Summary
Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.
Abstract
Bruin en beige vet zijn gespecialiseerde vetweefsels die energie voor thermogenese afvoeren door UCP1 (Uncoupling Protein-1)-afhankelijke en onafhankelijke trajecten. Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Recente studies hebben echter aangetoond dat er meerdere subtypen of subpopulaties zijn die verschillend zijn in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptoom. Ondanks de vooruitgang in eencellige genomics, onbevooroordeelde afbraak van vetweefsel in cellulaire subtypes is uitdagend vanwege de fragiele aard van lipide gevulde adipocyten. Het gepresenteerde protocol werd ontwikkeld om deze obstakels te omzeilen door effectieve isolatie van enkele kernen van vetweefsel voor downstreamtoepassingen, waaronder RNA-sequencing. Cellulaire heterogeniteit kan vervolgens worden geanalyseerd door RNA-sequencing en bio-informatica-analyses.
Introduction
Studies hebben aangetoond dat bruin vetweefsel (BBT) een opmerkelijke capaciteit heeft om energie te verdrijven. Er bestaan twee soorten thermogene adipocyten met verschillende ontwikkelingskenmerken bij zowel knaagdieren als mensen: beige adipocyten en klassieke bruine adipocyten. Terwijl klassieke bruine adipocyten zich meestal in intercapulaire BAT-depots bevinden, komen beige adipocyten sporadisch naar voren in wit vetweefsel (WAT) in reactie op bepaalde fysiologische signalen, zoals chronische koude blootstelling, een proces dat wordt aangeduid als "bruinen" of "beiging". Door het gebruik van geavanceerde beeldvorming is het nu duidelijk dat volwassen mensen aanzienlijke depots van UCP1+ BAT hebben, vooral in supraclaviculaire regio1,2,3,4. De hoeveelheid volwassen menselijke BAT omgekeerd correleert met adipositeit en kan worden verhoogd door externe signalen, zoals chronische blootstelling aan koude5,,6 of β3-adrenerge receptor agonist7. Door baten gemedieerde energie-uitgaven kunnen een levensvatbare aanpak bieden om obesitas te bestrijden.
Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Studies hebben echter het bestaan van meerdere subtypen of subpopulaties aan het licht gebracht die verschillen in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptome8,9,10. Bijvoorbeeld, een soort beige adipocyte die bij voorkeur glucose gebruikt voor thermogenese, de g-beige adipocyte, werd onlangs beschreven10. Het onvolledige begrip van celtypen in bruin en beige vetweefsel en het ontbreken van specifieke markers vormen een kritieke barrière voor het bestuderen van hun biologische functies.
Traditionele methoden voor het isoleren van subpopulaties van cellen zijn gebaseerd op expressie van slechts een paar bekende markergenen. Recente vooruitgang in eencellige genomics maakt het gebruik van wereldwijde genexpressiegegevens van enkele cellen mogelijk om een onbevooroordeelde schatting te geven van het aantal subpopulaties in een weefsel. Het uiteindelijke doel van dit protocol is om alle vetweefsel subtypes te bepalen onder verschillende thermogene stimuli op een eencellige resolutie. In tegenstelling tot andere weefsels en celtypen is het bepalen van cellulaire subtypes van vetweefsel een uitdaging vanwege de kwetsbaarheid van met lipide gevulde adipocyten. Dit papier introduceert een robuust protocol om enkele kernen te isoleren van vetweefsel voor downstream-toepassing op snRNA-sequencing. Belangrijk is dat recente literatuur die goed overeenkomende single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) datasets te vergelijken bleek dat snRNA-seq is vergelijkbaar met scRNA-seq in celtype detectie, en superieur in cellulaire dekking voor een complex weefsel als de hersenen11. Dit protocol combineert een dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode geoptimaliseerd voor vetweefsel door Rosen et al.12 met een kern "cleanup" stap met een MoFlo XDP High Speed Sorter. Zoals te zien in de representatieve resultaten, een analyse van 7.500 enkele kernen van de muis interscapulaire bruin vetweefsel geïdentificeerd meerdere celtypes binnen schijnbaar homogene bruine adipocyten. Over het algemeen kan dit eenvoudige en robuuste protocol worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyten en vet-ingezeten cellen, identificatie van subtype-specifieke marker genen, en ontwikkeling fenotypering van vet-selectieve knock-out / transgene muizen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Albert Einstein College of Medicine.
1. Voorbereiding van weefselvertering en lysebuffers
- Bereid weefselvertering buffer.
