Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Drosophila-modell for å studere sårindusert polyploidisering

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61252
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Biology Department, Boston College, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering and Kathryn W. Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory, University of Maine
* These authors contributed equally

Summary

Sårindusert polyploidisering er en konservert vevreparasjonsstrategi der cellene vokser i størrelse i stedet for å dele for å kompensere for celletap. Her er en detaljert protokoll om hvordan du bruker fruktfluen som modell for å måle ploidy og dens genetiske regulering i epitelsårreparasjon.

Abstract

Polyploidy er et hyppig fenomen hvis innvirkning på organismehelse og sykdom fortsatt er dårlig forstått. En celle er definert som polyploid hvis den inneholder mer enn diploid kopi av kromosomene, som er et resultat av endoreplication eller cellefusjon. I vevreparasjon har sårindusert polyploidisering (WIP) vist seg å være en bevart helbredende strategi fra fruktfluer til virveldyr. WIP har flere fordeler fremfor cellespredning, inkludert resistens mot onkogen vekst og gentoksisk stress. Utfordringen har vært å identifisere hvorfor polyploidceller oppstår og hvordan disse unike cellene fungerer. Gitt er en detaljert protokoll for å studere VIA i voksen frukt fly epitel hvor polyploid celler genereres innen 2 dager etter en punktering sår. Ved å dra nytte av D. melanogasters omfattende genetiske verktøysett, har genene som kreves for å initiere og regulere VIA, inkludert Myc, begynt å bli identifisert. Fortsatt studier ved hjelp av denne metoden kan avsløre hvordan andre genetiske og fysiologiske variabler, inkludert kjønn, kosthold og alder regulerer og påvirker WIP funksjon.

Introduction

Drosophila melanogaster er et attraktivt modellsystem for å studere cellulære og molekylære mekanismer for epitelsårreparasjon. Som hos pattedyr er vevsreparasjonsmekanismene som brukes, avhengig av både vevet og utviklingsstadiet. Scarless sårheling oppstår i fruktfluembryoet hvor en actomyosin "veskestreng" dannes ved epitelens forkant slik at såret sømløst kanlukke 1,2. Post-embryonal sårheling i larver, pupper og voksen fruktfluer resulterer i ekstracellulær matriseombygging, melanin arrdannelse og epitelcellevekst3,,4,,5,,6. Epitelcellene øker i størrelse ved cellefusjon og endocycle, en ufullstendig cellesyklus som omgår mitose3,,4,,7,,8. Som et resultat kompenseres celletap av polyploid cellevekst i stedet for celledeling. Den voksne fly hindgut, midgut, og follikulær epitel også stole på polyploid cellevekst for å kompensere for celletap etter vevsskade9,10,11.

Polyploidy er et velkjent aspekt ved organismeutvikling i planter og insekter, men i de siste årene har det blitt tydeligere at polyploidy er en konservert vevreparasjonsstrategi i virveldyr12. Sebrafisken, som har kapasitet til å regenerere sitt hjerte, er avhengig av polyploid cellevekst for å helbrede skadet epicardium13. Polyploidy bidrar også til pattedyr leverregenerering og nyre tubule epitel reparasjon etter akutt skade14,15. I disse eksemplene genereres polyploidceller ved endoreplisering via enten endocycle eller endomitosis, noe som resulterer i en binucleated celle på grunn av en blokk i cytokinese12. Gåten er grunnen til at polyploidceller oppstår under sårreparasjon og hvordan polyploidy påvirker vevsfunksjonen. Nyere studier har gitt ny innsikt i spørsmålet om polyploidy gir en helbredende fordel eller ulempe. I sebrafisk epicardium, polyploidy forbedret hastigheten på sårheling13. I D. melanogaster hindgut og pattedyr leveren, polyploidy ble funnet å være beskyttende mot onkogen vekst11,14. I voksen fly epitel ble det nylig funnet at polyploidy muliggjør sårreparasjon i nærvær av gentoksisk stress16. Endoreplication er motstandsdyktig mot DNA-skade, slik at sårheling når cellespredning ellers ville bli kompromittert17. For kardiomyocytter i mus og sebrafisk hjerter, men polyploidy bremser healing, noe som resulterer i forbedretarrdannelse 18,19. Derfor, avhengig av organ og / eller celletype, polyploidy kan være en gunstig eller skadelig vev reparasjon strategi. Tilgjengeligheten av D. melanogaster genetikk kombinert med analyse av sårindusert polyploidization (WIP) respons gjør det til et ideelt modellsystem for å belyse molekylære og cellulære mekanismer som styrer denne sårhelingsstrategien.

Her presenterer vi en protokoll for analyse av VIA i det voksne D. melanogaster epitelet. Inkludert er instruksjoner for fruktflueskade, disseksjon, immunstaining, montering, avbildning og analyse av re-epitelisering, cellefusjon og endoreplisering (ploidy). Bilde- og knepanalysen kan også tilpasses andre modeller for å teste om VIA oppstår. Det bør bemerkes at med en økning i kjernefysisk DNA-innhold er det ofte en tilsvarende økning i kjernefysisk størrelse. Det er imidlertid mange eksempler i biologi hvor kjernefysisk størrelse ikke gjenspeiler en tilsvarende endring i ploidy20. Enda mer forsiktighet bør utvises ved tolkning av kjernefysisk størrelse i sammenheng med et sårmiljø der celler ofte vil spre seg eller strekke seg for å dekke sårstedet. Derfor er det eneste definitive endringsbeviset i ploidy å måle DNA-innhold ved denne metoden (eller andre, for eksempel hele genomsekvensering)21. Denne metoden øker egnetheten til den voksne D. melanogaster abdominal epitel som en modell for å studere rollen og reguleringen av polyploidy i sårreparasjon.

