Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

مثبطات acetyltransferases هيستون (HATs، المعروف أيضا باسم lysine أستيل ترانسفيراليس)، مثل CBP/p300، هي العلاجات المحتملة لعلاج السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة للتحقق من صحة هذه المثبطات. ثلاث طرق في المختبر للتحقق من الصحة وتشمل المقايسات HAT مع أسيتيل ترانسفيرات المؤتلف، المناعية لاستيل هيستون في ثقافة الخلية، وChip-qPCR.

Abstract

Lysine acetyltransferases (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على histones والبروتينات الأخرى لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. تخضع الـ KATs، مثل CBP/p300، لتحقيق مكثف كأهداف علاجية بسبب دورها الحاسم في الأورام السرطانية المتنوعة. إن تطوير مثبطات جزيء صغير جديدة تستهدف وظيفة أسيتيلtransferase (HAT) من منتجات الطاقة المعدنية الكويتية (هات) يمثل تحدياً ويتطلب مقايسات قوية يمكنها التحقق من خصوصية وفاعلية المثبطات المحتملة.

توضح هذه المقالة خط أنابيب من ثلاث طرق توفر التحقق من صحة في المختبر الصارم لمثبطات HAT جديدة (HATi). وتشمل هذه الطرق اختبار اختبار أنبوب قبعة المقايسة, كروماتين فرط الacetylation تثبيط (ChHAI) اختبار, وChromatin المناعي-PCR الكمية (ChIP-qPCR). في مقايسة HAT، يتم احتضان HATs المؤتلف مع الهستونات في تفاعل أنبوب الاختبار، مما يسمح لالآستيل من بقايا ليسين محددة على ذيول الحجر. ويمكن منع هذا التفاعل بواسطة HATi ويمكن قياس المستويات النسبية من أسيتيل هينيستون محددة الموقع عن طريق المناعة. مثبطات محددة في قبعة المقايسة تحتاج إلى تأكيد في البيئة الخلوية.

يستخدم مقايسة ChHAI مناعيًا لفحص HATi رواية أن تخفيف فرط acetylation قوية من النغمات الناجمة عن مثبط deacetylase هيستون (HDACi). إضافة HDACi مفيد لأن مستويات القاعدية من أسيتيل هينيستون يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن طريق المناعة.

ويقيس مقايستا هات وتشهاي التغيرات العالمية في أسيتيل الهيستون، ولكن لا تقدمان معلومات بشأن أسيتيل في مناطق جينية محددة. ولذلك، يتم استخدام ChIP-qPCR للتحقيق في آثار HATi على مستويات أستيل هيستون في العناصر التنظيمية الجينات. ويتم ذلك من خلال التحلل المناعي الانتقائي لمجمعات هيستون-دنا وتحليل الحمض النووي المنقى من خلال qPCR. معا، هذه المقايسات الثلاثة تسمح للتحقق الدقيق من خصوصية، قوة، وآلية العمل من رواية HATi.

Introduction

ليسين أستيل ترانسفيراديس (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على كل من البروتينات هيستون وغير هيستون1,2,3,4. كشفت الأبحاث الحديثة أن KATs ووظيفة الأسيتيل ترانسفيراز يمكن أن تعزز نمو الورم الصلب4،5،6،7،8،9. على سبيل المثال، بروتين الكريب الملزم (CBP)/p300 هما KATs البارالوجين التي تنظم العديد من مسارات الإشارات في السرطان2،3. CBP/p300 لديها جيدا تتميز هييتيلترانزفيراز (HAT) وظيفة وتحفيز هيستون 3 Lysine 27 أستيل (H3K27ac)2,4,5,10,11, علامة هامة لمعززات النشطة, مناطق المروج والنسخ الجيني النشط12,13,14. CBP/p300 بمثابة المنشطات المشاركة الحرجة Pro-growth signals pathways في الأورام الصلبة عن طريق تفعيل النسخ من أونكوجين من خلال أستيل من histyles وعوامل النسخ الأخرى4,9,15,16,17,18.9 نظرا لدورها في تطور الورم، CBP/p300 وغيرها من الـ KATs هي قيد التحقيق لتطوير مثبطات الرواية التي تمنع وظيفتها oncogenic4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 و GNE-049 تمثل محاولتين ناجحتين لتطوير مثبطات قوية ومحددة لCBP/p3004,9. ويجري حالياً فحص مثبطات إضافية لـ CBP/p300 وغيرها من الـ KATs.

ويجري الآن مسألة نوعية مثبطات KAT الموصوفة سابقا (KATi) في التشكيك، مع العديد من مثبطات الرياء الآثار المستهدفة وسوء توصيف21. ولذلك ، توصيف صارمة والتحقق من المرشحين المخدرات جديدة أمر ضروري لتطوير تحقيقات كيميائية عالية الجودة. المبينة هنا هي ثلاثة بروتوكولات التي تشكل خط أنابيب لفحص والتحقق بدقة من قوة وخصوصية رواية KATi ، مع التركيز بشكل خاص على تثبيط وظيفة HAT (HATi) من KATs. يستخدم CBP/p300 ومثبطاتها كأمثلة ، ولكن يمكن تكييف هذه البروتوكولات لغيرها من كاوت التي لها وظيفةHAT 7.

البروتوكول الأول هو في المختبر acetyltransferase (HAT) المقايسة التي تستخدم تنقية p300 وhistones في تفاعل أنبوب اختبار تسيطر عليها. هذا المقايسة بسيطة لأداء، هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن استخدامها لفحص المركبات في إعداد الإنتاجية المنخفضة، ولا تتطلب مواد مشعة. في هذا البروتوكول، يتم قياس p300 المؤتلفة lylyzes lysine acetylation على ذيول هيستون خلال فترة حضانة قصيرة ومستويات أسيتيل هيستون باستخدام إجراءات المناعة القياسية. يمكن إجراء التفاعل الأنزيمي في وجود أو عدم وجود مثبطات CBP/p300 لفحص المركبات التي تقلل من أستيلستون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مقايسة HAT للتحقق مما إذا كانت المركبات الجديدة انتقائية لCBP/p300 من خلال تقييم نشاطها ضد غيرها من الكاتس المنقى، مثل PCAF. إن مقايسة HAT هي نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في مثبطات الرواية نظرًا لبساطتها ، وانخفاض تكلفتها ، والقدرة على تحديد فاعلية / انتقائية المانع. في الواقع، وغالبا ما يستخدم هذا البروتوكول في الأدب كشاشة في المختبر5،10. ومع ذلك، فإن مثبطات تحديد في اختبار HAT ليست فعالة دائما في ثقافة الخلية لأن رد فعل أنبوب الاختبار هو أبسط بكثير من نظام الخلايا الحية. ولذلك، فمن الضروري أن مزيد من تحديد خصائص مثبطات في تجارب ثقافة الخلية22،23.

البروتوكول الثاني في خط الأنابيب هو Chromatin Hyperacetylation تثبيط (ChHAI) المقايسة. هذه الخلية القائمة على المقايسة يستخدم مثبطات deacetylase هيستون (HDACi) كأداة لhyperacetylate الهستون في الكروماتين قبل المشاركة في الحضانة مع HATi24. يمكن أن يكون استيليه هينيلستون القاعدي منخفضًا في ثقافة الخلية ، مما يجعل من الصعب التحقيق فيه عن طريق التلطخ المناعي دون إضافة HDACi لزيادة الأسيتيلية. الغرض من مقايسة ChHAI هو تحديد رواية HATi التي يمكن أن تُثبِّت من الزيادة في أسيتيل هيستون الناجمة عن تثبيط HDAC. وتشمل مزايا هذا الفحص تكلفتها المنخفضة وسهولة الأداء النسبية واستخدام الخلايا في الثقافة، مما يوفر أهمية فسيولوجية أكثر من اختبار أنبوب الاختبار HAT. على غرار مقايسة HAT، يستخدم هذا البروتوكول مناعة معيارية لجمع البيانات.

