Summary
В этой публикации описывается протокол изоляции ядер от зрелых адипоцитов, очищение путем флуоресценции активированной сортировки и транскриптомики одноклеточного уровня.
Abstract
Коричневый и бежевый жир являются специализированными жировыми тканями, которые рассеивают энергию для термогенеза UCP1 (Uncoupling Protein-1) -зависимых и независимых путей. До недавнего времени термогенные адипоциты считались однородной популяцией. Тем не менее, недавние исследования показали, что Существует несколько подтипов или субпопуляций, которые отличаются по происхождению развития, использованию субстрата и транскриптом. Несмотря на достижения в одноклеточной геномике, беспристрастное разложение жировых тканей в клеточные подтипы было сложным из-за хрупкого характера заполненных липидами адипоцитов. Представленный протокол был разработан для обхода этих препятствий путем эффективной изоляции одиночных ядер от жировой ткани для применения ниже по течению, включая секвенирование РНК. Сотовая неоднородность может быть проанализирована с помощью секвенирования РНК и биоинформатического анализа.
Introduction
Исследования показали, что коричневая жировая ткань (BAT) обладает замечательной способностью рассеивать энергию. Два типа термогенных адипоцитов с различными особенностями развития существуют как у грызунов, так и у человека: бежевые адипоциты и классические коричневые адипоциты. В то время как классические коричневые адипоциты расположены в основном в межкапялярных депо BAT, бежевые адипоциты спорадически возникают в белой жировой ткани (WAT) в ответ на определенные физиологические сигналы, такие как хроническое воздействие холода, процесс, именуемый "коричневый" или "beiging". Благодаря использованию передовых изображений, теперь ясно, что взрослые люди имеют существенные склады UCP1и BAT, особенно в супраклавикулярной области1,2,3,4. Количество взрослого человека BAT обратно коррелирует с ожирением и может быть увеличена внешними сигналами, такими как хроническое воздействие холода5,,6 или 3-адренергических рецепторов агонист7. Затраты энергии при посредничестве BAT могут предложить жизнеспособный подход к борьбе с ожирением.
До недавнего времени термогенные адипоциты считались однородной популяцией. Тем не менее, исследования показали существование нескольких подтипов или субпопуляций, которые отличаются по развитию происхождения, использования субстрата, и транскриптом8,,9,10. Например, тип бежевого адипоцита, который преимущественно использует глюкозу для термогенеза, g-бежевого адипоцита, был недавно описан10. Неполное понимание типов клеток в коричневой и бежевой жировой ткани и отсутствие конкретных маркеров представляют собой критический барьер для изучения их биологических функций.
Традиционные методы изоляции субпопуляций клеток основаны на экспрессии лишь нескольких известных генов маркеров. Последние достижения в области одноклеточной геномики позволяют использовать глобальные данные экспрессии генов отдельных клеток для объективной оценки количества субпопуляций в ткани. Конечная цель этого протокола заключается в определении всех подтипов жировой ткани под различными термогенными стимулами при одноклеточном разрешении. В отличие от других тканей и типов клеток, определение клеточных подтипов жировой ткани является сложной задачей из-за хрупкости заполненных липидами адипоцитов. В настоящем документе вводится надежный протокол для изоляции одиночных ядер от жировой ткани для применения ниже по течению до секвенирования snRNA. Важно отметить, что недавняя литература сравнения хорошо подобранных однонуклейных РНК секвенирования (snRNA-seq) и одноклеточного секвенирования РНК (scRNA-seq) наборы данных показали, что snRNA-seq сравним с scRNA-seq в обнаружении типа клеток, и превосходит в клеточном покрытии для сложной ткани, как мозг11. Этот протокол сочетает в себе метод центрифугации градиента плотности, оптимизированный для жировых тканей Rosen et al.12 с ядерным шагом «очистки» с высокоскоростным сортировщиком MoFlo XDP. Как видно из репрезентативных результатов, анализ 7500 одиночных ядер из мыши межкаплуановой коричневой жировой ткани определили несколько типов клеток в, казалось бы, однородных коричневых адипоцитов. В целом, этот простой и надежный протокол может быть применен для изучения тканевой организации адипоцитов и жировых клеток-резидентов, идентификации подтип-специфических генов маркеров и фенотипирования жирово-селективных нокаутов/трансгенных мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна.
1. Подготовка буферов переваривания тканей и лиза
- Подготовка буфера пищеварения тканей.
- Приготовьте буфер пищеварения в размере 1 м/л для каждого грамма жировой ткани.
- Взвесьте 1,5 U/mL коллагеназы D и 2,4 U/mL dispase II и добавьте фосфат буферизированный солевой раствор (PBS).
- Подготовка буфера подготовки ядер (NPB).
- Приготовьте 10 мМ HEPES, хлорид магния 1,5 мМ, 10 мМ хлорид калия, 250 мМ сахарозы и 0,1% NP-40 в воде без нуклеазы. Хорошо перемешать. Сахароза может занять больше времени, чтобы растворить, чем другие компоненты.
- Подготовьте раствор сыворотки крупного рогатого скота (BSA) на 0,5%.
- Подготовьте 0,5% BSA в PBS, содержащий EDTA. Рекомендуется использовать стерильные фильтрованные клетки культуры класса PBS (см. Таблицу Материалов).
2. Ферментативное переваривание жировой ткани
- Вскрыть мышей для извлечения жировой ткани в соответствии с Aune и др.13. Соберите изолированную ткань в блюде, содержащем PBS. Перенесите ткань на бумажное полотенце, чтобы погладить сухой. Затем поместите ткань в чистую тарелку.
- Добавьте хлорид кальция в буфер пищеварения к конечной концентрации 10 мМ. Добавьте небольшой объем буфера пищеварения в блюдо и тщательно фарш жировой ткани. Объем требуемого буфера пищеварения будет основываться на количестве выделенной ткани. Обычно используется 1 мл или меньше.
- Добавьте около половины подготовленного буфера пищеварения (например, 10 мл на пять мышей) в фарш. Используя серологическую пипетку, перенесите образец на коническую центрифуговую трубку 50 мЛ. Добавьте оставшееся количество буфера, чтобы вымыть блюдо и перенести в трубку 50 мЛ, содержащую образец. Пипетки вверх и вниз несколько раз. Затем инкубировать при встряхивании при 200-210 об/мин при 37 градусах Цельсия в течение 12-15 мин.
3. Изоляция адипоцитов
- После инкубации добавьте 0,5% BSA при соотношении 1:1 к выборке. Хорошо перемешать, трубя вверх и вниз несколько раз. Центрифуга образца при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) для вращения стромальной сосудистой фракции (SVF). Фракция адипоцитов останется в верхнем слое образца.
- Поместите 40-мк клеточный фильтр поверх конической центрифугальной трубки 50 мл и отфильтруйте образец, соберая верхний слой и оставив SVF в нижней части трубки. Перенесите верхний слой (адипоцитная фракция) в новую трубку, перевернув фильтр вверх дном над трубкой и используя 0,5% BSA для обратного мытья фильтра и собирать образец в трубке.
- Доведите общий объем 0,5% BSA до 10-15 мл в зависимости от размера образца и пипетки вверх и вниз с серологическим пипеткой или кратко встряхнуть вверх и вниз, чтобы смешать образец. Центрифуга образец снова на 300 х г в течение 5 минут на RT.
4. Изоляция ядер
- Используйте широкоствольный наконечник пипетки и тщательно перенесите верхний слой образца на 100-мкм клеточный фильтр, размещенный поверх новой пречилловой трубки на льду, оставляя после себя остаточные SVF.
- Промыть/промыть фильтр с достаточным количеством NPB и отбросить фильтр. От этого шага вперед есть образец на льду как можно чаще и работать быстро, чтобы избежать вытекающей и / или нездоровых ядер. Полезно дохилловые микроцентрифуги трубки, которые будут использоваться в будущих шагах на льду.
- Поместите образец на лед не более 2 минут с прерывистой нежной инвертирование трубки для смешивания. Время инкубации на льду должно быть оптимизировано для размера образца и типа адипоцитов. Центрифуга при 1000 х г при 4 градусах в течение 10 мин.
- Удалите супернатант и повторно обуздьте гранулы в 1 мл NPB. Перенесите образец в чистую микроцентрифугую трубку. При передаче, избегать прикосновения к стенам трубки, которые содержат мусор и липидов. Добавьте в образец ингибитор 0,6 U/L RNase и смешайте. Центрифуга снова на 1000 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость и время центробежки должны быть уменьшены на этом этапе для небольших образцов. - Удалите супернатант и повторно в 1 мл ям ямы буфера (2% BSA / PBS 0,6 U / L RNase ингибитор).
- Двойной фильтр в чистую трубку с стекируемыми 30 мкм фильтрами. Вымойте фильтр с небольшим объемом (300 мл) ямок буфера. Кроме того, для небольших образцов используйте фильтр 30 мкм, который вписывается в трубку микроцентрифуги и фильтруется непосредственно в нее.
- Подтвердите успешную изоляцию здоровых ядер.
- Окрашивайте небольшой aliquot образца с trypan и используйте автоматизированный счетчик ячейки для оценки среднего мертвого размера и процентов мертвых клеток. Средний размер мертвого для образца, содержащего в основном ядра должны варьироваться от 7-10 мкм. Размер ядер обычно составляет около 8 мкм.
- Окрашивайте небольшой aliquot образца с DAPI и изучить под микроскопом с 20x цели или выше. Ядерная мембрана должна быть нетронутой, а ядра должны быть круглыми.
5. Шаг концентрации ОЧИСТКи и концентрации ядер FACS
- Немедленно приступайте к шагу FACS, чтобы очистить ядра и удалить излишки мусора. Буфер сбора должен содержать буфер ямок ядра. Во время FACS буфер разбавляется. Подготовка более высокой концентрации BSA и ингибитор RNase для учета разбавления во время сортировки полезно. Блок сбора FACS должен находиться в режиме охлаждения.
- После сортировки ядер центрифуга при 500 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия концентрирует образец. Восстановление в соответствующем объеме ямок ядер ядеры для достижения концентрации 500-1500 ядер / МЛ. Не пытайтесь удалить все супернатант. Это приведет к потере ядер.
- Используйте гемостометр и DAPI окрашенных aliquot для окончательного подсчета и визуализировать ядра. Затем немедленно приступаем к snRNA-seq в соответствии с протоколом производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Неотсортированные ядра адипоцитов содержат мусор и дублеты, которые создают шум и высокий фон в секвенировании одноклеточной РНК вниз по течению. Репрезентативная стратегия ворот FACS показана на рисунке 1. Ядра были впервые выбраны на основе передового рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) (A), затем, только синглеты были выбраны на основе сочетания ширины и высотЫ SSC (B). Наконец, были выбраны и сортируются только ДАПИ-позитивные события в буфер сбора(C). Этот рабочий процесс обеспечивает высокоочищенные одноядерные с минимизированными ядерными агрегатами и клеточным мусором(рисунок 2).
Чтобы подтвердить целостность сортированных ядер, небольшая аликот образца была проверена микроскопом после окрашивания DAPI. Ядерная мембрана должна быть нетронутой, а ядра должны быть круглыми(рисунок 2B). Чтобы подтвердить успех очистки, рекомендуется также собирать супернатант (т.е. буфер сбора) после центробежности и запускать в режиме реального времени qRT-PCR маркерного гена. Использование грунтовки (праймер последовательностей в таблице 1), предназначенных для усиления зарождающейся, интрон-содержащих UCP1, подтвердил, что супернатант отсортированных ядер не содержат обнаруживаемый уровень зарождающейся Ucp1 мРНК(рисунок 3). Этот шаг может быть сделано для других генов маркеров весьма обильные в коричневый, бежевый или белый адипоцитов, таких как Cidea, Pgc1-A, Adipoq, или Fabp4.
Ядра, изолированные и подтвержденные с помощью этого протокола, могут подвергаться практически любой одноклеточной платформе экспрессии генов. Использование платформы Chromium14 (10x Genomics) определило транскриптом 7500 ядер из межкаплуановой коричневой жировой ткани от 8-недельных самцов C57BL/6 мышей(рисунок 4). t-распределенный стохастический сосед встраивание (t-SNE) снижение размерности и K-средств кластеризации показали семь типов клеток, в том числе коричневые адипоциты, эндотелиальные клетки, фрески клетки отмечены Pdgfrb, адипоцитов прародителей, и иммунных клеток. Все кластеры выразили Fabp4, пан-адипоцитов гена, в той или иной степени (Рисунок 4B). Подмножество кластеров выразил высокий уровень Ucp1 мРНК, в то время как другие кластеры спорадически выразил Ucp1 (рисунок 4A,C). Это согласуется с предыдущим исследованием, показывающим, что межкаплуарная коричневая жировая ткань содержит по крайней мере две различные популяции с высоким и низким выражением Ucp1 и термогенной активностью8,,9.
Рисунок 1: Репрезентативный анализ цитометрии потоков ядер MoFlo XDP Высокоскоростной сортер. (A) Размер и детализация. (B) Обнаружение ядерных агрегатов и мультиплетов. (C) Окончательные ворота сортировки выбора только DAPI-положительные события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Репрезентативное изображение ядер, выделенных из коричневых адипоцитов. (A) До и(B) после сортировки MoFLo XDP. Белые стрелки в А указывают на ядра без нетронутой мембраны. Масштабная штанга No 50 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель qRT-PCR результат для изолированных ядер и супернатанта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель 10x хром snRNA-seq результаты для коричневых адипоцитов изолированы от 8-недельного самца C57BL/6 мышей под RT. (A) t-SNE размерности сокращения и K-средства кластеризации для 7500 ядер. к No 9. Канонические маркеры, используемые для кластерных аннотаций, отображаются в скобках. (B) мРНК выражение Fabp4, адипоцит-селективный маркер, в A. Белый - нет выражения, красный и высокое выражение. (C) мРНК выражение Ucp1, термогенный маркер в A. Эти данные взяты из одного эксперимента. данные snRNA-seq, используемые для этих цифр, были депонированы в Gene Expression Omnibus (GEO) под номером присоединения к суперсерии GSE144720. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Ген | Видов | Вперед грунтовка | Обратная грунтовка |
| Ucp1 (интрон-содержащий) | Мыши | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Таблица 1: Праймер последовательности для анализа qPCR в режиме реального времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлен простой и надежный метод изоляции одиночных ядер и изучения неоднородности жировой ткани. По сравнению с секвенированием РНК всей ткани, этот рабочий процесс предлагает объективное представление о клеточной неоднородности и маркерах, специфичных для популяций. Это является значительным и инновационным для продвижения адипоцитов биологии, молекулярного метаболизма и исследования ожирения.
Этот протокол особенно оптимизирован для приложения snRNA-seq. "Очистка" шаг для достижения изоляции здоровых ядер с MoFlo XDP высокоскоростной сортер полностью удаляет мусор и агрегаты из сырой подвески при сохранении целостности ядерной мембраны. Таким образом, это повышает эффективность захвата в формировании капель и восстанавливает тысячи одноядерных транскриптомов только из одного запуска без потери количества обнаруженных генов. В дополнение к каплям на основе одноклеточных платформ, которые обеспечивают большее количество обследованных одиночных ядер или клеток, сортировочная микропластырь и платформы Fluidigm C115 также могут быть использованы для получения большего разрешения и охвата транскриптом16. Поскольку этот рабочий процесс предлагает высококачественные ядра, анализы на транспозазу доступного хроматина с помощью секвенирования (т.е. ATAC-секвенирования) также могут быть выполнены с минимальными изменениями существующего протокола scATAC-seq17.
Одним из ограничений этого протокола является потеря информации от удаления неядерных отсеков, таких как цитозол и клеточная мембрана. Например, возникающие мультимодальные одноклеточные анализы18,19, которые одновременно измеряют экспрессию клеточного мембранного белка и транскриптом не может быть применен к этому протоколу.
Будущая цель состоит в том, чтобы объединить этот протокол с ядер мультиплексирование с помощью штрих-кодированных антител20. Сортированные ядра из различных жировых тканей в различных экспериментальных условиях будут штрихкодировать и объединиться с использованием антиядерного порного комплекса антител и snRNA-seq будет выполнено. По секвенированию этих штрих-кодов наряду с ядерной транскриптом, каждый ядра могут быть назначены на свой первоначальный образец, кросс-образец мультиплеты могут быть четко определены, и капельные системы могут быть "супер-загружены" для значительного сокращения затрат на ядра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Рейнольдса из ядра геномики Альберта Эйнштейна и Цзинханга Чжана из ядра потока Cytometry за техническую поддержку. Мы признаем поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) (DK110426) и экспериментальных и технико-экономических грантов от Эйнштейна-Гора Синай Диабет исследовательский центр (DK020541), и Нью-йоркский центр исследований ожирения (DK026687) (все к К.С.). Мы также хотели бы поблагодарить Онкологический центр Альберта Эйнштейна (CA013330) за поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