Protocol

1. Iscenesettelse og såret av voksne fruktfluer

  1. Velg D. melanogaster-belastning (det vil si epi-Gal4/UAS-belastning, se Materialtabell).
    MERK: Her brukes Gal4/UAS-systemet til å aktivere epitelspesifikt genuttrykk (epi-Gal4) av et gen eller RNAi kodet nedstrøms av UAS. Denne studien bruker fluorescerende membranprotein (UAS-Cd8.mRFP), mitotisk induktor (UAS-fzrRNAi,UAS-stg) og WIP-hemmer (UAS-E2F1RNAi; UAS-RacDN).
  2. Samle to hetteglass med 10-15 nylukkede kvinnelige fruktfluer hver og alder på ferske mat ampuller ved 25 °C til 3-5 dager gammel. Ett hetteglass vil fungere som uskadet kontroll og det andre hetteglasset vil bli såret som beskrevet nedenfor. De kvinnelige fluene skal opprettholdes med menn (~5/hetteglass).
  3. For å såre fluene, monter flere pin holdere hver med en enkelt 0, 10 mm rustfritt stål pin. Kontroller at den skarpe enden av pinnen vender ut. Pins kan enkelt bøye eller chip etter punktering fly og hekta eller skadede pinner skal kastes.
  4. Bedøve alderen kvinnelig frukt flyr på en CO2-flypad under et stereomikroskop og justere dem i en rad ved hjelp av en pensel. Bruk vernebriller, hold pinholderen i den ene hånden og tang i den andre, bruk tang til å plassere en flue med ventral mage vendt opp.
  5. Punktering av den voksne kvinnen flyr innenfor epitelte pleurite-regionen i tergite A4 på hver side av ventrale midline sternites (figur 1A). Punktering av denne ventrale regionen gir optimal plass vekk fra disseksjonsstedene hvor vevskanter vil bli revet av mekanisk behandling.
  6. Returner sårede fluer til mat hetteglasset og alder til ønsket dag etter skade (dpi). Epitel sårheling starter ved 1 dpi og slutter med 3 dpi. Endoreplication topper på 2 dpi, noe som er ideelt for EdU-analysen (avsnitt 4, figur 2).

2. Fly abdominal disseksjon

MERK: I løpet av dette trinnet er det viktig å unngå å berøre ventral abdominalvevet med disseksjonsverktøyene fordi det vil kompromittere epitelets integritet.

  1. Få tak i alle nødvendige materialer for disseksjon: Graces løsning, tang, Vannas vårsaks, 0,10 mm pinner, dissekeringsplater, 9 brønnglassdisseksjonsfat, fikserende oppløsning (4 % paraformaldehyd i 1x PBS), 1x PBS, våtservietter, pipetter og tupper for 30 μm og hansker (se Materialtabell).
  2. Bekreft at fluer ble skadet ved å bedøve sårede fluer på en CO2-flypad under et stereomikroskop og se etter tilstedeværelsen av sårarret (det vil si et melaninpunkt på magen, se figur 1B). Kast eventuelle fluer fra den eksperimentelle gruppen som ikke ble vellykket såret.
  3. For å starte disseksjon, fyll en brønn av en 9 brønnglass disseksjonsrett med Graces løsning. Bruk et par tang til å gripe en såret kvinnelig fly ved dorsal siden av thorax og senke flyet i brønnen som inneholder Graces løsning.
  4. Ved hjelp av tang i motsatt hånd uten å slippe thoraxen, punkter ryggsekken under tergite A6 og trekk skjellaget av den bakre enden av fruktfluen. De indre organene (eggstokk og tarm) vil vanligvis komme ut på dette trinnet. Hvis ikke, trykk forsiktig på dorsalsiden av magen med tangene for å klemme ut de gjenværende organene og kast i en tom brønn.
  5. Smekk av hele magen ved thoraxkrysset over tergite A2 ved hjelp av tangen og overfør magen til en tom brønn som inneholder ~ 100 μL av Graces løsning.
  6. Gjenta trinn 2.3-2.5 til alle flymagene er dissekert.
  7. Reduser volumet av Graces løsning til 30 μL i brønnen som inneholder samlede, dissekerte underliv.
  8. Filet magene åpne ved å plassere magen på dorsalsiden med tangen i den ene hånden og deretter sette inn det nederste bladet av Vannas vårsaks i bukhulen med den andre hånden. Skjær langs den dorsale midtlinjen til magen er helt åpnet, noe som kan kreve opptil tre kutt (figur 1C, 1D).
  9. Sett opp en tørr disseksjonsplate med fire 0,10 mm pinner per bukmonteringsområde. Hver 35 mm disseksjonsplate kan passe opp til syv monteringsområder. Pipette 30 μL av Graces løsning på hvert monteringsområde og overfør en filetet mage til hver dråpe.
  10. Fest filetmagene til fatet på de fire dorsale hjørnene (figur 1E). Sørg for at vevet ligger flatt uten å rive eller overstretching magevevet.
  11. For å fikse vevet, pipette av Grace løsning og legge 30 μL av fikse løsning til festet magen.
    FORSIKTIG: Bruk hansker under håndtering av løsningsløsningen, da paraformaldehyd er giftig.
  12. Gjenta trinn 2.10-2.11 til alle fileterte underliv er festet på disseksjonsplaten.
  13. Plasser en tapeetikett på bunnen av hver tallerken for å markere hver kontroll og eksperimentell gruppe. Fiks prøver i 30-60 min ved romtemperatur (RT).
  14. Vask av løsning ved å pipettering på 1,5 ml 1x PBS til hver plate. Kast løsning og plast i egnede væske- eller tørrbeholdere for kjemisk avfall i henhold til institusjonelle retningslinjer.
  15. Vaskeplater 2x med 1,5 ml 1x PBS og lagre fast vev dekket i 1,5 ml 1x PBS i en plastbeholder med lokk. Tilsett et lag med fuktig papirhåndkle til bunnen av beholderen og oppbevar prøvene ved 4 °C til de er klare til å vaksinere innen 1 uke etter disseksjon.