تقدم مقايسات HAT و ChHAI بيانات حول قوة المركبات الجديدة لمنع أسيتيل الهيستون العالمي ، ولكنها لا توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير هذه المركبات على التعديلات في مناطق جينومية محددة. ولذلك، فإن البروتوكول النهائي، Chromatin المناعية-الكمّي البوليميراز سلسلة التفاعل (ChIP-qPCR) هو تجربة ثقافة الخلية التي تحقق التفاعلات الحمض النووي البروتين في مناطق محددة من الجينوم. في بروتوكول ChIP، يتم ربط الكروماتين للحفاظ على تفاعلات الحمض النووي والبروتين. ثم يتم استخراج الكروماتين من الخلايا ويخضع مركب البروتينات الحمض النووي للمناعة الانتقائية للبروتين الذي يهم (على سبيل المثال، باستخدام جسم مضاد محدد لH3K27ac). ثم يتم تنقية الحمض النووي وتحليله باستخدام qPCR. على سبيل المثال، يمكن استخدام ChIP-qPCR لتحديد ما إذا كانت رواية HATi downregulates acetylation هينيستون في oncogenes الفردية، مثل Cyclin D125. في حين ChIP-qPCR هو أسلوب شائع يستخدم في هذا المجال، يمكن أن يكون من الصعب تحسين4،10،26. يوفر هذا البروتوكول تلميحات لتجنب المخاطر المحتملة التي يمكن أن تحدث أثناء تنفيذ إجراء ChIP-qPCR ويتضمن تدقيقات مراقبة الجودة التي يجب تنفيذها على البيانات.

عند استخدامها معا، وهذه البروتوكولات الثلاثة تسمح لتوصيف صارم والتحقق من صحة رواية HATi. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب توفر العديد من المزايا لأنها سهلة الأداء، رخيصة نسبيا وتوفير البيانات عن الأسيتيل هيستون العالمية وكذلك الإقليمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. في المختبر قبعة المقايسة

  1. إعداد المخزن المؤقت
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت.
    1. إعداد 5x مخزن مؤقت للمحسان و 6x دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) وتخزينها عند -20 درجة مئوية. Aliquot SDS في 1 مل aliquots.
    2. إعداد 10x هلام SDS تشغيل العازلة و 10x TBST وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد 1x نقل العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      تنبيه: تحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول. SDS، DTT، وbroophenol الأزرق هي سامة وينبغي عدم تناولها، استنشاق، أو يتعرض للجلد أو العينين. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة لإجراءات المعالجة الصحيحة. يرجى استخدام غطاء الدخان الكيميائية للتعامل مع المواد الكيميائية الخطرة.
  2. رد فعل HAT
    ملاحظة: حمض Anacardic هو المانع P300 المعروفة3 ويستخدم كمثال لتوضيح كيف يمكن للمقايسة قبعة تحديد مثبطات p300 رواية. راجع البروتوكول التكميلي (التخطيطي 1) للاطلاع على مخطط للخطوة 1.2.1.
    1. إعداد رد فعل الأنزيمية التالية في أنبوب PCR 0.2 مل: 2 ميكرولتر من 5x العازلة المقايسة، 1 ميكرولتر من p300 المنقاة (0.19 ميكروغرام /ميكرولتر)، 1 ميكرولتر من حمض الأنكارد (HATi) أو مراقبة DMSO المخففة في 1x مخزن للمقايسة و2 ميكرولتر من ddH2O. قبل احتضان هذا الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم إضافة 3 ميكرولتر من 100 ميكرومتر أسيتيل-COA و 1 ميكرولتر من H3.1 النقي (0.2 ميكروغرام/ميكرولتر) إلى التفاعل.
    2. احتضان خليط التفاعل الكامل في 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في دورة حرارية PCR.
    3. إضافة 2-mercaptoethanol بنسبة 1:10 إلى المخزن المؤقت عينة 6x SDS.
    4. إزالة عينات من دورة حرارية PCR وإضافة 2 ميكرولتر من 6X SDS (مع 2-mercaptoethanol المضافة) إلى مزيج التفاعل.
      تنبيه: 2-mercaptoethanol هو سام وينبغي أن تستخدم داخل غطاء الدخان الكيميائية. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة للتعامل مع ذلك بشكل صحيح.
    5. عينات الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة وتبرد على الجليد. تخزين العينات في -20 أو -80 درجة مئوية أو تنفيذ جل electrophoresis و المناعة على النحو المفصل أدناه.
  3. جل الكهرباء والمناعة
    ملاحظة: إذا لم تكن مألوفة مع جل electrophoresis و المناعة، راجع هذا الإجراء القياسي27 للحصول على تفاصيل إضافية حول كيفية تنفيذ الخطوات 1.3.1-1.3.17. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية هنا28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 ميكرولتر من العينات (من الخطوة 1.2.5.) إلى آبار هلام بولياكريلاميد متدرج بنسبة 4-20٪ . Pipette 5 ميكرولتر من سلم البروتين في واحدة من الآبار كمرجع الوزن الجزيئي. تشغيل هلام في 120 V لمدة 90 دقيقة باستخدام خزان هلام.
    2. نقل هلام إلى ثنائي فلوريد بولي فينيلايدين (PVDF) غشاء في 100 V لمدة 70 دقيقة باستخدام خزان نقل.
    3. إزالة الغشاء من جهاز نقل وضعه في حاوية بلاستيكية. سد الغشاء بإضافة 1X TBST (التي تحتوي على 5٪ الحليب) للحاوية ويهز بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة 1x TBST من الخطوة 1.3.3. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة أسيتيل محددة الموقع (على سبيل المثال، H3K18ac أو H3K27ac الأجسام المضادة الأولية في تخفيف 1:5،000 في 1X تبت يحتوي على 5٪ الحليب) في 4 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
    5. إزالة الحل الأجسام المضادة الأساسية. اغسل الغشاء 2x مع 1x TBST (بدون حليب) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسل.
    6. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في 1:20,000 في 1X TBST (تحتوي على 5% حليب) واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    7. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية. اغسل الغشاء 2x مع 1x TBST (بدون حليب) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسل.
    8. استنزاف 1X تبست من الغشاء. مزيج هكسيد البيرستر هكسيد الهروة هكسيد حل و هكسيد هروة إذاعة هروة في نسبة 1:1 (1 مل من كل) وماص 2 مل من الحل المشترك لسطح الغشاء.
    9. احتضان الحل مع الغشاء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    10. استنزاف الركازة chemiluminescent الزائدة من الغشاء على منشفة ورقية ووضع الغشاء في غلاف بلاستيكي داخل حامل كاسيت الأشعة السينية.
    11. الانتقال إلى غرفة مظلمة مخصصة لمعالجة فيلم الأشعة السينية. يعرض الغشاء لغشاء الأشعة السينية عن طريق وضع الفيلم على أعلى الغشاء وإغلاق كاسيت لمدة 30 s.
      ملاحظة: يجب تحديد وقت الاتصال بين الفيلم والغشاء تجريبيًا. وسوف تحتاج الإشارات القوية إلى التعرض لمدى قصير (ثواني) وقد تحتاج الإشارات الأضعف إلى التعرض لفترة أطول.
    12. قم بإزالة فيلم الأشعة السينية من الكاسيت وعالج الفيلم عن طريق تشغيله من خلال معالج أفلام الأشعة السينية. راجع أدلة الشركة المصنعة للحصول على إرشادات محددة حول كيفية معالجة فيلم الأشعة السينية.
    13. إزالة الغشاء من البلاستيك التفاف وغسلها مع ddH2O لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    14. احتضان الغشاء مع 0.2 M NaOH لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    15. اغسل الغشاء بالديش2O لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    16. سد الغشاء بإضافة 1X TBST (التي تحتوي على 5٪ الحليب) للحاوية ويهز بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    17. أضف تخفيف الأجسام المضادة الأساسية التالية (على سبيل المثال، مسبار H3K27ac إذا كان أول جسم مضاد يستخدم H3K18ac) واهتزاز بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. كرر الخطوات 1.3.4-1.3.17 حتى يتم إكمال كافة تحقيقات الأجسام المضادة.