- Bereid ~ 1 mL digestiebuffer voor elke gram vetweefsel voor.
- Weeg 1,5 U/mL collagenase D en 2,4 U/mL dispase II af en voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
- Bereid de preparaatbuffer voor (NPB).
- Bereid 10 mM HEPES, 1,5 m magnesiumchloride, 10 mM kaliumchloride, 250 mM sacharose en 0,1% NP-40 in nuclease-vrij water. Meng goed. Sucrose kan meer tijd in beslag nemen om op te lossen dan de andere componenten.
- Bereid 0,5% runderserum albumine (BSA) oplossing voor.
- Bereid 0,5% BSA voor in PBS met EDTA. Het wordt aanbevolen om steriel gefilterde celkweekkwaliteit PBS te gebruiken (zie tabel met materialen).
2. Enzymatische vertering van vetweefsel
- Dissecten muizen om vetweefsel te extraheren volgens Aune et al.13. Verzamel geïsoleerd weefsel in een schaal met PBS. Breng het weefsel naar een papieren handdoek om droog te deppen. Plaats het weefsel vervolgens in een schone schaal.
- Voeg calciumchloride toe aan de spijsverteringsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM. Voeg een klein volume van de spijsvertering buffer aan de schotel en grondig gehakt het vetweefsel. Het vereiste volume van de spijsverteringsbuffer zal gebaseerd zijn op de hoeveelheid geïsoleerd weefsel. Meestal ~ 1 mL of minder wordt gebruikt.
- Voeg ongeveer de helft van de hoeveelheid voorbereide spijsverteringsbuffer (bijvoorbeeld ~ 10 mL voor vijf muizen) toe aan het gehakte weefsel. Breng het monster met behulp van een serologische pipet over op een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL. Voeg de resterende hoeveelheid buffer toe om de schotel te wassen en breng over op de buis van 50 mL met het monster. Pipet meerdere keren op en neer. Dan incubeer met schudden bij 200-210 rpm bij 37 °C gedurende 12-15 min.
3. Adipocyte isolatie
- Voeg na incubatie 0,5% BSA toe met een verhouding van 1:1 aan het monster. Meng goed door pipetting op en neer meerdere malen. Centrifugeren het monster op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de stromale vasculaire fractie (SVF) te laten draaien. De adipocytenfractie blijft in de bovenste laag van het monster.
- Plaats een 40 μm celfilter bovenop een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL en filter het monster, verzamel de bovenste laag en laat de SVF achter aan de onderkant van de buis. Breng de bovenste laag (adipocytefractie) naar een nieuwe buis door het filter ondersteboven over de buis te draaien en 0,5% BSA te gebruiken om het filter om te keren en het monster in de buis te verzamelen.
- Breng het totale volume van 0,5% BSA op 10-15 mL op basis van de steekproefgrootte en pipet op en neer met een serologische pipet of schud kort op en neer om het monster te mengen. Centrifuge het monster opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten op RT.
4. Kernisolatie
- Gebruik een brede pipettip en breng de toplaag van het monster voorzichtig over naar een 100 μm celfilter dat bovenop een nieuwe voorgebogen buis op ijs is geplaatst, waardoor eventuele resterende SVF achterblijft.
- Spoel/was het filter met voldoende NPB en gooi het filter weg. Vanaf deze stap naar voren hebben het monster op ijs zo vaak mogelijk en werk snel om lekkende en / of ongezonde kernen te voorkomen. Het is nuttig om prechill microcentrifuge buizen worden gebruikt in toekomstige stappen op ijs.
- Plaats het monster niet meer dan 2 min op ijs met intermitterende zachte omkering van de buis om te mengen. De incubatietijd op ijs moet worden geoptimaliseerd voor de grootte van de monsters en het type adipocyten. Centrifuge bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL npb. Breng het monster over naar een schone microcentrifugebuis. Tijdens het overbrengen, vermijd het aanraken van de muren van de buis, die puin en lipide bevatten. Voeg 0,6 U/μL RNase-remmer toe aan het monster en meng. Centrifuge opnieuw bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: De snelheid en tijd van centrifugatie moeten bij deze stap worden verlaagd voor kleinere monsters. - Verwijder de supernatant en resuspend in 1 mL nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibitor).
- Dubbel filter in een schone buis met stapelbare 30 μm filters. Wasfilter met een klein volume (~300 μL) van Nuclei Wash Buffer. U ook voor kleinere monsters een filter van 30 μm gebruiken dat in een microcentrifugebuis past en er rechtstreeks in filteren.
- Bevestig een succesvolle isolatie van gezonde kernen.
- Vlek een kleine aliquot van het monster met trypan en gebruik een geautomatiseerde cel teller om de gemiddelde dode grootte en procent dode cellen te beoordelen. De gemiddelde dode grootte voor een monster dat meestal kernen bevat, moet variëren tussen 7-10 μm. De grootte van de kernen is meestal ongeveer 8 μm.
- Vlek een kleine aliquot van het monster met DAPI en onderzoeken onder een microscoop met een 20x doelstelling of hoger. Het nucleaire membraan moet intact zijn en de kernen moeten rond zijn.
5. FACS cleanup en kernen concentratie stap
- Ga onmiddellijk naar de FACS-stap om kernen op te ruimen en overtollig vuil te verwijderen. De opvangbuffer moet Nuclei Wash Buffer bevatten. Tijdens FACS wordt de buffer verdund. Het voorbereiden van een hogere concentratie BSA en RNase remmer om rekening te houden met verdunning tijdens het sorteren is nuttig. Het FACS-opvangblok moet in de koelmodus staan.
- Na het sorteren van de kernen, centrifuge op 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C om het monster te concentreren. Reconstitueereren in een passend volume van Nuclei Wash Buffer om een concentratie van 500-1.500 kernen/μL te bereiken. Probeer niet om alle supernatant te verwijderen. Hierdoor zullen kernen verloren gaan.
- Gebruik een hemocytometer en een DAPI bevlekte aliquot voor een laatste telling en visualiseer de kernen. Ga dan onmiddellijk verder met snRNA-seq volgens het protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ongesorteerde adipocytekernen bevatten puin en doubletten die ruis en een hoge achtergrond creëren in downstream eencellige RNA-sequencing. De representatieve FACS-poortstrategie is te zien in figuur 1. De kernen werden eerst geselecteerd op basis van forward scatter (FSC) en side scatter (SSC)(A),waarna alleen singlets werden geselecteerd op basis van de combinatie van breedte en hoogten van SSC(B). Ten slotte werden alleen DAPI-positieve gebeurtenissen geselecteerd en gesorteerd in de verzamelbuffer(C). Deze workflow biedt zeer gezuiverde enkele kernen met geminimaliseerde nucleaire aggregaten en cellulair puin(figuur 2).
Om de integriteit van de gesorteerde kernen te bevestigen, werd een kleine aliquot van het monster geïnspecteerd door microscoop na DAPI-kleuring. Het kernmembraan moet intact zijn en de kernen moeten rond zijn (figuur 2B). Om het succes van de zuivering te bevestigen, wordt het ook aanbevolen om supernatant (d.w.z. verzamelingsbuffer) te verzamelen na centrifugatie en real-time qRT-PCR van een markergen uit te voeren. Het gebruik van een primerset (primersequenties in tabel 1) ontworpen om ontluikende, intron-bevattende UCP1 te versterken, bevestigde dat de supernatant van gesorteerde kernen geen detecteerbaar niveau van ontluikende Ucp1 mRNA (figuur 3) bevatte. Deze stap kan worden gedaan voor andere marker genen zeer overvloedig in bruine, beige, of witte adipocyten, zoals Cidea, Pgc1-a, Adipoq, of Fabp4.
Kernen geïsoleerd en bevestigd door middel van dit protocol kan worden onderworpen aan vrijwel elk eencellig niveau genexpressie platform. Het gebruik van het Chroom-platform14 (10x Genomics) bepaalde een transcriptoom van 7.500 kernen uit interscapulair bruin vetweefsel van 8 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen(figuur 4). t-distributed stochastische buurman inbedding (t-SNE) dimensionaliteit vermindering en K-middelen clustering bleek zeven celtypes, waaronder bruine adipocyten, endotheelcellen, muurschildering cellen gekenmerkt door Pdgfrb, adipocyte voorlopers, en immuuncellen. Alle clusters uitgedrukt Fabp4, een pan-adipocyt gen, in verschillende mate (Figuur 4B). Een subgroep van clusters gaf een hoog niveau van Ucp1 mRNA uit, terwijl andere clusters sporadisch Ucp1 uitdrukten (figuur 4A,C). Dit komt overeen met een eerdere studie waaruit blijkt dat interscapulair bruin vetweefsel ten minste twee verschillende populaties bevat met een hoge en lage Ucp1-expressie en thermogene activiteit8,9.
Figuur 1: Representatieve flow cytometrieanalyse van kernen door MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Grootte en granulariteit. (B) Detectie van nucleaire aggregaten en veelvouden. (C) Laatste sorteerpoort selecteren van alleen DAPI-positieve gebeurtenissen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatief beeld van kernen geïsoleerd van bruine adipocyten. (A) Vóór en (B) na moflo XDP sorteren. Witte pijlen in A geven kernen aan zonder een intact membraan. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatief qRT-PCR-resultaat voor geïsoleerde kernen en de supernatant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve 10x chroom snRNA-seq resultaten voor bruine adipocyten geïsoleerd van 8 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen onder RT. (A) t-SNE dimensionaliteit reductie en K-Means clustering voor 7.500 kernen. k = 9. Canonieke markeringen die worden gebruikt voor clusterannotaties worden tussen haakjes weergegeven. bB) mRNA-expressie van Fabp4, een adipocyten-selectieve marker, in A. Wit = geen expressie, rood = hoge expressie. cC) mRNA-expressie van Ucp1, thermogene marker in A. Deze gegevens zijn afkomstig van één experiment. snRNA-seq gegevens die voor deze cijfers werden gebruikt werd gedeponeerd in de Gene Expression Omnibus (GEO) onder superseries toetredingsnummer GSE144720. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gen | Soort(en) | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer |
| Ucp1 (Intron-bevattende) | Muis | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabel 1: Primer sequenties voor real-time qPCR-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een eenvoudige en robuuste methode om enkele kernen te isoleren en vetweefsel heterogeniteit te bestuderen wordt gepresenteerd. Vergeleken met whole tissue RNA sequencing biedt deze workflow een onbevooroordeeld beeld van cellulaire heterogeniteit en populatiespecifieke markers. Dit is significant en innovatief voor de vooruitgang van adipocyte biologie, moleculair metabolisme, en zwaarlijvigheidsonderzoek.
Dit protocol is speciaal geoptimaliseerd voor downstream toepassing van snRNA-seq. De "cleanup" stap om isolatie van gezonde kernen te bereiken met de MoFlo XDP High Speed Sorter verwijdert volledig puin en aggregaten uit de ruwe suspensie met behoud van nucleaire membraan integriteit. Daarom verhoogt dit de opname-efficiëntie in de druppelvorming en herstelt duizenden single-nuclei transcriptomen van slechts één run zonder verlies van het aantal gedetecteerde genen. Naast druppelvormige eencellige platforms, die een hoger aantal onderzochte enkele kernen of cellen bieden, kunnen op sorteerder gebaseerde microplate en FluidigmC1-platforms 15 ook worden gebruikt om een grotere resolutie en dekking van het transcriptome16te verkrijgen. Omdat deze workflow kernen van hoge kwaliteit biedt, kunnen assays voor transposase-toegankelijke chromatine met behulp van sequencing (d.w.z. ATAC-sequencing) ook worden uitgevoerd met minimale wijzigingen in het bestaande scATAC-seq-protocol17.
Een beperking van dit protocol is het verlies van informatie uit het verwijderen van niet-nucleaire compartimenten, zoals de cytosol en cellulair membraan. Bijvoorbeeld, opkomende multimodale eencellige analyses18,19 die tegelijkertijd celmemban eiwitexpressie meten en het transcriptoom kan niet worden toegepast op dit protocol.
Het toekomstige doel is om dit protocol te combineren met nuclei multiplexing met behulp van barcodes antilichamen20. Gesorteerde kernen uit verschillende vetweefsels onder verschillende experimentele omstandigheden zullen worden gebarcoded en samengevoegd met behulp van een antinucleaire porie complex antilichaam en snRNA-seq zal worden uitgevoerd. Door deze barcodes naast het nucleaire transcriptoom te sequencingen, kunnen elke kern aan het oorspronkelijke monster worden toegewezen, kunnen cross-sample multiplets duidelijk worden geïdentificeerd en druppel-gebaseerde systemen kunnen worden "super-loaded" voor een aanzienlijke kostenreductie per kern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We willen David Reynolds van de Albert Einstein Genomics kern en Jinghang Zhang van de Flow Cytometry Core bedanken voor technische ondersteuning. We erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (DK110426) en Pilot and Feasibility Grants van het Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) en New York Obesity Research Center (DK026687) (allemaal naar K.S.). We willen ook Albert Einstein Cancer Center (CA013330) bedanken voor de kernondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