3. Immunofluorescence

  1. Nybakte reagenser (se Materialovertred):vaskebufferløsning (0,3 % Triton X 100, 0,3 % BSA i 1x PBS). Rester av vaskebufferen kan lagres ved 4 °C og brukes i løpet av den 2-dagers fargeprotokollen. Forbered nok primær antistoffløsning per analyse (figur 2) ved hjelp av Anti-FasIII (1:50 mus anti-Fasciclin-III) i vaskebuffer med enten anti-Grh (1:300 affinitet renset kanin anti-Grainyhead8) eller anti-RFP (1:1,000 kanin anti-RFP). Primære antistoffløsninger kan lagres ved 4 °C og brukes på flere ganger til signalet reduseres betydelig.
  2. Gjennomsyre vev ved å pipettering av 1x PBS, legge til 1,5 ml vaskebuffer, og inkubere i minst 30 min på en orbital shaker (80 rpm) ved RT.
  3. Fjern vaskebufferen og flekkvevet over natten med 1,5 ml primær antistoffløsning, inkubering på en orbital shaker (80 o/min) ved 4 °C. Samle den primære antistoffløsningen og lagre i et rør ved 4 °C for fremtidige eksperimenter.
  4. Skyll først prøven raskt med 1x PBS og vask deretter 3x med 1,5 ml vaskebuffer. For hver vask, inkubere prøver ved RT på en orbital shaker i minst 30 min.
  5. Under den siste vasken, forberede den sekundære antistoffløsningen: 1:1,000 esel anti-kanin Alexa 488 eller 568 og 1:1000 geit anti-mus Alexa 488 eller 568 (eller fluoroforer av valget) i vaskebuffer.
  6. Fjern vaskebuffer og flekkvev med 1,5 ml sekundær antistoffløsning. Dekk prøver med aluminiumsfolie og inkuber på en orbital shaker ved RT i 3 timer. Alternativt kan prøver inkuberes over natten ved 4 °C på en orbital shaker.
  7. Vask prøvene ved først å kaste sekundær antistoffoppløsning og skyll deretter prøven raskt med 1x PBS etterfulgt av tre vasker med 1,5 ml vaskebuffer. For hver vask, inkubere prøver ved RT på en orbital shaker i minst 30 min.
  8. Klargjør DAPI-oppløsning ved å fortynne DAPI til 10 μg/ml i vaskebuffer. Etter den endelige vasken, flekkprøver med 1,5 ml DAPI-løsning inkubering ved RT i 30 min.
  9. Kast DAPI-oppløsningen og skyll prøvene 2x i 1,5 ml 1x PBS. Oppbevar farget vev i 1,5 ml 1x PBS i mørket, dekket med aluminiumsfolie, ved 4 °C til det er klart til å monteres på en glasssklie med dekkslipp. Monteringstrinnet skal utføres innen 1 uke.

4. Cellesyklusaktivitet (EdU-analyse)

  1. Lag en 10 mM EdU lagerløsning fra Click-iT kit (se Materials table) ved å oppløse EdU pulver i dH20 og blande i ~ 15 min til den er fullstendig oppløst. Lagerløsningen kan aliquoted (250 μL per rør) og lagres ved -80 °C.
  2. Fôr flyr EdU ved først å fortynne EdU lager til 5 mM i dH2O. Tilsett tørr gjær til løsningen er overskyet og kort virvel å blande. Klipp av en 0,5 ml rørhette og plasser den nederst på hetteglasset med flymat. Skyv hetten inn i maten, så den er stabil.
  3. Bedøve fluene og overføre 3-5 dagers gamle fluer inn i hetteglasset. Trykk fluene til en kant slik at ingen sitter fast i hetten.
  4. Pipette 75 μL gjær-EdU-oppløsning i hetten. Fluer skal mates fersk gjær-EdU-løsning hver dag og overføres til et hetteglass med fersk mat med hette annenhver dag for å sikre at fluene ikke sitter fast i bunnen av hetteglasset.
  5. For å overføre fluer, vend til et nytt hetteglass med en hette, sett fluer i dvale, trykk fluer til den ene siden og legg til fersk gjær-EdU-løsning.
  6. På den tredje dagen, skade fluene og fortsette å mate gjær-EdU til disseksjon ved 2 dpi (Figur 4A). Se protokoll avsnitt 2 for disseksjons- og fikseringsmetoder.
  7. Klargjør EdU-fargereagenser: vaskebuffer (0,3 % Triton X 100, 0,3 % BSA i 1x PBS), permeabiliseringsbuffer (0,5 % Triton X 100 i 1x PBS), blokkeringsbuffer (3 % BSA i 1x PBS) og klargjør reagenser fra EdU-analysesettet (se Materialovertred), inkludert 1x reaksjonsbuffer og 1x reaksjonsbuffer som anvist av produsenten.
  8. Vask prøvene i 1 t, bland ved RT i 1,5 ml vaskebuffer.
  9. Legg til 1,5 ml permeabiliseringsbuffer og inkubere prøver i 20 min.
    MERK: Tin og klargjør reaksjonscocktailløsning med et volum på 500 μL/plate.
  10. Vask prøvene 1x raskt med 1x PBS og deretter 3x raskt med 1 ml blokkeringsbuffer.
  11. Pipette av alle gjenværende blokkerende buffer og tilsett 500 μL reaksjonscocktailløsning per tallerken. Virvle plater for å sikre vev er helt dekket. Inkuber i en skuff i mørket i 1 time ved RT.
  12. Vask prøvene 1x raskt med 1,5 ml blokkeringsbuffer.
  13. Beis med 1,5 ml DAPI-oppløsning på 1:5 000 i vaskebuffer i 30 min.
  14. Vask 2x med 1x PBS raskt, pakk i folie, og oppbevar i mørket ved 4 ° C til klar til å montere prøver innen 3 dager.