2. Chhai المقايسة

  1. في المختبر العلاج بالعقاقير وتحليل histones الأسيتلات
    ملاحظة: A-485 هو P300 HATi قوية وتتميز بشكل جيد2,4 . سيتم استخدام هذا المانع في الأقوال المتبقية بسبب فعاليتها وخصوصيتها في زراعة الخلية. MS-275 (إنتينوستات)24 هو HDACi أن يزيد بشكل ملحوظ مستويات أسيتيل هيستون ويستخدم لتسهيل اكتشاف أسهل من مسابير أسيتيل مع المناعة القياسية. انظر البروتوكول التكميلي (التخطيطي 2) لـ تخطيطي لتخفيفات المخدرات المستخدمة في الخطوة 2.1.
    1. بذور 100،000 خلايا MCF-7 في لوحة 12 جيدا والسماح للخلايا لتنمو إلى 80-90٪ التقاء في 1 مل من خلية ثقافة المتوسطة. وضع علامة على الآبار للتصميم التجريبي التالي: بئر 1: مراقبة DMSO (نقطة مرجعية)؛ جيدا 2: A-485 (3 μM)؛ بئر 3: A-485 (10 μM); جيدا 4: MS-275 (3 μM)؛ حسنا 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μm); جيدا 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      ملاحظة: بالنسبة لاستزراع خلايا MCF-7، استخدم وسائط DMEM كاملة وتسمح للخلايا بالنمو عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة DMEM كاملة.
    2. في 24 ساعة بعد البذر، ماص 4 مل من وسائل الاعلام DMEM كاملة إلى أنبوب مخروطي مخروطي 15 مل معقم. مايليت 2 ميكرولتر من MS-275 (6 مل في DMSO) إلى 4 مل من المتوسط لتركيز نهائي من 3 ميكرومتر MS-275.
    3. ماصة 2 μL من DMSO إلى 4 مل من المتوسط في منفصلة معقم 15 مل أنبوب مخروطي.
      تنبيه: يرجى التحقق من ورقة بيانات السلامة للتعامل السليم مع نظام إدارة الوجهات السياحية. لا يتم تصنيف بعض أنواع القفازات للتعامل مع DMSO.
    4. استلهم متوسط ثقافة الخلية من الآبار 4-6 والماصات 1 مل من 3 ميكرومتر MS-275 في المتوسط (الخطوة 2.1.2) إلى كل بئر. تجاهل غير المستخدمة المخفف MS-275.
    5. استلهم متوسط ثقافة الخلية من الآبار 1-3 والماصات 1 مل من DMSO المخفف (الخطوة 2.1.3) إلى كل بئر. تجاهل DMSO المخفف غير المستخدم.
    6. إعادة الخلايا إلى الحاضنة واحتضان لمدة 4 ح للسماح تراكم الهستونات الأسيتلات في الخلايا المعرضة لMS-275 (الآبار 4-6).
      ملاحظة: MS-275 هو HDACi وسوف يسبب hyperacetylation هيستون24. هذا 4 ح قبل الحضانة ضروري للسماح MS-275 للحث على فرط acetylation قبل إضافة A-485، مما يقلل من أسيتيل هيستون2،,4.
    7. بعد 4 ح من الحضانة مع MS-275، وإعداد التخفيفات التالية في أنابيب معقمة منفصلة 1.5 مل عن طريق الأنابيب: 1.0 μL من DMSO إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من DMSO و0.5 ميكرولتر A-485 (6 مل) إلى 1 مل من وسائل الاعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من DMSO و0.5 ميكرولتر من A-485 (20 mM) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من DMSO و0.5 ميكرولتر من MS-275 (6 مل) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من A-485 (6 مل) و0.5 ميكرولتر من MS-275 (6 مللي م) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من A-485 (20 mM) و 0.5 ميكرولتر من MS-275 (6 mM) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM.
    8. التعرق ثقافة الخلية المتوسطة من الآبار 1-6 والماصة 1 مل من التخفيف 1 إلى بئر 1، وتمييع 2 إلى بئر 2، وتمييع 3 إلى بئر 3، وتمييع 4 إلى بئر 4، وتمييع 5 إلى بئر 5، وتمييع 6 إلى بئر 6.
      ملاحظة: القاعدة العامة هي موازنة محتوى DMSO (المذيب) بين المجموعات التجريبية وعدم تجاوز محتوى DMSO بنسبة 0.1٪ في ثقافة الخلايا لتجنب السمية الخلوية والتغيرات في الانتشار.
    9. إعادة الخلايا إلى الحاضنة والثقافة لمدة 20 ساعة.
    10. بعد 20 ح، التعرق متوسطة ثقافة الخلية من الآبار 1-6.
    11. غسل الخلايا عن طريق pipetting 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الآبار 1-6. الطامح برنامج تلفزيوني.
    12. إضافة 100 ميكرولتر من 1x العازلة السلبية التحلل (انظر الجدول 1)إلى الآبار 1-6. تخزين لوحة ثقافة الخلية (مع عينات في العازلة التحلل السلبي) في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتجميد ذوبان وتحلل الخلايا.
      تنبيه: يرجى التحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية قبل إجراء المخازن المؤقتة. يمكن أن يسبب CDTA تلف العين خطيرة وتهيج.
    13. تذوب العينات في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمدة 10 دقيقة. نقل العينات إلى أنابيب 1.5 مل منفصلة ووضعها على الفور على الجليد.
    14. قياس تركيز البروتين لكل عينة. ويمكن تحديد تركيز البروتين باستخدام عدة بروتوكولات راسخة34.
    15. تركيز البروتين اكويريبرات بين العينات 1-6 (في وحدة تخزين متساوية) باستخدام 1x العازلة الانحلال السلبي لتخفيف، حسب الضرورة.
    16. إضافة 2-mercaptoethanol بنسبة 1:10 إلى 6x المخزن المؤقت SDS.
    17. إضافة 6x المخزن المؤقت عينة SDS مع 2-mercaptoethanol إلى العينات 1-6 إلى تركيز نهائي من 1x SDS عينة المخزن المؤقت.
    18. عينات الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة وتبرد على الجليد. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى الخطوة 2.1.19.
    19. Pipette حجم يحتوي على 30 ميكروغرام من البروتين للعينات 1-6 إلى الآبار في هلام بولياكريلاميد متدرج 4-20٪. إجراء عملية مناعة وفقا للبروتوكول الموصوف في البروتوكول 1.

