabanlı nörogenez, nörogenez taklit etmek için en iyi platformu sağlar, böylece gelişimsel biyoloji çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet eder ve rejeneratif tıpta potansiyel olarak yardımcıolunur 2,3. Son on yıllarda, transgenik yöntem 4 , küçük moleküller5,3Dmatris mikroçevrimi 6 ve ortak kültür tekniği7gibi embriyoniknörogenez indüklenmesi için birçok strateji bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu koşul sınırlı veya kullanımı zordur, bu nedenle çoğu laboratuvarda kullanım için uygun değildir.
MESC'lerden verimli nöral farklılaşma elde etmek için kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir yöntem bulmak için burada bir kombinatoryal tarama stratejisi kullanılmıştır. Şekil 1'deaçıklandığı gibi embriyonik nörogenezin tüm süreci 2 faza ayrılmıştır. Aşama I, MESC'lerden NPC'lere farklılaşma sürecini ifade eder ve faz II, NPC'lerden nöronlara sonraki farklılaşma ile ilgilidir. Kolay kullanım, düşük maliyetli, kolay kullanılabilen malzemeler ve yüksek farklılaşma verimliliği ilkelerine dayanarak, Geleneksel yapışık monolayer kültür sistemine veya embriyoid vücut oluşum sistemine göre Faz I'de yedi protokol ve Faz II'de üç protokol seçilmiştir8,9. Her iki fazda da protokollerin farklılaşma verimliliği hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlilleri kullanılarak değerlendirildi. Her aşamanın en verimli protokolünü birleştirerek, mESC'lerden nöral farklılaşma için optimize edilmiş yöntemi oluşturduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fare embriyonik kök hücre kültürü
- % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü yemekleri veya tabakları hazırlayın.
- 60 mm hücre kültürü yemeklerine 2 mL sterilize edilmiş %0,1 jelatin (suda %0,1 w/v) ekleyin. Hücre kültürü yemeklerinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.
- Bulaşıkları 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre koyun ve 1 saat boyunca kaplamaya izin verin.
- Hücreleri tohumlamadan önce% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın.
NOT: Jelatin çıkarıldıktan sonra, kaplanmış bulaşıkları kurutmaya veya yıkamaya gerek yoktur.
- Fare embriyonik kök hücreleri (A2lox ve 129) kültürü
- %0,1 jelatin kaplı 60 mm hücre kültürü yemeklerindeki mESC hücrelerini sırasıyla %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın. mESC büyüme ortamı% 85 nakavt DMEM / F12, 15% Nakavt serum replasmanı (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, %1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA), %1 penisilin/streptomisiyan (P/S), 1000 U/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 inhibitörü) ve 0,33 nM PD0325901 (MEK inhibitörü).
DİkKAT: β-mercaptoethanol yanıcıdır ve soluma toksisitesi vardır. Yangın kaynaklarından uzak durun ve kullanırken teneffüsten kaçınmak için maske takın. - A2lox ve 129'un daha iyi büyümesi için mESC büyüme ortamını günlük olarak değiştirin.
- Hücreler% 80 izdihama ulaştığında, ortamı çıkarın ve yemeğe% 0.1 tripsin 1 mL ekleyin. Tüm hücrelerde tripin kapağını bile sağlamak için 30 sn hafifçe sallayın.
- Trypsinize için hücreleri yaklaşık 1 dakika bekletin ve ardından 1 mL pipet kullanarak tripsin çıkarın.
- Yemeğe 2 mL mL mESC büyüme ortamı ekleyin, tek bir hücre süspansiyonu yapmak için birkaç kez pipet yukarı ve aşağı.
- Hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu mümkün olduğunca doğru bir şekilde sayın.
- Hücreleri 7 gruba ayırın ve Tablo 1'degösterilen farklı protokolleri kullanarak farklılaşmaya neden olan.