5. Monter farget vev

  1. Få tak i alle nødvendige materialer for montering: glasssklier, glassdeksler, klar neglelakk, monteringsmedier, et par tang og kluter.
  2. For å montere farget flyvev løsner du magen fra disseksjonsplaten ved hjelp av tang under stereomikroskopet. Overfør vev til ~ 30 μL monteringsmedier på et glassdeksler ved å forsiktig gripe vevet med tang av sine dorsale flanker, ta vare på å unngå å berøre ventralområdet med tang.
  3. Under stereomikroskopet orienterer bukvevet slik at innsiden vender ned mot dekkslippen (det vil si at den ytre skjellaget /busten vender opp). Trekk de orienterte magene til kanten av mediedråpen ved hjelp av tangen. Overflatespenningen vil bidra til å holde vevet flatt (figur 1F).
    MERK: Det er nyttig for bildebehandling å organisere magene i en kolonne eller rad på dette stadiet.
  4. Merk et glasssklie (det vil si kontroll eller eksperimentell) og plukk opp dekkglasset ved å sakte bringe lysbildet nærmere dekkslippen. Vend skyv og tørk forsiktig med en klut for å fjerne overflødig monteringsmedi.
  5. Forsegle kantene på dekkslippen med klar neglelakk og gjenta for alle gjenværende eksperimentelle grupper. Oppbevar lysbildene i en lysbildeboks ved 4 °C til de er klare til bilde.

6. Bildebehandling og behandling

  1. Bilde fly abdominal sårområdet ved først å finne melanin arr med et konfokal mikroskop (Figur 1B), enten et punkt skanner eller en strukturert belysning (ApoTome) med en 40x olje eller tørt mål.
  2. Kontroller eksponeringen på hver kanal, og sørg for at signalet er under metning. Bildeinnstillingene skal være basert på den lyseste prøvegruppen. Dette er spesielt viktig for ploidy analyse som DAPI kanalen må holde seg i lineær rekkevidde for å nøyaktig måle DNA-innhold.
  3. Ta et komplett z-stack bilde i alle tre kanaler med en optimal avstand på minst 0,50 μm mellom skiver. Lagre tatt bilder og åpne filen i bildeanalyseprogrammet Fiji (også kjent som ImageJ).
  4. For hvert bilde oppretter du en z-stack projeksjon ved hjelp av alternativet Sum of slices for alle kanaler.
  5. Roter bildene etter behov for å sikre at kjernene er stilt opp horisontalt på tvers av bilder (figur 3A og figur 4E).
  6. Beskjær alle bildene til et rektangulært utvalg på 300 μm x 300 μm sentrert rundt sårstedet eller midten av uskadet kontroll. Identifisere området ved å tegne et rektangel og velge Rediger | Valg | Angi. Kontroller at skalerte enheter er i mikron for å sikre at den samme boksen brukes for at alle bilder skal analyseres.

7. Endoreplication (ploidy) analyse

  1. Bruk Fiji til å velge Grh-kanalvinduet og duplisere bildet. Bruk deretter terskelverktøyet til å opprette en maske. Juster terskelen manuelt ved å skyve topplinjen for å minimere bakgrunnen uten at kjernene krymper drastisk (figur 4D).
  2. Hvis en kjerne i Grh-kanalen berører i terskelbildet, bruker du penselverktøyet (2 pikselbredde) i samme farge som bakgrunnen, for å tegne en linje mellom kjernene. Klikk for å bruke 1x når du er ferdig for å generere den endelige masken.
  3. Generer et område av interesse (ROI) kart ved hjelp av Analyser partikler funksjonen: sett størrelse til 5 μm-60 μm for å fange det meste av kjernene uten å inkludere bakgrunnen.
  4. Juster roi-kartet manuelt etter behov i roi-lederen. Slett alle valg som ikke er kjerner, og legg til noen kjerner i listen som ikke ble identifisert ved å skissere kjernen med frihåndsvalgverktøyet og legge den til roi manager (figur 4D).
  5. Velg DAPI-kanalen, og klikk deretter Vis alt i roi manager for å bruke det genererte roi-kartet i Grh-kanalen på DAPI-kanalen.
  6. Slett alle valg der epitelkjerner omriss overlapper med ikke-grafleialkjerner (f.eks. kjerner fra muskel eller fett) fra ROI-kartet. Kornetehode flekker bare epitelkjerner, mens DAPI flekker alle kjerner. Kontroller at hvert disposisjonsvalg bare inneholder én kjerne og sletter eller redigerer valg med mer enn én kjerne. Lagre redigert roi-liste.
  7. Mål området og integrert tetthet av hver epitelkjerne i ROI-kartet ved hjelp av analyseverktøyene på Fiji. Eksporter verdiene til et regnearkprogram.
  8. Mål den gjennomsnittlige bildebakgrunnen ved hjelp av det sirkulære markeringsverktøyet. Tegn tre sirkler som ikke overlapper med noen kjerner i forskjellige områder av DAPI-bildet. Legg til området og integrert tetthet av hver av sirklene i et regnearkprogram for å etablere lysstyrken på bakgrunnsbildet.
  9. Start med å beregne gjennomsnittlig bakgrunn per enhetsområde for hvert bilde ved å dele hver bakgrunn integrert tetthetsverdi med tilsvarende område. Deretter gjennomsnitt de tre integrerte tettheten per område målinger for bildet for å få gjennomsnittlig bakgrunn per enhetsområde.
  10. Deretter beregner du den totale bakgrunnen for hver DAPI-kjerne ved å multiplisere kjerneområdet med gjennomsnittlig bakgrunn per enhetsområde. Den normaliserte DAPI-intensiteten for hver kjerne målt kan deretter beregnes ved å trekke den totale bakgrunnen til hver kjerne fra den målte integrerte tettheten.
  11. Gjennomsnittlig alle normaliserte DAPI-intensitetsverdier fra den uskadede epitelkontrollen. De uskadede epitelkjernene ble tidligere beregnet å ha en ploidy verdi på 2C og kan tjene som en referanse for beregning av ploidy i epitelkjernene fra eksperimentelle forhold8.
  12. Beregn knepet til hver kjerne ved å dele den normaliserte DAPI-intensiteten i hver kjerne med normalisert verdi fra referanse uskadet epitelkontroll (2C), og multipliser deretter verdien med 2 for å tilsvare normalisert knep (C-verdi):
    (Kjernefysisk integrert tetthet - Bakgrunn kjernefysisk integrert tetthet)/Gjennomsnittlig kjernefysisk integrert tetthet (uskadet epitelkjerner = 2C) x 2 = epitel kjernefysisk knep (C)
  13. Grafkjerner med ploidy verdier som en prikk plot, histogrammet, eller gruppert i en bar graf tilsvarende (f.eks. 2C [0,6-2,9C], 4C [3,0-5,9C], 8C [6,0-12,9C], 16C [13,0-24,9C] og >32C [>25.0C] (figur 3F).