3. ChIP-qPCR

ملاحظة: البروتوكول أدناه هو وصف لمثبطات p300 كمثال.

  1. إعداد المخزن المؤقت
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت. الخطوات العامة لبروتوكول ChIP (مثل وصفات العازلة وأوقات الغسيل وأوقات الطرد المركزي) أدناه يتم تعديلها وتكييفها من توصيات الشركة المصنعة لمجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)ومن الأدب35،36.
    1. تحضير العازلة تخفيف ChIP، نوات تورم العازلة، انخفاض الملح غسل العازلة، وارتفاع العازلة غسل الملح، LiCl العازلة غسل وTE العازلة. يُخزن عند 4 درجة مئوية.
    2. إعداد المخزن المؤقت SDS تحلل، 10x العازلة الجليسين و المخزن المؤقت Elution ChIP. يُخزن في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: يرجى التحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية قبل إجراء المخازن المؤقتة لضمان المناولة السليمة.
  2. العلاج من المخدرات
    ملاحظة: راجع البروتوكول التكميلي (التخطيطي 3) للحصول على تخطيطي لتخفيفات المخدرات المستخدمة في الخطوة 3.2.
    1. بذور MCF-7 الخلايا في اثنين من أطباق ثقافة 15 سم وتنمو الخلايا إلى 90٪ التقاء في 12 مل من المتوسط DMEM كاملة. وضع علامة على الأطباق للتصميم التجريبي التالي: الطبق 1: تحكم DMSO (نقطة مرجعية)؛ الطبق 2: A-485 (3 ميكرومتر).
      ملاحظة: لاستزراع MCF-7 الخلايا، واستخدام وسائل الاعلام DMEM كاملة وتنمو في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة DMEM كاملة.
    2. في أنبوب مخروطي معقم 15 مل، ماصة 12 مل من وسائل الاعلام DMEM والماصات 6 ميكرولتر من DMSO. مزيج جيد.
    3. في أنبوب مخروطي معقم منفصل 15 مل، ماصة 12 مل من وسائل الاعلام DMEM والماصات 6 ميكرولتر من A-485 (6 مل في DMSO) للحصول على تركيز النهائي من 3 μM A-485. مزيج جيد.
    4. الطامح وسائل الإعلام من الطبق 1 و 2.
    5. أضف 12 مل من DMSO المخفف في DMEM (الخطوة 3.2.2.) إلى الطبق 1.
    6. أضف 12 مل من 3 ميكرومتر A-485 في DMEM (الخطوة 3.2.3.) إلى الطبق 2.
    7. إعادة أطباق ثقافة الخلية إلى الحاضنة واحتضان لمدة 24 ساعة.
  3. تثبيت الخلية
    1. ماصة 330 μL (27.5 μL لكل مل) من 37٪ الفورمالديهايد إلى وسائل الإعلام كاملة ودوامة بلطف لوحة لخلط.
      تنبيه: الفورمالديهايد سام. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة لإجراءات المعالجة الصحيحة.
    2. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. ماصة 2 مل من 10x جليكين إلى لوحة ودوامة لخلط.
    4. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. بعد الحضانة، ضع الأطباق على الجليد وذوبان aliquot من كوكتيل مثبطات البروتياز.
    6. إعداد الحلول التالية لكل من DMSO و A-485 عينات باستخدام المخازن المؤقتة إعداد في الخطوة 3.1.
      1. 2 مل من برنامج تلفزيوني مع تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز
      2. 1 مل من تورم النوى العازلة مع 1:1000 تخفيف من كوكتيل مثبطات البروتياز
      3. 0.5 مل من المخزن المؤقت SDS مع تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز
    7. التعرق وسائل الإعلام من الأطباق ثقافة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 15 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
    8. مايette 2 مل من برنامج تلفزيوني مع كوكتيل مثبطات البروتياز (الخطوة 3.3.6.1) لأطباق ثقافة الخلية. ارفع الخلايا إلى حل باستخدام مشطة الخلايا.
    9. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentrifuge. جمع الخلايا المتبقية مع برنامج تلفزيوني إضافي إذا لزم الأمر.
    10. تدور أنابيب في 800 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى بيليه الخلايا.
    11. استلهمي المنتفخ والماصة 1 مل من النويات تورم العازلة مع كوكتيل مثبطات البروتياز (الخطوة 3.3.6.2) إلى بيليه. Resuspend بيليه واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    12. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 2700 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى بيليه نويتي.
    13. التعرق والماصات 0.5 مل من SDS تحلل العازلة مع كوكتيل مثبطات البروتياز (الخطوة 3.3.6.3) إلى بيليه. Resuspend بيليه واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    14. تخزين عينات الكروماتين في -80 درجة مئوية حتى الخطوة 3.4.1 أو المضي قدما على الفور إلى الخطوة 3.4.
  4. سونيكيشن الحمض النووي
    1. نقل 130 ميكرولتر من الكروماتين من عينة DMSO (الخطوة 3.3.14) إلى أنبوبين سونيكيشن الحمض النووي باستخدام ماصة (130 ميكرولتر لكل منهما).
    2. نقل 130 ميكرولتر من الكروماتين من A-485 عينة (الخطوة 3.3.14) إلى اثنين من أنابيب سونيكيشن الحمض النووي باستخدام ماصة (130 ميكرولتر لكل منهما).
    3. سونيكات الحمض النووي إلى ما يقرب من 150-200 شظايا زوج قاعدة باستخدام إعدادات sonicator التالية: ذروة الحادث السلطة (W) من 175، عامل واجب من 10٪، 200 دورات لكل انفجار و 430 وقت العلاج.
      ملاحظة: قد تختلف إعدادات Sonication بين النماذج وقد تحتاج الإعدادات إلى ضبطها لتحقيق حجم جزء مناسب لخطوط الخلايا المختلفة.
    4. الاحتفاظ بالعينات على الجليد بعد سونيكيشن.
    5. نقل الكروماتين سونيكاتيد إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة والطرد المركزي في 10000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إلى بيليه الحطام.
    6. الماصات المابسة (يحتوي على الكروماتين سونيكاتيد) إلى أنبوب جديد والتخلص من الحطام. يمكن تخزين الكروماتين سونيكاتيد في -80 درجة مئوية.
  5. Chromatin المناعي (ChIP)
    ملاحظة: راجع البروتوكول التكميلي (3 التخطيطي) للحصول على مخطط مجموعات IP في الخطوة 3.5.
    1. قياس محتوى البروتين من الكروماتين سونيكاتيد لعينات DMSO و A-485 من الخطوة 3.4.6. يمكن قياس محتوى البروتين باستخدام البروتوكولات الراسخة34.
      ملاحظة: للبساطة، وهذا البروتوكول يفترض محتوى البروتين على قدم المساواة وسيتم استخدام 100 ميكرولتر من الكروماتين سونيكاتيد. خلاف ذلك، محتوى البروتين سوف تحتاج إلى أن تكون توازن بين جميع العينات في حجم متساو.
    2. ماصة 100 μL من دمسو سونيكاتيد كروماتين إلى اثنين 1.5 مل أنابيب (100 ميكرولتر لكل منهما). Pipette 400 ميكرولتر من مانع تخفيف ChIP (التي تحتوي على تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز) إلى كل أنبوب لجلب الحجم الإجمالي يصل إلى 500 ميكرولتر. إزالة 5 ميكرولتر من الحل من أحد الأنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية كإدخال DMSO.
    3. ماصة 100 ميكرولتر من كروماتين سونيكيد A-485 إلى اثنين من أنابيب 1.5 مل (100 ميكرولتر لكل منهما). Pipette 400 ميكرولتر من مانع تخفيف ال ChIP (التي تحتوي على تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز) إلى كل أنبوب لجلب الحجم الإجمالي يصل إلى 500 ميكرولتر.
    4. باستخدام ماصة، إضافة الأجسام المضادة المناعية (IP) (مثل التحكم غير محددة IgG أو الأجسام المضادة H3K27ac محددة) إلى الأنابيب المقابلة لعينات DMSO و A-485: IP #1 chromatin DMSO مع الأجسام المضادة IgG (5-10 ميكروغرام)؛ IP #2 كروماتين DMSO مع الأجسام المضادة H3K27ac (5-10 ميكروغرام); IP #3 كروماتين A-485 مع الأجسام المضادة IgG (5-10 ميكروغرام); IP #4 كروماتين A-485 مع الأجسام المضادة H3K27ac (5-10 ميكروغرام).
    5. إضافة 20 ميكرولتر من البروتين الخرز المغناطيسي لكل أنبوب. تأكد من أن الخرز يتم إعادة اعتمادها بشكل جيد.
    6. تدوير العينات بين عشية وضحاها في 4 °C.
    7. بيليه البروتين الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة supernatant. لا تزعج الخرز.
    8. غسل الخرز مع 500 μL إلى 1 مل من العازلة غسل الملح المنخفض وتدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أداء تدور سريعة أسفل، بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي، وإزالة supernatant.
    9. غسل الخرز مع 500 μL إلى 1 مل من العازلة غسل الملح عالية وتدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أداء تدور سريعة أسفل، بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي، وإزالة supernatant.
    10. غسل الخرز مع 500 μL إلى 1 مل من مخزن غسيل LiCl وتدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أداء تدور سريعة أسفل، بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي، وإزالة supernatant.
    11. اغسل الخرز بـ 500 ميكرولتر إلى 1 مل من عازل TE وتناوب لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تنفيذ سريع تدور لأسفل. الاحتفاظ بالخرزات في المخزن المؤقت TE حتى الخطوة 3.5.14.
    12. إزالة عينات الإدخال (من الخطوة 3.5.2 و 3.5.3) من الفريزر والحفاظ على الجليد.
    13. ذوبان aliquot من البروتينات K.
    14. بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة العازلة TE من الخرز (من الخطوة 3.5.11).
    15. إضافة 100 μL μL غلوتيون العازلة + 1 ميكرولتر من البروتينات K إلى كل عينة، بما في ذلك عينات المدخلات. عينات احتضان مع اهتزاز في 62 درجة مئوية لمدة 2 ساعة باستخدام ثيرموسيكلير.
    16. بعد 2 ساعة، عينات الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق باستخدام ثيرموسيكلير.
    17. تبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة.
    18. بيليه الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل المغناطيسي ونقل فائقة (يحتوي على الحمض النووي من الفائدة) إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    19. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR القياسية.
    20. يمكن تخزين الحمض النووي المنقى في -20 درجة مئوية ويمكن استخدامها كقوالب في بروتوكولات qPCR القياسية. اتبع بروتوكولات الشركة المصنعة لتشغيل qPCR.
  6. تحليل بيانات ChIP-qPCR
    ملاحظة: طريقتان شائعتان لتحليل نتائج ChIP-qPCR هي إثراء طي فوق الأجسام المضادة IgG وطريقة إدخال 1%. يتم توفير قالب ممتاز لكلا الأساليب التحليل من قبل مصدر تجاري يمكن استخدامها لحساب التخصيب أضعاف بسرعة لكل الأجسام المضادة IP / الهدف من الفائدة37.
    1. لحساب الإثراء أضعاف و% الإدخال، نسخ ولصق القيم ΔCt من البيانات qPCR التي تم الحصول عليها عن كل الأجسام المضادة (غير محددة IgG، وIP H3K27ac الأجسام المضادة، و 1٪ الإدخال) في المنطقة المقابلة في قالب التحليل و الإثراء أضعاف و% سوف الإدخال ملء تلقائياً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في المختبر acetyltransferase (HAT) يمكن استخدام مقايسة للتحقيق في المركبات التي تمنع p300 هات النشاط نحو الركيزة حجر. الشكل 1A يوفر تخطيطيا تجريبيا لمقتايس HAT. تم استخدام حمض Anacardic ، وهو معروف HATi3،38، في هذا الفحص في نطاق تركيز من 12.5-100 μM. في 100 μM، حمض الأنكارديك downregulates p300 حفزت acetylation هيستون في هيستون 3، ليسين 9 و 18 مقابل العلاج DMSO التحكم(الشكل 1B،حارة 5 مقابل حارة 1). وقد استخدم نطاق تركيز في هذا الفحص لأن جرعات المخدرات أقل قد لا تمنع إلى حد كبير p300 هات النشاط(الشكل 1B, الممرات 2-4 مقابل 1 حارة). في لين 6، لم يضاف أسيتيل-COA إلى رد الفعل، ويعمل بمثابة سيطرة سلبية لحفز P300 والمستويات القاعدية من أسيتيل هيستون على H3.1 المؤتلف(الشكل 1B). p300 وH3.1 مستويات البروتين واستخدمت كضوابط التحميل (الشكل 1B). تم تحديد هذه النتائج المناعية كميا باستخدام ImageJ39 (الشكل 1C). تم حساب التغييرات أضعاف عن طريق مقارنة شدة النطاق لكل عينة إلى كثافة الفرقة من التحكم DMSO لكل مسبار أسيتيل. يظهر القياس الكمي لحمض الأناكارديك في 100 ميكرومتر انخفاض قوي في H3K18ac و H3K9ac مقابل التحكم في DMSO ، مما يؤكد النتائج البصرية في الشكل 1B.

في Chromatin فرط الاضاءة تثبيط (تشاي) مقايسة, يستخدم HDACi كأداة لhyperacetylate الهستونات في كروماتين قبل المشاركة الحضانة مع HATi24, مثل مثبطات P300 A-4852,4. والغرض من هذا الفحص هو تحديد فعالية HATi لتكويد hyperacetylation هيستون الناجمة عن HDACi. الشكل 2A يوفر تخطيطي تجريبيا لمحسب ChHAI. في هذا الفحص، علاج خلايا MCF-7 مع HDACi MS-275 بقوة أعلى من تنظيم أسيتيل على هيستون 3، على العديد من بقايا ليسين(الشكل 2B، حارة 4 مقابل حارة 1). كانت المستويات القاعدية من H3K18ac وH3K27ac منخفضة، مما يدل على فوائد إضافة HDACi في مقايسة تشاي(الشكل 2B، الممرات 1-3). إضافة A-485 مع MS-275 يخفف من أسيتيليشن حجر حجر متزايد في H3K18 وH3K27، ولكن ليس H3K9(الشكل 2B،الممرات 4-6). الأهم من ذلك، لا يتم تنظيم H3K9ac من قبل p300 في خلية ثقافة2، مما يدل على خصوصية A-485 في هذه التجربة. وقد تم تحديد هذه النتائج المناعية كميا في الشكل 2C. تم حساب التغييرات أضعاف عن طريق مقارنة شدة الفرقة من كل عينة لشدة الفرقة من MS-275 وحدها (حارة 4) لكل مسبار أستيليشن. لم يتم تحديد الممرات 1-3 كمياً لأن مستويات H3K18ac وH3K27ac القاعدية لم يتم اكتشافها.

Chromatin المناعية -كمي البوليميراز سلسلة التفاعل (ChIP-qPCR) هي تجربة ثقافة الخلية التي تحقق التفاعلات الحمض النووي البروتين في مناطق محددة من الجينوم. ويمكن استخدامه للتحقيق في آثار HATi في العناصر التنظيمية الجينات التي تتحكم في التعبير oncogene25. يوفر الشكل 3A تخطيطياً تجريبياً لبروتوكول ChIP-qPCR. وقد تعرضت الخلايا MCF-7 المعالجة بـ 3 ميكرومتر A-485 لمدة 24 ساعة إلى ChIP-qPCR من خلال الاعوَزِع المناعي لمجمعات هيستون-دنا المخصبة في H3K27ac(الشكل 3). تم تحليل الحمض النووي المنقى لسلسلة المروج Cyclin D1. تم تصميم التشريبات ChIP-qPCR على شكل تسلسل الحمض النووي المحدد في الجينوم وتستخدم للكشف عن الكمية النسبية للحمض النووي المُعجل. ويعكس مقدار الحمض النووي المُعجل وفرة البروتين الذي يهمّ في منطقة الجينوم التي يجري التحقيق فيها. في الواقع، في عينة DMSO، والحمض النووي التي عجلت بها الأجسام المضادة IgG التحكم تنتج قيمة أعلى من الأشعة المقطعية من الأجسام المضادة H3K27ac في تفاعل qPCR لCyclin D1 المروج (الشكل 3B). وهذا يشير إلى أن التحكم غير محددة IgG عجلت أقل DNA البروتينات من الأجسام المضادة H3K27ac محددة في المروج D1 Cyclin. وهذا يترجم إلى 632.73 أضعاف إثراء H3K27ac على السيطرة غير محددة IgG(الشكل 3B).

يوفر هذا الإثراء أضعاف دليلا على أن الأجسام المضادة H3K27ac محددة بنجاح الاسيتيلات المثبطة المناعية وh3K27ac يتم إثراء في المروج Cyclin D1. بعد التحقق من جودة الأجسام المضادة H3K27ac، يمكن إجراء مقارنة بين مجموعات DMSO و A-485 المعالجة. وكما هو مبين في الشكل 3C،فإن A-485 يقلل من إثراء H3K27ac في مُروج Cyclin D1 مقابل التحكم في DMSO باستخدام طريقة %Input (النتيجة التمثيلية لـ n=2). الأهم من ذلك، ومن المعروف A-485 للحد بشكل كبير H3K27ac في خلية ثقافة2،4.

يمكن أن تكون قيم الإدخال %الخام من ChIP-qPCR متغيرة للغاية بين النسخ المتماثلة البيولوجية المستقلة، على الرغم من أن الاتجاه التجريبي قابل للتكرار. ولذلك، قد يكون من المفيد تقديم البيانات باعتبارها نسبة مئوية تطبيع من مراقبة DMSO لإظهار نسبة استنساخها بين السيطرة والعلاج من المخدرات10. على سبيل المثال، في الشكل 3D، A-485 downregulates H3K27ac بشكل ملحوظ الشغل في المروج Cyclin D1 (n = 2). استند التحليل الإحصائي إلى اختبار T للطالب (*P < 0.05).

Figure 1
الشكل 1: حمض الأناكاردك يمنع p300 النشاط الأنزيمي في اختبار HAT. (أ) رسم تخطيطي للمقتن HAT، يصور رد الفعل الأنزيمي. (B) حمض الأناكارديك منعت بقوة p300 نشاط انزيمي و downregulated acetylation هيستون في H3K18 وH3K9 في 100 μM (حارة 5) مقابل DMSO معالجة التحكم (حارة 1). لين 6 يفتقر أسيتيل-COA في رد الفعل، وخدم بمثابة سيطرة سلبية لاسيتيليشن هيستون. (C)تم تحديد نتائج مناعية في (ب) كميا. تم حساب التغييرات أضعاف عن طريق مقارنة شدة النطاق لكل عينة إلى كثافة الفرقة من التحكم DMSO لكل مسبار أسيتيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: p300 المانع A-485 يخفف بقوة فرط acetylation في مقايسة تشاي. (أ) رسم تخطيطي لم مقايسة ChHAI. (B) في خلايا MCF-7 ، مثبطات HDAC MS-275 رفع من الأسيتيل الهيستون بقوة في H3K18 و K27 و K9 (حارة 4) مقابل التحكم في DMSO (حارة 1). إضافة A-485, المعروف P300 هات المانع, مع MS-275 في تخفيف الزيادة في الأسيتيل هيستون في H3K18 وK27, ولكن ليس H3K9 (الممرات 5-6 مقابل حارة 4). (C)تم تحديد نتائج مناعية في (ب) كميا. تم حساب التغييرات أضعاف عن طريق مقارنة شدة الفرقة من كل عينة لشدة الفرقة من MS-275 وحدها (حارة 4) لكل مسبار أستيليشن. لم يتم تحديد الممرات 1-3 كمياً لأن مستويات H3K18ac وH3K27ac القاعدية لم يتم اكتشافها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: p300 مثبط A-485 يقلل مستويات H3K27ac في المروج Cyclin D1 كما يقاس ChIP-qPCR. (A) رسم تخطيطي لبروتوكول ChIP-qPCR. (ب)ممثل قيم QPCR Ct لمروج Cyclin D1 للIgG و H3K27ac المناعية. كان عنصر تحكم IgG أعلى قيمة Ct، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة H3K27ac المخصب بنجاح لH3K27ac على الأجسام المضادة IgG غير محددة. (C) A-485 (3 μM) لعلاج 24 ساعة h downregulated H3K27ac في المروج Cyclin D1 بالمقارنة مع العلاج التحكم DMSO في الخلايا MCF-7 (نتيجة تمثيلية من n = 2). (D) تم تطبيع الإدخال %من تجربتي ChIP مستقلتين إلى عنصر تحكم DMSO كنسبة مئوية من عنصر تحكم DMSO. العلاج مع A-485 في خلايا MCF-7 بشكل كبير downregulates H3K27ac إشغال في المروج Cyclin D1. استند التحليل الإحصائي إلى اختبار T للطالب (*P < 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخزن المؤقت وصفه
10X الجليسين العازلة 18.74 غرام من الجليسين مع برنامج تلفزيوني حتى يذوب وإضافة برنامج تلفزيوني إلى 200 مل.
10X تشغيل المخزن المؤقت 250 mM تريس، 1.9 M الجليسين، 1٪ SDS
تذوب 30.0 غرام من قاعدة تريس، 144.0 غرام من الجليسين، و 10.0 غرام من SDS في 1000 مل من H2O. وينبغي أن يكون 8.3 من 8.3 وينبغي أن يكون من ثمّة حاجة إلى تعديل للرّيّة. قم بتخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة وخفف إلى 1X قبل الاستخدام.
10X تست 2.42 غرام من قاعدة تريس، 8G من كلوريد ال NaCl، 2 مل من 50٪ توين 20، إضافة ddH2O إلى 1 لتر
1X TBST مع 5٪ حليب 5 غ حليب بودرة لكل 100 مل من 1X تيرابايت
5X مخزن مؤقت: 500 mM HEPES، وhH 7.5، 0.4 ٪ تريتون X-100
5X العازلة تحلل السلبي جعل مخزون مائي يحتوي على 125 mM تريس، pH 7.8، 10 mM 1،2-CDTA، 10 M DTT، 5 ملغ/ مل BSA، 5٪ (vol/vol) تريتون X-100 و 50٪ (فول/ فول) الجلسرين في ddH2O.
6X دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) 0.375 M تريس درجة PH 6.8، 6 مل غليسرول، 1.2 ز SDS، 0.93 غرام 1،4-dithiothreitol (DTT)، 6 ملغ بروموفينول الأزرق، إضافة الماء إلى 10 مل.
مخزن تخفيف ChIP 0.01% SDS, 1.1% تريتون X-100, 1.2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl
مخزن مؤقت لـ ChIP Elution 1٪ SDS (ث / الخامس) و 0.1 M NaHCO3 في ddH2O autoclaved
DMEM كاملة لخلايا MCF-7: Dulbecco معدلة النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ من الأبقار العجل المصل (BCS) ، البنسلين (10 وحدات / مل) ، وstreptomycin (10 ملغ / مل)
ارتفاع الملح غسل العازلة 0.1% SDS, 1% تريتون X-100, 2 mM EDTA, 200 mM تريس-HCL pH 8.0, 500 mM NaCl.
LiCl غسل العازلة 0.25 م لى كل، 1% NP-40، 1% ديوكسيتشولات الصوديوم، 1 mM EDTA، 100 mM تريس-HCl pH 8.0.
انخفاض الملح غسل العازلة 0.1% SDS, 1% تريتون X-100, 2 mM EDTA, 200 mM تريس-HCL pH 8.0, 150 mM NaCl.
مخزن تورم النوى 5 mM PIPES pH 8.0، 85 mM KCl، 0.5٪ NP-40
المخزن المؤقت للتحلل من SDS 1٪ SDS، 10 mM EDTA، 50 M تريس-HCl 8.0
المخزن المؤقت TE 10 mM تريس-HCl pH 8.0، 1 mM EDTA.
نقل المخزن المؤقت 25 mM تريس، 190 mM جليكين، 20٪ الميثانول والتحقق من درجة اله PH والتكيف مع درجة الH 8.3 إذا لزم الأمر.

الجدول 1: وصفات المخازن المؤقتة والحل المستخدمة.

الملفات التكميلية: مخططات تجريبية تكميلية للبروتوكولات 1-3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ليسين أستيلtransferases (KATs) أسيتيلات عدة بقايا ليسين على ذيول هيستون وعوامل النسخ لتنظيم النسخ الجيني2,3. وقد كشف العمل في العقدين الماضيين أن KATs ، مثل CBP / p300 ، PCAF و GCN5 ، تتفاعل مع عوامل النسخ oncogenic وتساعد على دفع نمو الورم في العديد من أنواع الأورام الصلبة4،5،9،15،16،17،18.9 نظرًا لدورها الناشئ في تعزيز نمو الأورام ، يتم التحقيق في KATs كأهداف جديدة في علاج السرطان. تحتاج مثبطات الـ KAT الجديدة (KATi) إلى اختبار دقيق ودقيق لفاعلية وانتقائية وأمان قبل الانتقال إلى الاستخدام في العيادة. وقد أظهرت الأدلة الأخيرة أن المركبات KATi الموصوفة سابقاً تظهر آثار الهدف وكانت سيئة خواصها قبل استخدامها على نطاق واسع في المؤلفات العلمية كمسبر كيميائية21. ولذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة لتوصيف KATi. ويرد وصفها هنا ثلاثة بروتوكولات يمكن استخدامها معاً لتوصيف وإثبات صحة مثبطات الرواية التي تستهدف وظيفة Acetyltransfere (HAT) من قبعات الكات: مقايسة في المختبرات قبعة، مقايسة تشاي، و ChIP-qPCR. وتستخدم هذه البروتوكولات CBP/p300 ومثبطاتها كأمثلة، ولكن يمكن بسهولة تكييف هذه الطرق للتطبيق في المستقبل في التحقيق في منتجات الـ KATs الأخرى.

إن اختبار HAT بسيط وطريقة فعالة من حيث التكلفة لفحص المركبات للفعالية في وظيفة HAT المثبطة في أنبوب الاختبار. يمكن اختبار HATs المنقية (إماالمؤتلفة 4أو10 أو40مناعي ) في هذا الفحص ، ولكن يتم استخدام CBP/p300 المؤتلف كمثال في هذا البروتوكول. CBP/p300 لها مجال HAT الأنزيمية التي تنقل مجموعة أسيتيل من أسيتيل-COA إلى بقايا ليسين على الركيزة المستهدفة3. أكثر تتميز CBP/p300 هيستون الأهداف هيستون 3 Lysine 18 و 27 (H3K18 و H3K27 على التوالي)2,3,10,11. في مقايسة HAT ، يتم احتضان المجال P300 HAT المنقى مع Acetyl-CoA و Histone 3.1 كركيزة. خلال فترة الحضانة، سوف p300 تحفيز أسيتيل على العديد من المخلفات H3.1 بما في ذلك H3K18 و H3K27. ويمكن قياس الوفرة النسبية للأسيتيل على هذه المخلفات عن طريق مناعة. ويمكن استخدام هذا التفاعل أنبوب الاختبار لفحص للمركبات الجديدة التي ترتبط P300 وتمنع نشاطها HAT (HATi). على سبيل المثال، حمض anacardic، المعروف HATi38، downregulates بقوة acetylation هيوتستون في كل من H3K18 وH3K9 بالمقارنة مع مراقبة DMSO(الشكل 1B، حارة 5 مقابل حارة 1). من المهم للغاية إضافة Acetyl-CoA إلى التفاعلات التجريبية(الشكل 1B، الممرات 1-5) أو p300 الحفز من أسيتيل هيستون لن يحدث(الشكل 1B، حارة 6). كما يمكن استخدام غياب أسيتيل-CoA كتحكم سلبي في الحفز P300 والمستويات القاعدية لأسيتيل الهيستون على H3.1 المؤتلف.

عند إجراء فحص HAT، من المهم التأكد من أن كل رد فعل يتلقى نفس الكمية من p300، H3.1 و Acetyl-CoA. H3.1 وp300 المستويات في مناعية بمثابة ضوابط التحميل للجل. لهذا الفحص، يمكن استخدام الأجسام المضادة للأسيتيل الأسيتول الخاصة بالموقع أو الأجسام المضادة عموم الأسيتيل للمناعة. عند تحسين لتحسين نوعية المناعة فمن الأهمية بمكان استخدام الأجسام المضادة التحقق من الصحة من أجل مناعة واتباع توصيات الشركة المصنعة في البداية لتخفيف الأجسام المضادة. التخفيفات المضادة المستخدمة في قسم البروتوكول هي للإشارة ويمكن تغيير التخفيفات بناء على نتائج التجارب الأولية (على سبيل المثال، إذا كانت الإشارة قوية جداً يمكن تخفيف الجسم المضاد أكثر). نظرًا لبساطته ، فإن اختبار HAT هو تجربة بداية ممتازة لفحص مثبطات الرواية. ومع ذلك ، فإن قبعة المقايسة لديها عيوب. من الشواغل الرئيسية مع اختبار HAT هو أن المركبات التي تكون فعالة في أنبوب اختبار قد يثبت عدم فعاليتها في نظام المعيشة. هذه هي المسألة لأن فعالية المركبة في الخلية يمكن أن تتغير من قبل قضايا نفاذية الخلوية، والتمثيل الغذائي الخلوي، والاستقرار المركب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن KATs ، وبالتحديد CBP /p300 ، لديها العديد من التفاعلات البروتينية البروتينية التي تنظم نشاطها KAT في زراعة الخلايا3،41،42. ولذلك، فمن الضروري أن مزيد من تحديد خصائص مثبطات حددت في اختبار HAT في تجارب ثقافة الخلية20،23.

إن اختبار Chromatin Hyperacetylation (ChHAI) هو البروتوكول الثاني في خط الأنابيب ومفيد للتحقق من آثار مثبطات الرواية في ثقافة الخلية. يستخدم هذا المقايسة مثبطات HDAC (HDACi)24 للحث على فرط acetylation هيستون في الخلايا لأن الأسيتيل القاعدي يمكن أن تكون منخفضة جدا للكشف على مناعة. خطوط الخلية في الاختيار هي قبل المحتضنة مع HDACi للسماح لتراكم الكروماتين أسيتيلات قبل إضافة هاتي. بعد المشاركة في احتضان HDACi وHTI ، يتم lysed الخلايا وتخضع لإجراءات مناعة قياسية لمواقع استيلات هينيستون محددة. والغرض من هذا الفحص هو تحديد فعالية رواية HATi لتكويد hyperacetylation هيستون الناجمة عن HDACi. الخلايا المعرضة لHDACi ينبغي أن يكون مستويات أعلى بكثير من أسيتيل هيستون من الخلايا المعرضة لمذيبات DMSO(الشكل 2B، حارة 4 مقابل حارة 1). ومن المتوقع إضافة HATi جنبا إلى جنب مع HDACi للحد من إشارة مناعي بالمقارنة مع العلاج HDACi وحدها(الشكل 2B، الممرات 5-6 مقابل حارة 4). مستويات القاعدية من أسيتيل هيستون(الشكل 2B، 1-3 الممرات) من الصعب الكشف عن ويسلط الضوء على أهمية إضافة HDACi في هذا البروتوكول. MS-275 (إنتينوستات) يستخدم كمثال ولكن يمكن استخدام HDACi الأخرى24,43. MS-275 لديها تركيزات مثبطة مُتقلبة مُبلغ عنها مقابل الفئة I HDACs وعموماً تمنع HDAC1 و HDAC3 مع نانومولار لتركيزات منخفضة من المغذيات الدقيقة، على التوالي43،,44. وتستخدم مجموعة واسعة من تركيزات MS-275 في الأدب45,46,47, ولكن العلاج 3 μM يوفر زيادة قوية وقابلة للتكرار في أستيل حجر في الخلايا MCF-7. لذلك، قد يكون من المفيد إجراء شاشة أولية مع مجموعة واسعة من تركيزات HDACi وHTI لتحديد التركيز الأمثل لم مقايسة تشاي عند استخدام خط خلية مختلف.

على غرار مقايسة HAT، قد يحتاج بروتوكول مناعي إلى تحسين الحصول على نتائج عالية الجودة من خلال استخدام الأجسام المضادة المناسبة، وتخفيفات الأجسام المضادة المثلى وتحميل العينات التي يتم التحكم فيها بعناية. تحميل العينات التي يتم التحكم فيها بعناية أمر ضروري لنجاح هذا البروتوكول ويمكن تحقيقه من خلال توازن محتوى البروتين لجميع العينات ومن خلال الأنابيب حجم متساو من العينات في آبار هلام مناعي. ويمكن استخدام الأجسام المضادة عموم أسيتيل ل Probbing في هذا البروتوكول. ومع ذلك، ينبغي أن تستكمل مع الأجسام المضادة أسيتيل الموقع محددة لأن KATs لها خصوصية لبعض بقايا lysine هيستون وهاتي لا يؤثر على جميع مواقع الأسيتيل histone في ثقافة الخلية1،2،4،5،10،11. مثبطات قوية في الحد من أسيتيل هيستون في كل من هات ومجازات ChHAI هي مرشحون أقوياء لمزيد من التقييم. الأهم من ذلك، فإن قبعة ومخازات ChHAI لها حدود فقط توفير البيانات حول التغيرات العالمية في acetylation هيستون. وهذا القيد يخلق الحاجة إلى توصيف آثار رواية HATi في مناطق محددة من الجينوم.

Chromatin المناعية - كمية البوليميراز سلسلة التفاعل (ChIP-qPCR) هو البروتوكول النهائي في خط الانابيب ويقيم التفاعلات الحمض النووي البروتين في مناطق معينة من الجينوم. في هذا الفحص، يتم تنقية المناطق الجينومية المخصبة في H3K27ac من خلال التحلل المناعي (IP) وتحليلها باستخدام الاعوائية الحمض النووي في qPCR. هذه التقنية يوفر رؤية ميكانيكية في كيفية HATi يؤثر على تعديلات هيستون في المروجين للجينات والمعززات. ChIP-qPCR هي تقنية قوية وأقل تكلفة من تسلسل الجينوم الكامل (على سبيل المثال، ChIP-seq)، ولكن قد يكون من الصعب تحسينه بسبب العديد من الخطوات التي تؤثر على النتيجة. الخطوة الأكثر صعوبة لتحسين بشكل صحيح هي الخطوة 3.5، والمناعة. هذه الخطوة من الصعب تحسين لأنه إذا كان الحمض النووي المنقى في الخطوة 3.5.20 هو مخفف للغاية يمكن أن يسبب نتائج سيئة في تفاعل qPCR (على سبيل المثال، لا تضخيم التسلسل الجيني الهدف وقيم عالية جدا ΔCt). يعتمد نجاح خطوة IP على عدة عوامل، مثل وفرة هدف البروتين من الفائدة وجودة الأجسام المضادة IP. من الأهمية بمكان التحقق من جودة الأجسام المضادة IP H3K27ac مقابل التحكم IgG للتحقق من نجاح خطوة IP. على سبيل المثال، في الشكل 3B،يعرض الجسم المضاد H3K27ac 632.73-امضاعفة التخصيب على التحكم غير محددة IgG. وهذا يشير إلى أن الأجسام المضادة H3K27ac ذات جودة عالية وأن H3K27ac يتم إثراؤه في المروج Cyclin D1. بعد التحقق من صحة الأجسام المضادة IP، يمكن إجراء مقارنة بين DMSO و A-485 المجموعات المعالجة. وكما هو مبين في الشكل 3C،فإن A-485 يقلل من إثراء H3K27ac في مُروج Cyclin D1 مقابل التحكم في DMSO باستخدام طريقة %Input (النتيجة التمثيلية لـ n=2). إذا كان الجسم المضاد IP يثبت أن تكون ذات جودة منخفضة ولا تظهر الإثراء أضعاف في التجارب الأولية، حاول زيادة أرقام الخلية في الخطوة 3.2.1. يمكن أن تساعد أرقام الخلايا الأعلى في تعويض جودة الأجسام المضادة السيئة عن طريق زيادة المحتوى البروتيني الإجمالي للlysate وسيتيح إضافة المزيد من البروتين إلى رد فعل IP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح أو إفصاحات.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جيمس واستير كينغ برنامج البحوث الطبية الحيوية (6JK03 و 20K07)، وبرنامج أبحاث السرطان Bankhead-Coley (4BF02 و 6BC03)، ووزارة الصحة في فلوريدا، ومؤسسة فلوريدا لسرطان الثدي، ومركز السرطان الصحي UF. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر الدكتور زاكاري أوكينغ والدكتور أندريا لين على دعمهما خلال عملية النشر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

أبحاث السرطان الإصدار 162 lysine acetyltransferases KATs CBP/p300 مثبطات الأسيتيلtransferase هيستون طرق الفحص أسيتيل هيستون علم الوراثة سرطان تنظيم الجينات
مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter