甲基化RNA免疫沉淀检测是一种基于抗体的方法,用于丰富甲基化RNA片段。再加上深度测序,它导致识别承载m5C修改的抄本。
RNA上的二次碱基修饰(如m5C)会影响改性RNA分子的结构和功能。甲基化RNA免疫沉淀和测序(MeRIP-seq)是一种旨在丰富甲基化RNA并最终识别修改后成绩单的方法。简言之,声波化RNA与5甲基化细胞素的抗体一起孵育,并在蛋白质G珠的帮助下沉淀。然后对浓缩碎片进行测序,并根据读数分布和峰值检测绘制潜在的甲基化位点。MeRIP可以应用于任何有机体,因为它不需要任何先前的序列或修改酶知识。此外,除了碎片外,RNA不接受任何其他化学或温度处理。然而,MeRIP-seq不像其他方法那样提供甲基化位点的单核苷酸预测,尽管甲基化区域可以缩小到几个核苷酸。使用不同的改性特异性抗体,可以根据RNA上存在的不同碱基修饰对MeRIP进行调整,从而扩展此方法的可能应用。
在所有三个生命王国中,RNA物种都经过了转录后修改,对这些功能相关的生化修饰的研究被称为”表征学”。Epitranscript经济学是一个不断增长的领域,正在开发各种方法来研究和绘制RNA分子的修饰图(在1,2中回顾)。已发现一百多个RNA修改,检测到在rRNA,tRNA,其他ncRNA,以及mRNA3,4。虽然在tRNA和rNA中化学多样化的转录后修改的存在和功能被广泛研究5,6,7,8,直到最近才有mRNA修改的特点。在植物中,许多mRNA修改已被确定至今,包括m7G在帽结构9,m1A10,hm5C11,12,和尿化13。然而,只有米6A10,14,15,米5C11,16,17,和伪尿丁18被映射在阿拉比多普西斯全转录。后转录mRNA基地修改涉及几个发展过程19,20。
表皮经济学中最常用的方法之一是甲基化RNA免疫沉淀,以及深度测序(MeRIP-seq)。MeRIP-seq于2012年开发,以研究哺乳动物细胞21,22的m6A。它需要使用抗体进行所需的修改,旨在丰富携带改性核苷酸的RNA片段。之后通常进行深度测序,以识别和映射丰富的碎片或定量 PCR 以验证特定的 RNA 目标。MeRIP 的准确性基于抗体的特异性,以识别经过类似修改的改性核苷酸(例如,m 5 C 和 hm5C11,23)。除了m6A外,MeRIP-seq还应用于研究11、17、23、24、25等多种生物体的m1A和m5CRNA甲基化。
细胞素在第五碳位(m5C)的甲基化是最普遍的DNA修饰26,27和最常见的RNA修饰之一太3,4。虽然m5C在1975年28年在真核mRNA中被发现,但最近才有研究重点绘制修改转录全,在编码和非编码RNA11,16,17,23,29,30,31,32,33,34。
m5C RNA 研究中使用的替代方法包括将非甲基化细胞氨酸化学转化为尿素(双硫化物测序)和基于已知RNA细胞氨酸甲基转移酶与其RNA靶点不可逆转的结合的免疫沉淀检测(miCLIP,aza-IP)。简言之,双硫化物测序利用了5甲基化细胞素的特性,对二硫化钠治疗具有抗药性,这种治疗将未修饰的细胞素去除尿素。该方法最初是为DNA开发的,但也适用于RNA,许多研究都选择了这种方法来检测RNA16、23、29、32、34、35中的m 5C位点。miCLIP 和 aza-IP 都需要以前对 RNA 细胞氨酸甲基转移酶的了解和各自抗体的使用。在miCLIP(甲基化单核苷酸分辨率交叉链接和免疫沉淀)的情况下,甲基转移酶携带单个氨基酸突变,使其与RNA基板结合,但不能释放30。在 aza-IP (5-阿扎西丁 – 中介RNA免疫预测) 中,当 RNA 聚合酶由 RNA 聚合酶结合到目标 RNA 分子31时,5-azaC 核苷和 RNA 细胞素甲基转移酶之间形成不可逆转的结合。
这三种方法的主要优点是允许单核苷酸分辨率映射m5C。此外,miCLIP 和 aza-IP 提供有关选定的 RNA 细胞氨酸甲基转移酶的具体目标的信息,深入破译转录后 RNA 修改的机制和作用。但是,MeRIP-seq 方法可以在不需要任何事先知识的情况下识别全转录体 m5C 区域,并避免苛刻的化学和温度条件,例如双硫酸盐处理或 5-azaC 的孵化。梅里普和双硫酸盐测序都可以通过二级RNA结构36抑制。免疫沉淀前 MeRIP 检测中包含的碎片步骤旨在促进抗体结合并增加 m5C 识别的分辨率。
另一个值得一提的方法是RNA核苷的质谱(MS)。MS 可以在 DNA 和 RNA 上检测和区分任何类型的修饰。简言之,RNA被提取和DNase消化,然后脱盐和消化到单核苷酸。RNA核苷由质谱仪分析。这种方法可用于量化每个修改的水平,它不依赖于抗体或化学转换。然而,一个主要缺点是,它提供了大量有关RNA修改存在的信息。为了绘制修改图,MS 需要与 RNase 消化和特定RNA分子的测序信息相结合,例如人类 tRNALeu(CAA)37。
在这里,我们描述和讨论梅里普测定用于研究m5C RNA甲基化在阿拉比多普西斯17。
RNA携带超过一百个不同的基础修改4,形成表征44。这些修改增加了一层对翻译和信号的监管(在5、6、8、20、45、46中审查)。早期的研究能够检测RNA28,47的转录后修改的存在,但具体的修改RNA需要确定,以了解表皮学的作用。MeRIP被设计成一种绘制RNA甲基化位点图的方法,全谱21,22。它可以适应任何修改,如果一个特定的抗体可用。
此协议的主要优点是,对于RNA和用户来说相对简单、安全(例如,5-azaC对植物和人类具有剧毒),不需要序列或修改酶信息。此外,与不包含浓缩步骤的双硫酸盐测序不同,IP 对甲基化RNA的浓缩增加了检测低丰度 mRNA 的机会。当执行两轮连续的梅里普时,含有甲基化位点的RNA片段的浓缩量进一步增加22。MeRIP的局限性之一,特别是应用于mRNA甲基化研究时,是作为检测输入所需的大量RNA。核糖核酸消耗(或聚(A)浓缩)步骤将减少严重改性核糖体RNA造成的背景,但它可去除总RNA的90%以上。DNA也必须完全去除,因为它富含5甲基化细胞素。另一个缺点是甲基化精确位置的分辨率较低。用抗体孵化前RNA的声波有助于朝这个方向发展,将含有改性剂的区域缩小到100-200核苷酸。当 MeRIP 与深度测序相结合时,m5C 站点预测的分辨率会随着测序读数形成围绕潜在甲基化站点的高斯分布而增加。此外,抗体的特异性需要在检测前得到确认(例如,用RNA点斑点检测,用改性核苷酸合成的寡头进行),然而,抗体在多大程度上实际上可以区分密切相关的修饰(例如,m6A 和 m6Am)是该领域48、49中的一个争论点。此外,高度结构化的RNA可能会干扰抗体-抗原相互作用,另一个限制主要通过在IP之前RNA的分裂和自然来解决。相反,同样受二次结构影响的双硫酸盐测序不包括碎片步骤,这可能是造成m5C位点与双硫酸盐测序16和MeRIP-seq11、17预测的mRNA之间差异的原因之一。其他细胞氨酸修饰(例如,hm5C)也对双硫酸盐介质脱氨35具有抗药性。
MeRIP-seq 的修改包括交叉链接步骤, 要么引入光活性核糖核苷酸(光交叉链接辅助m6A-seq,PA-m6A-seq 50),要么使用紫外线在IP(miCLIP49,不同于导言30中描述的miCLIP,但也与单核苷酸分辨率不同)后创建抗体-RNA交叉链路。将来,随着有关RNA甲基化的知识的积累,基于甲基化出现的修改酶和/或协商一致的序列,更有针对性的方法可能更可取。读取蛋白的识别对于理解转录后修改的分子和信号功能至关重要。Nanopore 测序技术已经允许在没有事先处理 RNA17 的情况下直接识别改性核苷酸,但在序列深度和生物信息分析方面仍有改进的余地。总体而言,MeRIP-seq 目前是识别甲基化RNA成绩单的既定、可靠和公正的方法。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了E.S的IMPS博士津贴、EMBO对V.P.的长期研究金和对F.K.的MPI-MPP内部资金的支持。 这项工作的一部分也通过PLAMORF提供资金,该项目已获得欧洲研究理事会(ERC)根据欧洲联盟的Horizan 2020研究与创新方案(赠款协议第810131号)提供资金。作者要感谢费德里科·阿佩尔特对手稿的生物信息分析和评论,以及马蒂厄·巴欣和阿米拉·克拉姆迪的生物信息分析。
α‐m5C antibody | ZymoResearch | A3001 (discontinued), A3002 available | Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available |
Chip and reagents for capillary electrophoresis | Agilent | 5067-1511 | RNA 6000 Nano kit |
Dnase | Ambion | AM1907 | TURBO DNA-free kit |
Co-precipitant of nucleic acids | Ambion | AM9515 | Glycoblue, 15 mg/mL |
In vitro transcription kit | Promega | P1300 | T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System |
Low-binding reaction tubes | Kisker Biotech | G017 | 1.7 ml microcentrifuge tubes |
Protein G magnetic beads | Invitrogen | 10003D | Dynabeads Protein G |
Proteinase K | Ambion | AM2546 | 20mg/mL stock solution, RNA grade |
RNase inhibitor | Promega | N2615 | RNasin Plus 40 U/μl |
rRNA removal kit | Epicentre | RZPL11016 | Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf) |
Sonication tubes | Covaris | 520045 | microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm |
RNA extraction reagent | Ambion | 15596018 | TRIzol reagent |
Equipment | |||
Capillary electrophoresis machine | Agilent | G2939BA | 2100 Bioanalyzer System |
Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | DynaMag-2 |
Microentrifuge | Eppendorf | discontinued | 5417R model |
Rotator | Benchmark | R4040 | RotoBot Mini |
Sonicator | Covaris | 500217 | S220 Focused-ultrasonicator |
Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONEC-W | NanoDrop OneC |
Waterbath | GFL | 1012 | 1012 Incubation bath |