Representative Results

En detaljert protokoll er gitt for å bruke D. melanogaster som modell for å studere sårindusert polyploidisering (VIA). Denne sårhelingsmodellen gir mange fordeler fremfor pattedyr og andre flymodeller av VIA. Polyploidy ble lett indusert av en mekanisk punktering med en insektpinne og polyploidceller ble generert innen kort tid (2-3 dpi) (figur 1A, 1B)4. Den store utfordringen er disseksjon av intakt abdominalvev uten perturbasjoner til epitelet. D. melanogaster epitelet er lett ved et uhell bumped eller riper med skarpe disseksjon verktøy. Derfor bør trinnene i denne protokollen praktiseres før bruk og analyse.

Først ble skaden begrenset til ventral kvinnelig mage, noe som gir et stort, flatt ugjennomsiktig vevsområde som er ideelt for avbildning. Punkteringssårene ble påført i pleuriteepitelet, som ligger på hver side av ventrale midline sternites og målrettet mellom tergite (T) segmenter T4-T5 (figur 1A-C). Denne sårplasseringen gir et stort synlig område som ikke forstyrres av disseksjonen. Utfordrende trinn inkluderer abdominal vårsaks kutt og festetrinn (Figur 1D, 1E). Fjærkuttetrinnet fungerte best når magen ble kuttet i et redusert volum av Graces løsning (~ 30 μL) for å redusere vevsbevegelsen. Et godt sentrert snitt langs den dorsale midtlinjen var nødvendig for å gi tilstrekkelig areal på bukens dorsale klaffer for å feste seg på disseksjonsplaten (figur 1C). Magen må være forsiktig festet på de fire hjørnene uten overdreven kraft (figur 1E). En pin push som er for vanskelig vil forvrenge bukvevet og kan til og med skyve vevet inn i disseksjonsplaten. Hvis dette skjer, må vevet kastes. Når magevevet var fast, forble det på disseksjonsplaten til immunofluorescence farging var fullført og magene ble montert på et glassdekslerlip for avbildning (figur 1F).

Sårheling krever et kontinuerlig epitelark for å danne, som er avhengig av endoreplisering ogcellefusjon 4,,16. Septate junction protein FasIII, som merker cellecellekryss, ga en indikator for om noen behandling perturbasjoner oppstod under forberedelse (Figur 1G, 1H). Abdomens med store riper (uopphetet område) som perturb sårområdet må kastes og ble ikke brukt til videre analyse (Figur 1H).

Det neste trinnet var å analysere intakte prøver for eventuelle feil i VIA. Denne protokollen inneholder forskjellige analyser for å oppdage ulike aspekter ved VIA-responsen (figur 2). Sårreparasjon var fullført da en sentral, stor, multinuklert celle dekket sårskorset (figur 3A). Her ble cellefusjon oppdaget ved farging for FasIII /Grh og kvantifisere antall Grh+ epitelkjerner som omfattes i FasIII skissert område4. Defekter i sårlukking eller reepitelisering ble oppdaget da det ble observert hull på >10 μm i epitelarket (figur 3B, rød pil). Dette var tilfelle, for eksempel når VIA ble hemmet av aktivering av mitotisk syklus via uttrykk for stg, fzrRNAi, som nylig rapportert16. I denne genetiske tilstanden var 52% av sårene ikke i stand til å danne et kontinuerlig epitelark over sårskoren (figur 3B, 3C).

En annen metode for å måle sårreparasjon i denne modellen var ved å visualisere epitelmembranen med epi-Gal4-uttrykk for UAS-mCD8-ChRFP4 (figur 2, figur 3D). I kontrollen lukket 91 % av epitelsår helt med 3 dpi, men hemmet VIA ved å blokkere endoreplication (E2f1RNAi) og cellefusjon (RacDN) samtidig, som tidligere rapportert, forårsaket 92% av epitelsår å forbli helt åpne (Figur 3D, 3E)8,16. Aktiveringen av mitotisk cellesyklus ved uttrykk for stg, fzrRNAi resulterte også i en epitel sårlukkingsfeil. Men ved å visualisere epitelcellemembranen, kan omfanget av reepiteliseringsfeil bestemmes. WIP mutant (E2f1RNAi, RacDN) fly sår var mer åpne enn stg, fzrRNAi sår (Figur 3D, stiplet rød disposisjon)16. Denne membran sårhelende analysen ga mer informasjon om omfanget av sårreparasjonsfeilen. Som et resultat kan reepiteliseringsfeil grupperes som enten helt åpne, delvis lukket (det vil si > 10 μm hull), eller helt lukket (figur 3D, 3E).

I tillegg til cellefusjon vokser epitelceller i størrelse ved endoreplisering, en ufullstendig cellesyklus som dobler kjernefysisk DNA-innhold. Endoreplication ble analysert av både cellesyklusaktivitet og direkte kjernefysiske DNA-ploidymålinger (figur 2 og figur 4). Her ble cellesyklusaktivitet oppdaget ved inkorporering av thymidinanalogen EdU (figur 4A, 4B). D. melanogaster epitelceller ble funnet å gå inn i endocycle, en ufullstendig celle syklus som svinger mellom S og G faser uten en intervenerende M fase4,12. Den voksne D. melanogaster dietten ble supplert med EdU+ mat før skade og fluene ble opprettholdt på en EdU + dietttil disseksjon ved 2 dpi (figur 4A). EdU ble deretter oppdaget ved hjelp av produsentens Click-iT-protokoll. Denne EdU-analysen ble brukt til å avgjøre hvor, når og hvor mange kjerner som ble utløst for å gå inn i S-fasen som svar på et sår. Ved hjelp av Gal4 / UAS-systemet ble det nylig funnet at epitelspesifikt uttrykk for myc enten kan blokkere (mycRNAi) eller forverre (Myc overexpression) kompetansen til epitelceller for å gå inn i S-fasen. Som et resultat har det vist seg at Myc er tilstrekkelig til å indusere endoreplication i postmitotiske celler, selv uten skade16,22.

Deretter ble epitelpnep bestemmes ved å måle kjernefysisk DNA-innhold direkte. Epitelkjerner ble identifisert ved immunofluorescence farging for epitelspesifikke markør, Grh (figur 4D). I Fiji imaging programvare, epitelkjerner ble systematisk identifisert og deretter terskelet ved hjelp av Grh kjernefysisk flekk. Nuclei ble deretter separert og ROIene la seg over summen av stabler DAPI-bilde (Figur 4D, grønn pil). Eventuelle overlappende kjerner ble manuelt slettet før den integrerte tettheten til de valgte kjernene ble målt (figur 4D, røde piler). Denne halvautomatiske metoden gjør det mulig for en å kvantifisere fordelingen og ploidy av de fleste kjerner gjennom uskadet og reparert fly abdominal epitel8. Som nylig rapportert, epitelkjerner rundt såret var sammensatt av 44% polyploid kjerner med DNA-innhold mer enn 3C ved 3 dpi (Figur 4E, 4F)16. Som forventet fra EdU-resultatene førte knockdown av myc til en betydelig blokk i endoreplication, da bare 9% av epitelkjernene var polyploid, mens overuttrykk av Myc resulterte i 100% polyploid epitelkjerner rundt sårstedet (figur 4F)16. Epitel kjernefysisk størrelse ble også synlig påvirket av myc uttrykk med enten redusert eller forstørret kjerner til stede. Kjernefysisk område er imidlertid ikke et nøyaktig mål på ploidy og fysiologiske effekter, fordi faktorer som cellestrekking også kan påvirke kjernefysisk størrelse uten å påvirke kjernefysiskDNA-innhold 20.

