Summary
Denna publikation beskriver ett protokoll för isolering av kärnor från mogna adipocyter, rening genom fluorescensaktiverad sortering och encellig transkriptomik.
Abstract
Brunt och beige fett är specialiserade fettvävnader som avleder energi för thermogenesis av UCP1 (Uncoupling Protein-1)-beroende och oberoende vägar. Tills nyligen ansågs termogena adipocyter vara en homogen population. Nyligen genomförda studier har dock visat att det finns flera subtyper eller subpopulationer som är distinkta i utvecklingsmässiga ursprung, substrat användning och transkriptom. Trots framsteg inom encellig genomik, opartisk nedbrytning av fettvävnader i cellulära subtyper har varit utmanande på grund av den bräckliga karaktären av lipidfyllda adipocyter. Protokollet som lagts fram utvecklades för att kringgå dessa hinder genom effektiv isolering av enskilda kärnor från fettvävnad för nedströms applikationer, inklusive RNA sekvensering. Cellulär heterogenitet kan sedan analyseras genom RNA-sekvensering och bioinformatiska analyser.
Introduction
Studier har visat att brun fettvävnad (BAT) har en anmärkningsvärd förmåga att avleda energi. Två typer av termogena adipocyter med distinkta utvecklingsmässiga funktioner finns i både gnagare och människor: beige adipocyter och klassiska bruna adipocyter. Medan klassiska bruna adipocyter ligger mestadels i interscapular BAT depåer, beige adipocyter sporadiskt dyka upp i vit fettvävnad (WAT) som svar på vissa fysiologiska ledtrådar, såsom kronisk kall exponering, en process som kallas "browning" eller "beiging". Genom användning av avancerad avbildning, är det nu klart att vuxna människor har betydande depåer av UCP1+ BAT, särskilt i supraclavicular regionen1,2,3,4. Mängden vuxna mänskliga BAT omvänt korrelerar med adipositet och kan ökas med externa signaler, såsom kronisk kall exponering5,,6 eller β3-adrenerga receptor agonist7. BAT-medierad energiförbrukning kan erbjuda en hållbar strategi för att bekämpa fetma.
Tills nyligen har termogena adipocyter ansetts vara en homogen population. Studier har dock visat att det finns flera subtyper eller subpopulationer som är distinkta i utvecklingsursprung, substratanvändning och transkriptom8,9,10. Till exempel, en typ av beige adipocyte som företrädesvis använder glukos för thermogenesis, g-beige adipocyte, beskrevs nyligen10. Den ofullständiga förståelsen av celltyper i brun och beige fettvävnad och bristen på specifika markörer utgör ett kritiskt hinder för att studera deras biologiska funktioner.
Traditionella metoder för att isolera subpopulationer av celler är baserade på uttryck av endast ett fåtal kända markörgener. Den senaste tidens framsteg inom encellig genomik gör det möjligt att använda globala genuttrycksdata för enskilda celler för att ge en opartisk uppskattning av antalet subpopulationer i en vävnad. Det slutliga målet med detta protokoll är att bestämma alla fettvävnad subtyper under olika termogena stimuli vid en enda cell upplösning. I motsats till andra vävnader och celltyper, bestämma cellulära subtyper av fettvävnad är utmanande på grund av bräcklighet lipidfyllda adipocyter. Detta dokument introducerar ett robust protokoll för att isolera enstaka kärnor från fettvävnad för nedströms ansökan till snRNA sekvensering. Viktigt, senaste litteraturen jämföra väl matchade single-nuclei RNA sekvensering (snRNA-seq) och encellig RNA sekvensering (scRNA-seq) datamängder visade att snRNA-seq är jämförbar med scRNA-seq i celltyp upptäckt, och överlägsen i cellulär täckning för en komplex vävnad som hjärnan11. Detta protokoll kombinerar en densitet gradient centrifugering metod optimerad för fettvävnader av Rosen et al.12 med en kärnor "sanering" steg med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som framgår av de representativa resultaten, en analys av 7.500 enda kärnor från musen interscapular brun fettvävnad identifierade flera celltyper inom till synes homogena bruna adipocyter. Sammantaget kan detta enkla och robusta protokoll tillämpas för att studera vävnadsnivå organisation av adipocyter och fett-bosatta celler, identifiering av subtyp-specifika markör gener och utveckling fenotypning av fett-selektiv knockout/transgena möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och experiment utfördes enligt förfaranden som godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee vid Albert Einstein College of Medicine.
1. Beredning av vävnadsnedsmältning och lysbuffertar
- Förbered vävnadsnedsmältningsbuffert.
- Förbered ~1 ml rötningsbuffert för varje gram fettvävnad.
- Väg ut 1,5 U/mL kollagenas D och 2,4 U/ml dispase II och tillsätt fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS).
- Förbered atomsyrsbuffert (NPB).
- Förbered 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumklorid, 10 mM kaliumklorid, 250 mM sackaros och 0,1% NP-40 i nukleasfritt vatten. Blanda väl. Sackaros kan ta längre tid att lösa upp än de andra komponenterna.
- Förbered 0,5 % bovint serumalbuminlösning (BSA).
- Förbered 0,5% BSA i PBS som innehåller EDTA. Det rekommenderas att använda sterilt filtrerad cellodlingsklass PBS (se Tabell över material).
2. Enzymatisk nedbrytning av fettvävnad
- Dissekera möss för att extrahera fettvävnad enligt Aune et al.13. Samla isolerad vävnad i en maträtt som innehåller PBS. Överför vävnaden till en pappershandduk för att klappa torrt. Placera sedan vävnaden i en ren skål.
- Tillsätt kalciumklorid till rötningsbufferten till en slutlig koncentration på 10 mM. Tillsätt en liten volym av matsmältningsbuffert till skålen och finhacka fettvävnaden noggrant. Den mängd matsmältningsbuffert som krävs kommer att baseras på mängden vävnad som isoleras. Vanligtvis ~ 1 ml eller mindre används.
- Tillsätt ungefär hälften av mängden beredd rötningsbuffert (t.ex. ~10 ml för fem möss) till den malet vävnaden. Med hjälp av en serologisk pipett överför du provet till ett koniskt centrifugrör på 50 ml. Tillsätt eventuell återstående mängd buffert för att tvätta skålen och överför till det 50 ml-rör som innehåller provet. Pipett upp och ner flera gånger. Inkubera sedan med skakning vid 200-210 varv/min vid 37 °C i 12-15 min.
3. Adipocyte isolering
- Efter inkubation, tillsätt 0,5% BSA vid ett 1:1-förhållande till provet. Blanda väl genom pipettering upp och ner flera gånger. Centrifugera provet vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT) för att snurra ner den stromala kärlfraktionen (SVF). Adipocyte-fraktionen kommer att finnas kvar i provets översta lager.
- Placera ett 40 μm cellfilter ovanpå ett koniskt centrifugrör på 50 ml och filtrera provet, samla upp det översta lagret och lämna EFTER SIG SVF längst ned i röret. Överför det översta lagret (adipocytefraktion) till ett nytt rör genom att vända filtret upp och ner över röret och använda 0,5% BSA för att vända tvätta filtret och samla in provet i röret.
- Ta den totala volymen på 0,5% BSA till 10-15 ml baserat på provstorlek och pipett upp och ner med en serologisk pipett eller skaka upp och ner en kort stund för att blanda provet. Centrifugera provet igen vid 300 x g i 5 min vid RT.
4. Isolering av kärnor
- Använd en bredbortrörsspets och överför försiktigt provets översta lager till ett 100 μm cellfilter placerat ovanpå ett nytt förkryt rör på is, och lämna kvar alla kvarvarande SVF.
- Skölj/tvätta filtret med tillräcklig mängd NPB och kassera filtret. Från detta steg framåt har provet på is så ofta som möjligt och arbeta snabbt för att undvika läckande och / eller ohälsosamma kärnor. Det är bra att prechill microcentrifuge rör som ska användas i framtida steg på is.
- Placera provet på is i högst 2 min med intermittent mild invertering av röret för att blanda. Inkubationstiden på is bör optimeras för provstorlek och typ av adipocyter. Centrifug vid 1 000 x g vid 4 °C i 10 min.
- Ta bort supernatanten och sätt tillbaka pelleten i 1 ml NPB. Överför provet till ett rent mikrocentrifugrör. Vid överföring, undvik att röran, som innehåller skräp och lipid. Tillsätt 0,6 U/μL RNase-hämmare till provet och blanda. Centrifugera igen vid 1000 x g vid 4 °C i 10 min.
CENTRIFUGEringshastighet och centrifugeringstid bör minskas vid detta steg för mindre prover. - Ta bort supernatanten och resuspend i 1 ml nuclei tvättbuffert (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL RNase-hämmare).
- Dubbelfilter till ett rent rör med stapelbara 30 μm filter. Tvätta filtret med en liten volym (~300 μL) nucleitvättbuffert. Alternativt, för mindre prover, använd ett 30 μm filter som passar in i ett mikrocentrifugrör och filtrera direkt in i det.
- Bekräfta framgångsrik isolering av friska kärnor.
- Färga en liten alikvot av provet med trypan och använd en automatiserad cellräknare för att bedöma genomsnittlig död storlek och procent döda celler. Genomsnittlig död storlek för ett prov som innehåller mestadels kärnor bör variera mellan 7-10 μm. Nuclei storlek är vanligtvis runt 8 μm.
- Fläcka en liten alikvot av provet med DAPI och undersök under ett mikroskop med ett 20x-mål eller högre. Kärnmembranet ska vara intakt och kärnorna ska vara runda.
5. FACS sanering och kärnor koncentration steg
- Fortsätt omedelbart till FACS-steget för att rensa upp kärnor och ta bort överflödigt skräp. Insamlingsbufferten ska innehålla Nuclei Wash Buffer. Under FACS späds bufferten ut. Förbereda en högre koncentration av BSA och RNase hämmare att ta hänsyn till utspädning under sortering är till hjälp. FACS-uppsamlingsblocket ska vara på kylläge.
- Efter sortering av kärnorna, centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C för att koncentrera provet. Rekonstruera i en lämplig volym nuclei tvättbuffert för att uppnå en koncentration på 500-1 500 kärnor/μL. Försök inte ta bort alla supernatant. Detta kommer att resultera i förlust av kärnor.
- Använd en hemocytometer och en DAPI färgade aliquot för en slutlig räkna och att visualisera kärnor. Fortsätt sedan omedelbart med snRNA-seq enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Unsorted adipocyte kärnor innehåller skräp och doublets som skapar buller och hög bakgrund i nedströms encelliga RNA sekvensering. Den representativa FACS-gatestrategin visas i figur 1. Kärnorna valdes först ut baserat på framåtspit (FSC) och sidospit (SSC) (A),då valdes endast singlets baserat på kombinationen av bredd och höjder av SSC (B). Slutligen valdes endast DAPI-positiva händelser ut och sorterades till insamlingsbuffert(C). Detta arbetsflöde ger mycket renade enstaka kärnor med minimerade kärnaggregat och cellulära skräp (figur 2).
För att bekräfta integriteten hos de sorterade kärnorna inspekterades en liten alikvot av provet av mikroskop efter DAPI-färgning. Kärnmembranet ska vara intakt och kärnorna ska vara runda (figur 2B). För att bekräfta framgången för rening, rekommenderas det också att samla supernatant (dvs. insamling buffert) efter centrifugering och köra realtid qRT-PCR av en markör gen. Användning av en primeruppsättning (grundfärgssekvenser i tabell 1) som utformats för att förstärka begynnande, introninnehållande UCP1, bekräftade att supernatanten av sorterade kärnor inte innehöll en påvisbar nivå av begynnande Ucp1 mRNA (figur 3). Detta steg kan göras för andra markör gener mycket riklig i brunt, beige eller vitt adipocyter, såsom Cidea, Pgc1-a, Adipoq, eller Fabp4.
Nuclei isolerade och bekräftas genom detta protokoll kan utsättas för praktiskt taget alla encelliga genuttryck plattform. Användning av kromplattformen14 (10x Genomics) fastställde en transkriptom på 7 500 kärnor från interscapular brun fettvävnad från 8 veckor gamla hanar C57BL/6 möss (figur 4). t-distribueras stokastiska granne inbäddning (t-SNE) dimensionalitet minskning och K-medel klustring visade sju celltyper, inklusive bruna adipocyter, endotelceller, väggmålning celler markerade med Pdgfrb, adipocyte progenitors och immunceller. Alla kluster uttryckte Fabp4, en pan-adipocyte gen, i varierande grad (figur 4B). En delmängd kluster uttryckte en hög nivå av Ucp1 mRNA, medan andra kluster sporadiskt uttryckt Ucp1 (figur 4A,C). Detta är förenligt med en tidigare studie som visar att interscapular brun fettvävnad innehåller minst två olika populationer med högt och lågt Ucp1 uttryck och termogen aktivitet8,9.
Figur 1: Representativ flödescytometrianalys av kärnor av MoFlo XDP höghastighetssorterare. (A) Storlek och granularitet. B)Detektion av kärnaggregat och multipleter. (C) Slutlig sorteringsgrind som endast väljer DAPI-positiva händelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ bild av kärnor isolerade från bruna adipocyter. (A)Före och(B)efter MoFLo XDP-sortering. Vita pilar i A indikerar kärnor utan intakt membran. Skalbar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativt qRT-PCR-resultat för isolerade kärnor och supernatant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa 10x krom snRNA-seq resultat för bruna adipocyter isolerade från 8 veckor gamla manliga C57BL/6 möss under RT. (A)t-SNE dimensionalitetsminskning och K-Medel klustring för 7 500 kärnor. k = 9. Kanoniska markörer som används för klusteranteckningar visas inom parentes. ( B)mRNA uttryck för Fabp4, en adipocyte-selektiv markör, i A. Vit = inget uttryck, röd = högt uttryck. (C)mRNA uttryck för Ucp1, termogen markör i A. Dessa data kommer från ett enda experiment. snRNA-seq-data som användes för dessa siffror deponerades i Genuttrycket Omnibus (GEO) under superseriens anslutningsnummer GSE144720. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen | Arter | Framåt primer | Omvänd primer |
| Ucp1 (Intron-innehållande) | Musen | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabell 1: Primersekvenser för qPCR-analys i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel och robust metod för att isolera enstaka kärnor och studera fettvävnad heterogenitet presenteras. Jämfört med hela vävnad RNA sekvensering, erbjuder detta arbetsflöde en opartisk bild av cellulära heterogenitet och populationsspecifika markörer. Detta är betydande och innovativt för utvecklingen av adipocytebiologi, molekylär metabolism och fetmaforskning.
Detta protokoll är särskilt optimerat för nedströms tillämpning av snRNA-seq. "Rensning" steg för att uppnå isolering av friska kärnor med MoFlo XDP High Speed Sorter helt tar bort skräp och aggregat från den råa suspensionen samtidigt som kärnmembran integritet. Därför ökar detta fånga effektivitet i droppbildningen och återvinner tusentals en-kärnor transkriptom från bara en körning utan förlust av antalet upptäckta gener. Förutom droppbaserade encelliga plattformar, som ger ett större antal undersökta enskilda kärnor eller celler, kan sortersbaserade mikroplattor och Fluidigm C1-plattformar15 också användas för att få större upplösning och täckning av transkriptomet16. Eftersom detta arbetsflöde erbjuder högkvalitativa kärnor kan analyser för transposastillgänglig kromatin med sekvensering (dvs. ATAC-sekvensering) också utföras med minsta ändringar av det befintliga scATAC-seq-protokollet17.
En begränsning av detta protokoll är förlusten av information från avlägsnandet av icke-nukleära fack, såsom cytosol och cellulära membran. Till exempel, nya multimodala encelliga analyser18,19 som samtidigt mäter cellmembranprotein uttryck och transkriptom kan inte tillämpas på detta protokoll.
Det framtida målet är att kombinera detta protokoll med atomsmultnaxering med streckkodade antikroppar20. Sorterade kärnor från olika fettvävnader under olika experimentella förhållanden kommer att streckkodas och poolas med hjälp av en antinukleär porkomplexantikropp och snRNA-seq kommer att utföras. Genom sekvensering av dessa streckkoder tillsammans med den nukleära transkriptom, kan varje kärnor tilldelas sitt ursprungliga prov, korsprov multipleter kan tydligt identifieras, och droplet-baserade system kan "super-loaded" för betydande kostnadsminskning per kärnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka David Reynolds från Albert Einstein Genomics kärna och Jinghang Zhang från Flow Cytometry Core för teknisk support. Vi bekräftar stöd från National Institutes of Health (NIH) (DK110426) och Pilot och bidrag genomförbarhet från Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541), och New York Fetma Research Center (DK026687) (allt till KS). Vi vill också tacka Albert Einstein Cancer Center (CA013330) för kärnstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