- %0,1 jelatin kaplı 60 mm hücre kültürü yemeklerindeki mESC hücrelerini sırasıyla %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın. mESC büyüme ortamı% 85 nakavt DMEM / F12, 15% Nakavt serum replasmanı (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, %1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA), %1 penisilin/streptomisiyan (P/S), 1000 U/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 inhibitörü) ve 0,33 nM PD0325901 (MEK inhibitörü).
2. MESC'lerden NPC'lere farklılaşma (Aşama I)
- % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü plakaları veya kapak örtüleri hazırlayın.
- Kullanmadan önce, adım 1.1'deki gibi% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları veya kapaklar hazırlayın.
- Protokol 1 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
- %0,1 jelatin kaplı 6 kuyulu plakalarda kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 2 x 104 mESC tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin.
- Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 6 saat boyunca inkübatöre sokun.
- Bağlanmadan sonra, inkübatörden hücreleri çıkar ve hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I (Tablo 1) ekleyin ve hücreleri tekrar inkübatöre koyun.
- Hücreleri 8 gün boyunca farklılaşma için bırakın. Bazal farklılaşma ortamı I'yi her 2 günde bir değiştirin.
- Protokol 2 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
- %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına 1,5 x 106 mESC ekleyin.
- 2 gün sonra, hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerini bırakın.
- Süpernatant çıkarın ve embriyoid vücutları yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin. Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 2 gün daha farklılaşmaya izin verin.
- Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2A).
- Embriyoid cisimleri 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. %0,1 jelatin kaplı 6 kuyu plakası üzerine kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 50 embriyoid cisim tohum.
- 1 mM all-trans RA stoğu hazırlayın (DMSO'da) ve alt ambalajdan sonra -80 °C dondurucuda ışıktan uzak saklayın.
NOT: RA kararsızdır ve RA stoğunun hazırlanması sırasında ışıktan uzak tutmaya ve hava temasını azaltmaya dikkat edilmelidir. - RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.
- Plakayı 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 4 gün daha ayırt edin.
- 2 mL bazal farklılaşma ortamı I'nin tamamını (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.
- Protokol 3 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
- Bitki 1.5 x10 6 mESC'yi 10 mL bazal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan bir bakteri kabına yerleştirin I. %5 CO 2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumu için2 gün bekletin.
- Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2B).
- Hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin.
- Süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin.
- Yaklaşık 50 embriyoid cisimini% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamına tohumlayın.
- RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.
- Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 6 gün daha ayırt edin. Tüm bazal farklılaşma ortamı I'yi (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.
- Protokol 4 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
- Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.
- Bağlanmadan sonra, hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde4 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
- RA indüksiyonu için, 4 gün daha farklılaşmayı teşvik etmek için her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin (çalışma konsantrasyonu 1 μM'dir).
- Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.
- Protokol 5 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
- Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.
- Hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde2 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
- Sonraki RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya2 μL RA stoğu ekleyin.
- Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.
- Protokol 6 (Tablo 1) kullanılarak Aşama I farklılaşması
- Embriyoid cisimlerin oluşumuna izin vermek için10 mL N2B27 orta II 'de (Tablo 1) yapışkan olmayan bir bakteri kabına1,5 x 10 6mESC yerleştirin.
- 2. günde, 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre agregalarını toplayın ve 10 mL taze N2B27 orta II kullanarak embriyoid gövdeleri yeniden uygulayın.
- Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 37 °C'deki% 5 CO 2 inkübatörde2 gün daha farklılaşmaya izin verin. Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin.
- 4. günde embriyoid vücutları toplayın. 2 mL N2B27 orta II ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine kuyu başına yaklaşık 50 embriyoid gövdesi tohumlayın.
- Her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin ve 4 gün daha farklılaşmaya neden olan. Her iki günde bir tüm ortamı (N2B27 orta II, 1 μM RA ile) değiştirin.
- Protokol 7 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
- Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.
- Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, her kuyuya 2 mL N2B27 orta II ekleyin ve% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
- N2B27 orta II'nin tamamını her 2 günde bir değiştirin.
3. Hücre morfolojisi gözlemi
- Ters faz kontrastı ışık mikroskobu altında yukarıda belirtilen 7 grubun günlük farklılaşma durumunu kontrol edin.
- En az 12 alanı rastgele seçin ve her grubun morfolojik değişikliklerini D8'e kaydetmek için fotoğraf çekin.
4. İmmünofluoresans boyama
- Örnek hazırlama: %0,1 jelatin kaplı kapaklarda tohum mESC'leri ve adım 2'de belirtilen protokolleri kullanarak 8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
- Durulama:8. günde, örnekleri inkübatörden çıkarın ve ayırma ortamını aspirasyonla çıkarın. Hücreleri 1 mL PBS ile bir kez 5 dakika boyunca hafifçe durulayın.
- Fiksasyon: Her numuneye 1 mL%4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika sabitleyin.
- Durulama: Sabitlemeden sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
- Permeabilizasyon: Pbs'de %0,2 TritonX-100'ün 1 mL'sini her örneğe ekleyin ve RT'de 8 dakika bekletin.
- Durulama: Permeabilizasyondan sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
- Engelleme: Her örneğe PBS'de %10 keçi serumunun 1 mL'sini ekleyin ve spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Primer antikor ile inkübasyon
- PBS'de %5 keçi serumu kullanarak anti-Nestin antikoru 1:100 oranında seyreltin.
- Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Durulama: Antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
- sekonder antikor ile inkübasyon
- PBS'de %5 keçi serumu kullanarak Alexa Fluor 488 etiketli keçi fare önleyici IgG'yi 1:500 oranında seyreltin.
- Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve RT'de 2 saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
NOT: Floresan sekonder antikor uyguladıktan sonra, floresan söndürmeyi önlemek için karanlıkta sonraki tüm adımları uygulayın.
- Durulama: İkincil antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
- Nükleer boyama ve montaj
- Temiz mikroslide üzerine bir damla DAPI montaj ortamı yerleştirin.
- Plakalardan numuneleri dikkatlice alın ve numuneyi hücre yüzü aşağı bakacak şekilde DAPI montaj ortamının üzerine yerleştirin. RT'de 5 dakika karanlıkta bırakın.
- Fazla DAPI montaj ortamını emici kağıtla çıkarın.
- Floresan mikroskopi gözlemi
- Numuneleri floresan mikroskopinin altına yerleştirin ve uygun filtreler kullanarak DAPI ve Alexa Fluor 488 sinyalini algılayın.
- Her örnek için eşit ve rastgele 10-15 farklı görsel alan seçin ve görüntüleri bir CCD kamera ile kaydedin.
5. NPC'lerden nöronlara farklılaşma (Faz II)
- MESC türevlerini, en yüksek farklılaşma verimliliğine sahip adım 2.4'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi protokol 3 (8 gün, Tablo 1)kullanarak Faz I farklılaşması altında hazırlayın (Bkz. Şekil 3).
NOT: Faz I farklılaşmasından sonra, sağlıklı ve yüksek verimli bir NPC sağlamak için yukarıda belirtilen hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlil kullanılarak kalite kontrolü yapılmalıdır. - Tohum yaklaşık 5 x10 5 mESC türevleri 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. mESC türevlerini sırasıyla Aşama II protokol 1, protokol 2 ve protokol 3 olarak rastgele 3 gruba ayırın.
- Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin. 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Yukarıdaki grupların her kuyusuna sırasıyla 2 mL bazal farklılaşma ortamı I, N2B27 orta I veN2B27orta II ( Tablo 2 ) ekleyin.
- Plakaları inkübatöre yerleştirin ve 10 gün daha ayırt etmeye bırakın. İlgili ortamı her 2 günde bir değiştirin.
- Farklılaşma durumunu denetleyin ve 3.
- 18. günde, nöronların neslini değerlendirin (β-Tubulin III pozitif) ve 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere (Faz I) yönlendirmede en iyi şekilde çalışır. MESC'lerin NPC'lere (Aşama I) farklılaştırılmasını en iyi şekilde destekleyen en uygun protokolü belirlemek için, hem A2lox hem de 129 mESC 'de(Tablo 1)7 protokol test edildi ve her grubun farklılaşma durumu ışık mikroskobu kullanılarak izlendi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi , "2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu" tedavisi (Faz I-protokolü 3) altında çoğu A2lox ve 129 türevi, NPC'lerin oluşumunu gösteren iyi yığılmış ve neurit benzeri morfolojiler göstermiştir. Bununla birlikte, "4 günlük embriyoid vücut oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu" tedavisi (Faz I-protokolü 2) olan hücreler, embriyoid cisimlerde besin eksikliğinden kaynaklanabilecek zayıf ve apoptotik durum göstermiştir. RA indüksiyonu (Faz I-protokolü 4 ve 5) ile birlikte monolayer kültürü mESC'lerin farklılaşmasına da yön verebilirken, neurit benzeri hücrelerin oranı Faz I-protokolü 3'teki kadar değildi. Bu arada, Faz I-protokolü 6 ve 7'deki çoğu A2lox ve 129 türevi daha küçük hücre cisimleri gösterdi ve apoptoz geçirme eğiliminde olduğunu belirterek, N2B27 medium II'nin embriyonik nörogenezi etkili bir şekilde destekleyemeyeceğini düşündürmektedir.
NPC'lerin oluşumunu daha da doğrulamak için, her gruptaki Nestin+ hücrelerinin yüzdesi (NPC'ler için belirteç) bir immünofluoresans tahlili kullanılarak tespit edildi. Şekil 3B'deNestin+ hücrelerinin Faz I protokolü 3'teki yüzdesi en yüksekti ve sırasıyla %4,33 ± 77,67'ye, A2lox ve 129 türevlerinde ise %2,33'± 69,33'e ulaştı. Toplu olarak, Aşama I-protokolü 3, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere yönlendirmede en iyi şekilde çalışır.
N2B27 orta II, NPC'lerden nöronlara (Faz II) farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik edebilir. Faz II farklılaşmasında üç protokol incelendi. Şekil 4A'dagösterildiği gibi, morfolojik gözlem, faz II-protokol 3'teki A2lox ve 129 türevlerinin çoğunun (N2B27 orta II ile farklılaşma) 18. İmmünofluoresans tahlilleri, D18'de sırasıyla β-Tubulin III+ hücrelerinin% 4.01'± ve 58.73'e ±% 7.25'e kadar olan nöronların neslini doğruladı (Şekil 4B).
Daha açık hale getirmek için, embriyonik nörogenez için optimize edilmiş yöntemin şematik diyagramı Şekil 5'te gösterilmiştir. Kısaca, 1.5 x10 6 mESC, 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına tohumlanır ve 2 gün boyunca embriyoid vücut oluşumuna izin verir. Daha sonra embriyoid cisimleri toplanır ve kuyu başına 50 embriyoid cisim konsantrasyonu ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına ekilir. Bu arada, RA (1 μM) 6 gün daha eklenir. 8. günden 18. güne kadar RA çıkarılır ve sonraki farklılaşmayı NPC'lerden nöronlara yönlendirmek için N2B27 orta II uygulanır. Böyle bir kombine yöntemle, 18. günde sağlam nöronlar oluşturulabilir.
Şekil 1: Embriyonik nörogenez sürecinin şeması. Bu rakam Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyoid cisimlerinin morfolojisi. (A) Embriyoid cisimler 4 gün boyunca kültürlü. (B) Embriyoid cisimler 2 gün boyunca kültüre edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: A2lox ve 129 mESC kullanılarak faz I farklılaşmasına ilişkin 7 protokolün verimlilik karşılaştırması. (A) 8. Günde A2lox ve 129 mESC türevlerinin morfolojik analizi. Üst panel: A2lox türevleri; Alt panel: 129 türev. (B) NPC oluşumu için immünoresans tespiti (Nestin+, yeşil). Çekirdekler DAPI ile mavi olarak etiketlenmişti. Üst panel: D8'de A2lox türevleri; Alt panel: D8'de 129 türev. Her grubun Nestin+ hücrelerinin yüzdeleri histogram ile gösterilmiştir. Her sütun üç bağımsız deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder. *, s≤0.05; **, s≤0.01. Bu rakam Li ve ark.10'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Faz II farklılaşmasına ilişkin 3 protokolün verimlilik karşılaştırması. (A) 18. Günde A2lox ve 129 mESC türevlerinin morfolojik analizi. Üst panel: A2lox türevleri; Alt panel: 129 türev. (B) Nöron oluşumu için immünoresans tespiti (β-Tubulin III+, kırmızı). Çekirdekler DAPI ile mavi olarak etiketlenmişti. Üst panel: D18'de A2lox türevleri; Alt panel: D18'de 129 türev. Her grubun β-Tubulin III+ hücrelerinin yüzdeleri histogram ile gösterilmiştir. Her sütun, üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini temsil eder. *, s≤0.05; **, s≤0.01. Bu rakam Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için optimize edilmiş yöntemin kısa modeli Bu rakam Liet al.10'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Farklılaşma Aşaması I (8d) | ||
| Protokol | Medya | |
| protokol 1 | Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece ben | Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM/F12 +%15 FBS + %1 NEAA+0,1mM 2ME+ %1 P/S |
| protokol 2 | 4 günlük Embriyoid Vücut oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu | |
| protokol 3 | 2 günlük Embriyoid Vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu | |
| protokol 4 | RA indüksiyonu ile birlikte monolayer kültürü: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protokol 5 | RA indüksiyonu ile birlikte monolayer kültürü: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| protokol 6 | Embriyoid Cisim oluşumu (4 d) ve N2B27 orta II ile indüklenen farklılaşma | N2B27 orta II: %49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobakal orta + %2 B27 +%1 GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
| protokol 7 | N2B27 orta II ile monolayer kültürü | |
Tablo 1: Aşama I farklılaşmasında kullanılan 7 protokolün ayrıntıları. Bu tablo Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir.
| Farklılaşma Aşaması II (10d) | ||
| Protokol | Medya | |
| protokol 1 | Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece ben | Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM/F12 +%15 FBS +%1 NEAA +0,1mM 2ME+ %1 P/S |
| protokol 2 | N2B27 medium I ile farklılaşma | N2B27 orta I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + %1 GlutaMAX +0.1mM 2ME |
| protokol 3 | N2B27 orta II ile farklılaşma | N2B27 orta II: %49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobakal orta + %2 B27 +%1 GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
Tablo 2: Faz II farklılaşmasında kullanılan 3 protokolün ayrıntıları. Bu tablo Li ve ark.10'dan değiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, düşük maliyetli ve kolayca elde edilen malzemelerle, mESC'lerden nöronal farklılaşma için basit ve etkili bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemde, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu ve ardından 6 günlük RA indüksiyonu, MESC'lerin NPC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik edebilir (Faz I-protokolü 3). Faz II farklılaşması için, N2B27 orta II (Faz II-protokol 3) NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik eder. Başarıyı sağlamak için birkaç kritik adıma daha fazla dikkat edilmelidir.
İlk olarak, embriyoid vücutların sağlıklı durumu tüm farklılaşma sürecinin anahtarıdır. Üç boyutlu embriyoid vücut oluşumu genellikle ESC'lerin farklılaşmasına yön vermek için kullanılır8. Bu çalışmada embriyoid cisimlerin uygun süspansiyon kültürü zamanını araştırdık. Şekil 2'degösterildiği gibi, parlak çekirdekli yuvarlak embriyoid cisimler, bu durumda 2 gün boyunca süspansiyon kültüründen sonra oluşturulmuştur. Bununla birlikte, 4 gün boyunca kültürlendiğinde, birçok embriyoid cisim birbirine yapışır ve çekirdekler karanlık hale gelir ve bu da çekirdeklerdeki hücrelerin apoptozuna işaret eder. Daha sonraki farklılaşma, uzun süreli embriyoid vücut oluşumunun daha kötü etkisini daha da doğruladı. Bildirilen bazı çalışmalarda, embriyoid cisimlerin süspansiyon kültürü, daha düşük FBS konsantrasyonuna sahip veya FBS 11 olmadan orta kullanarak10gün kadar sürebilir. Çalışmada embriyoid vücut oluşumu için azaltılmış süre, daha yüksek FBS konsantrasyonuna (%15) bağlı olabilir. burada kullanılır ve% 15 FBS'nin embriyoid cisimlerin oluşumunu ve farklılaşmasını daha iyi teşvik edebileceği kanıtlanmıştır.
İkincisi, RA'nın uygulandığı zaman noktası ve RA çalışma konsantrasyonu MESC'lerin hücre kaderinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir. A vitamininin bir türevi olan RA, pleiotropik eylemlere sahip en önemli morfojenlerden biridir12. RA birden fazla sinyal yolunu düzenleyebilir ve ESC'lerin hücre kaderinin belirlenmesini etkileyebilir13,14. Raporlar, erken farklılaşma aşamasında MESC'lerin RA ile kısa süreli tedavisinin spontan farklılaşmayı önlediği ve mESC15'inkendini yenileme kapasitesini koruduğu göstermiştir. Diğerleri RA'nın hem mikrop hücre farklılaşması hem de zaman noktasına bağlı 16,17,18olanESC'lerdensinirselfarklılaşmayı düzenleyebileceğini öne sürdü. Burada sunulan durumda, EMBRIYOID vücut oluşumundan sonraki2 nd günde eklenen RA, farklılaşmayı NPC'lere yönlendirmek için uygundur. Bu arada, RA'nın çalışma konsantrasyonu da kritiktir. Düşük RA konsantrasyonları (~10 nM) mESC'lerin endoderm benzeri hücrelere farklılaşmasına neden olabilirken, yüksek RA konsantrasyonlarının (1-5 μM)NPC'lerefarklılaşmaya neden olma olasılığı daha yüksektir 13,14,15,16,17,18,19. RA kullanımı nedeniyle, bir kaudalizasyon etkisi beklenir; ön beyin nöronlarına farklılaşma nadiren görülür ve arka beyin ve omurilik kaderlerinin nöronları meydana gelir20,21. Ayrıca, RA kolayca kullanılabilen ve düşük maliyetli bir ajandır ve bu protokolün kullanımı çoğu laboratuvar için araştırma fonlarından tasarruf sağlayabilir.
Üçüncü olarak, burada sunulan durumda, faz I farklılaşmasından sonra oluşturulan NPC'ler uygun koşullarda saklanabilir ve geçiş yapılabilir. Kök HücreBanker kullanarak yüksek hücre yoğunluğuna sahip kriyoprezervasyon (>2 x10 6),yüksek iyileşme oranı elde etmek için donma nedeniyle oluşan hücre hasarını etkili bir şekilde azaltabilir. Bu arada, çalışmada üretilen NPC'ler, 5 x105 /cm 2'den fazla hücre yoğunluğuna sahip N2B27 ortamı (%49 DMEM/F12+ %1 N2 + %48 Nörobasal orta + %2B27)kullanılarak geçirilebilir. Düşük hücre yoğunluğu altında (0,5 x 105/cm2'denaz), NPC'ler farklılaşma eğilimindedir. Bu tür hücre kriyoprezervasyonu ve iyileşmesi araştırmaya büyük kolaylık getirebilir.
Ayrıca, Nörobakal ortam faz II farklılaşması için gereklidir. Nörobakal ortam özellikle nöronal hücrenin uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmıştır. N2B27 medium II 'de(Tablo 2)listelendiği gibi, Nörobakal ortamın eklenmesi NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı daha iyi destekleyebilir.
Toplu olarak, kombinatoryal tarama stratejilerini kullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem bildirdik. Kurulan yöntemin uygulanması çok kolaydır ve çoğu laboratuvar tarafından kullanıma uygundur. Böyle optimize edilmiş bir yöntem nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31501099) ve Hubei Eyaleti Eğitim Departmanı Orta Yaşlı ve Genç (No. Q20191104). Wuhan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Profesör Wensheng Deng'e fare embriyonik kök hücre çizgileri A2lox'u sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