Figure 1
Figur 1: Voksen frukt fly abdominal såret, dissekere, og vev montering. (A) Diagram over den voksne abdominal såret analyse. Fluer skal være skadet på hver side av magen ved tergite 4 (T4). (B)Voksen kvinnelig frukt fly 3 dpi med melanin scab dannet fra sårheling (hvit boks). Vekt bar = 50 μm. (C) Dissekert voksen mage, dorsal visning, med tergites merket. Abdomens ble filetet ned midtlinjen av dorsal siden (hvit stiplet linje). Vektstangen = 50 μm. (D) Dissekert og fileted voksen underliv før festing. Vektstangen = 50 μm. (E) Festet voksenmagen på en disseksjonsplate. En pin ble plassert i hvert av de fire hjørnene av magen på dorsalsiden. Vevet ble forsiktig åpnet, men ikke strukket, for å unngå å rive. (F)Voksenmager ble montert og plassert på en glassdekslerlip med innsiden av magen vendt ned mot dekkslippen og skjellaget orientert mot glasssklien. (G)FasIII farging av intakt sårområde uten behandling perturbasjon og en sentral syncytium (stiplet gul linje). Skalalinje = 50 μm. (H) Bilde av et ripete sårområde (*) med et uopphetet FasIII-område som forstyrrer syncytiumet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: ARBEIDSFLYT FOR VIA-analyse. Flytskjemaet viser de tre analysene som er beskrevet i denne studien, og overlappende og tydelige trinn for å oppdage og måle VIA-svaret. EdU-analysen måler cellesyklusaktivitet (blå bokser), ploidy og re-epitelialisering oppdages av Grh / FasIII immunstaining (grønne bokser), og uttrykk for membran RFP tillater måling av omfanget av epitelsårlukking (rosa bokser). Vanlige trinn er i grå bokser og D. melanogaster stamme genotyper er oppført ovenfor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Metoder for å oppdage ny epitelialisering under VIA. Re-epitelialisering ble perturbed når VIA ble genetisk hemmet. Immunofluorescerende bilder av kontroll (A) og stg, fzrRNAi (B) ved 3 dpi. Epitelkjerner og septatkryss ble farget med henholdsvis Grh (grønn) og FasIII (magenta). (A' og B') FasIII farging alene viste at re-epitelisering var svekket (rød pil) i stg, fzrRNAi epitel. Vektstangen = 50 μm. (C) Kvantifisering av reepiteliseringsfeil (%) ved 3 dpi (grå): kontroll (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). Feilfelt indikerer standardfeil. statistisk signifikans ble målt via Studentens T-test, **P < 0,01. Re-epitelisering under sårreparasjon kan også oppdages ved uttrykk for en membran koblet RFP ved hjelp av epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Immunofluorescent bilder av kontroll, E2F1RNAi,RacDN,og stg, fzrRNAi på 3 dpi. Vektstangen = 20 μm. Sårskorb (gul omriss) og åpent epitelsårområde (rød omriss). (E) Kvantifisering av sårlukking i ctrl (n = 11), E2F1RNAi,RacDN (n = 13) og stg, fzrRNAi (n = 13). Tilpasset fra Grendler et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Metoder for å oppdage endoreplication under VIA. (A) Tidslinje for EdU analyse: voksen Drosophila ble matet 75 μL av 5 mM gjær-EdU hver dag 2 dager før skade og fortsatte til 2 dpi. (B)Immunofluorescent bilder av EdU etikett i fly stammer uttrykt med epi-Gal4 / UAS system på 2 dpi. Sårskord (W). Vektlinje = 50 μm. (C) Gjennomsnittlig antall EdU+ epitelkjerner per fly ved 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi#1 (n = 10) og Myc (n = 8). Feilfelt indikerer standardfeil. statistisk signifikans ble målt via Studentens T-test, *P < 0,05, **P < 0,01. (D)Skjematisk for deteksjon og måling av epitel kjernefysisk ploidy. Epitelkjerner ble identifisert og terskelet av anti-Grh flekken i Fiji. Overlappende epitelkjerner ble separert (grønne pilspisser) eller fjernet (røde pilspisser) hvis de legges over av ikke-graflekjerner. Det integrerte tettheten og kjernefysiske området til tilsvarende DAPI-farget kjernebilde ble målt. (E) Epitelial kjernefysisk størrelse (Grh) ble endret av myc uttrykk på 3 dpi. (F)Epitelial kjernefysisk knep (%) ved 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi # 1 (n = 6), og Myc (n = 3). Tilpasset fra Grendler et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Presentert er en detaljert protokoll om hvordan å dissekere og bruke den voksne D. melanogaster abdominal epitel for å studere hvordan gener regulerer VIA ved å endre re-epitelisering og endoreplication under sårreparasjon16. Ved hjelp av denne metoden ble proto-onkogene Myc nylig identifisert som en nøkkelregulator for VIA. Myc er nødvendig for epitelceller for å endoreplicate post skade og er tilstrekkelig for quiescent epitelceller å endocycle både i voksen fly epitel og tilbehør kjertler16,,22. Det ble også funnet at å bytte epitelceller til en mitotisk cellesyklus ved uttrykk for stg, fzrRNAi er skadelig for sårreparasjon. Fortsatt studier ved hjelp av denne metoden vil identifisere andre gener som kreves for å regulere re-epitelisering og endoreplication under VIA, avslører både likheter og forskjeller til hvordan polyploidy er regulert og fungerer i en rekke vev.

Denne modellen og metoden gir unike fordeler, inkludert enkel induksjon av polyploidy med mekanisk punktering og det faktum at polyploidceller genereres innen dager4. Vevsdisseksjons- og forberedelsesprotokollene er basert på larvedisseksjonsteknikker 23, men den voksne flymagen er stivere og derfor lett perturbed. Som et resultat krever denne protokollen praksis og presisjon for å isolere et intakt vev for å studere VIA. Når dissekert, er epitelet tydelig synlig og lett avbildet, noe som gir et øyeblikksbilde av sårhelingsprosessen. Denne metoden gir et vell av informasjon om den voksne fluens epitelorganisasjon, celle og syncytiumstørrelse, og knepet av celler og individuelle kjerner. Mens levende bildebehandling ennå ikke er mulig innenfor intakt fruktflue på grunn av sin ugjennomsiktige skjellaget, kan denne protokollen tilpasses til å inkludere tilgjengelige ex vivo kulturforhold som brukes i D. melanogaster for å utføre kortsiktige live imaging studier24.

I fremtiden vil denne modellen være ideell for å studere celle-til-celle crosstalk og bidrag fra andre celletyper til VIA ved å regulere genuttrykk med Gal4 / UAS-systemet i andre celletyper av interesse. Lignende spørsmål kan også besvares ved hjelp av en rekke genetiske og muterte bakgrunner. Den dissekerte voksne fly abdomen inneholder en rekke celletyper som lett kan visualiseres ved hjelp av denne metoden, inkludert fett kropp og oenocytter, laterale muskelfibre, sensoriske nevroner, luftrør, og makrofag-lignende hemocytter. I tillegg vil denne modellen tillate forskere å undersøke hvordan fysiologiske variabler påvirker VIA, inkludert sex, kosthold, infeksjon, alder og miljømessige stressfaktorer. Mens protokollen bruker den voksne kvinnelige fluen på grunn av sin større størrelse, skjer WIP også i den mannlige fruktfluen (Gjelsvik og Losick, upublisert). Polyploidceller har vist seg å oppstå under aldring og aldersrelatert sykdom i pattedyrleveren, hjernen, øyet og hjertet12. Fruktfluemodellen vil gjøre det mulig for forskere å studere polyploidisering i fysiologiske og sykdomssammenhenger fordi menneskelige sykdomsrelaterte gener er svært bevart.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

På Boston College vil vi takke Dr. Eric Folker for bruk av laboratoriets kamera og stereoskopetopoppsett for bildebehandling og Bret Judson ved Boston College Imaging Core for infrastruktur og støtte. Vi vil også takke flysamfunnets ressurser: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center og TRiP Center ved Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) for å gi transgene aksjer som brukes i denne studien. Musen FasIII antistoff ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank støttet av NICHD av NIH og vedlikeholdt ved The University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under Award Number R35GM124691. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 For creating plates to dissect in
50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22 For preparing staining reagents in
AxioImager M2 with Apotome Zeiss NA For imaging samples
Blowgun mini Genesee Scientific 54-104M For anethesizing D. melanogaster strains
Bovine Serum Albumin, 30% Sigma A7284-500ML For immuostaining
Carbon dioxide tank various distributors N/A For anethesizing D. melanogaster strains
Click-iT EdU 594 Kit Thermofisher C10339 For EdU assay
Coverslips Thermofisher 3406 For mounting
DAPI Sigma D9542-10MG For immuostaining
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) Ellsworth Adhesives 184SIL For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A21206 For secondary immuostaining
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A10042 For secondary immuostaining
Drosophila tubing and fittings Genesee Scientific 59-124C, 59-123, 59-140 For anethesizing D. melanogaster strains
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 For dissecting
epi-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793 Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793, b27392 Losick et al. Current Biology, 2013
Excel Microsoft For performing ploidy calculations
Fiji/ImageJ (image analysis software) NIH https://imagej.nih.gov/ij For image analysis
Fly food Archon Scientific N/A Corn Syrup/Soy food
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 For anethesizing D. melanogaster strains
Glass dissecting dish Fisher Scientific 13-748B For performing dissections in
Glass slides Fisher Scientific 12-518-104C For mounting
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A11001 For secondary immuostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A11031 For secondary immuostaining
Grace's Insect Medium, unsupplemented Thermofisher 11595030 For dissecting in
Insect pins Fine Science Tools 26002-10 For wounding and pinning fly abdomens flat
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 7G10 For immunostaining epithelial cell-cell junctions
Mouting media Vector Laboratories H-1000 Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging
Nail polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing slides
Ortibal shaker Fisher Scientific 02-217-988 For immuostaining
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 Sigma P3813-10PAK For staining
Pin holders Fine Science Tools 91606-07 For wounding
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody N/A N/A For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8)
Rabbit anti-RFP Primary Antibody MBL PM005 For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium
Stereomicroscope Olympus SZ51 For dissecting and mounting fly tissue
Triton X-100 Sigma 10789704001 For immuostaining
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v108837, b6292 Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v25550, b56562 Grendler et al. Development, 2019
UAS-Myc Bloomington Drosophila Stock Center (b) b9674 Grendler et al. Development, 2019
UAS-myc RNAi Bloomington Drosophila Stock Center (b) b36123 Grendler et al. Development, 2019
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 For dissecting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Liu, R., Watts, J. J., Parkhurst, S. M. Drosophila embryos close epithelial wounds using a combination of cellular protrusions and an actomyosin purse string. Journal of Cell Science. 125 (Pt 24), 5984-5997 (2012).
  2. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  3. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biology. 2 (8), E239 (2004).
  4. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  5. Wang, Y., et al. Integrin Adhesions Suppress Syncytium Formation in the Drosophila Larval Epidermis. Current Biology. 25 (17), 2215-2227 (2015).
  6. Ramos-Lewis, W., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. A scar-like lesion is apparent in basement membrane after wound repair in vivo. Matrix Biology. 74, 101-120 (2018).
  7. Lee, C. W., Kwon, Y. C., Lee, Y., Park, M. Y., Choe, K. M. cdc37 is essential for JNK pathway activation and wound closure in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 30 (21), 2651-2658 (2019).
  8. Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals. PLoS One. 11 (3), e0151251 (2016).
  9. Tamori, Y., Deng, W. M. Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia. Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).
  10. Xiang, J., et al. EGFR-dependent TOR-independent endocycles support Drosophila gut epithelial regeneration. Nature Communications. 8, 15125 (2017).
  11. Cohen, E., Allen, S. R., Sawyer, J. K., Fox, D. T. Fizzy-Related dictates A cell cycle switch during organ repair and tissue growth responses in the Drosophila hindgut. Elife. 7, e38327 (2018).
  12. Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. Solving the Polyploid Mystery in Health and Disease. Trends in genetics: TIG. 35 (1), 6-14 (2019).
  13. Cao, J., et al. Tension Creates an Endoreplication Wavefront that Leads Regeneration of Epicardial Tissue. Developmental Cell. 42 (6), 600-615 (2017).
  14. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  15. Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
  16. Grendler, J., Lowgren, S., Mills, M., Losick, V. P. Wound-induced polyploidization is driven by Myc and supports tissue repair in the presence of DNA damage. Development. 146 (15), 173005 (2019).
  17. Mehrotra, S., Maqbool, S. B., Kolpakas, A., Murnen, K., Calvi, B. R. Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress. Genes & Development. 22 (22), 3158-3171 (2008).
  18. Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
  19. Gonzalez-Rosa, J. M., et al. Myocardial Polyploidization Creates a Barrier to Heart Regeneration in Zebrafish. Developmental Cell. 44 (4), 433-446 (2018).
  20. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. Journal of Cell Science. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  21. Knouse, K. A., Lopez, K. E., Bachofner, M., Amon, A. Chromosome Segregation Fidelity in Epithelia Requires Tissue Architecture. Cell. 175 (1), 200-211 (2018).
  22. Box, A. M., et al. Endocycles support tissue growth and regeneration of the adult Drosophila accessory gland. bioRxiv. , 719013 (2019).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. Journal of Visualized Experiments. (57), e3111 (2011).
  24. Dai, W., Montell, D. J. Live Imaging of Border Cell Migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 160 sårheling vevreparasjon endoreplisering polyploidy Myc Drosophila
En <em>Drosophila-modell</em> for å studere sårindusert polyploidisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. C., Dehn, A. S.,… More

Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization. J. Vis. Exp. (160), e61252, doi:10.3791/61252 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter