Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyser til validering af Histone Acetyltransferase hæmmere

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

Hæmmere af histone acetyltransferaser (HATs, også kendt som lysin acetyltransferases), såsom CBP/p300, er potentielle terapeutiske til behandling af kræft. Men, strenge metoder til validering af disse hæmmere er nødvendige. Tre in vitro metoder til validering omfatter HAT assays med rekombinant acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylation i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Abstract

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyse acetylation af lysinrester på histoner og andre proteiner til regulering af kromatindynamik og genekspression. KATs, såsom CBP/p300, er under intens undersøgelse som terapeutiske mål på grund af deres kritiske rolle i tumorigenesis af forskellige kræftformer. Udviklingen af nye små molekylehæmmere rettet mod histone acetyltransferase (HAT) funktion af KATs er udfordrende og kræver robuste analyser, der kan validere specificitet og styrken af potentielle hæmmere.

Denne artikel skitserer en pipeline af tre metoder, der giver streng in vitro validering for nye HAT-hæmmere (HATi). Disse metoder omfatter et reagensglas HAT-analyse, Chromatin Hyperacetylation Hæmning (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitative PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinant HAT'er med histoner i et reagensglas, hvilket giver mulighed for acetylation af specifikke lysinrester på histonehalerne. Denne reaktion kan blokeres af en HATi, og de relative niveauer af stedsspecifikke histoneacetylation kan måles via immunblotting. Inhibitorer identificeret i HAT-analysen skal bekræftes i cellemiljøet.

ChHAI-analysen bruger immunoblotting til at screene for nye HATi, der dæmper den robuste hyperacetylation af histoner fremkaldt af en histone deacetylasehæmmer (HDACi). Tilføjelsen af en HDACi er nyttigt, fordi basale niveauer af histon acetylation kan være svært at opdage via immunoblotting.

HAT- og ChHAI-analyserne måler globale ændringer i histonacetylation, men giver ikke oplysninger om acetylation i specifikke genomiske regioner. Derfor anvendes ChIP-qPCR til at undersøge virkningerne af HATi på histonacetylationsniveauer ved genregulerende elementer. Dette opnås gennem selektiv immunudfrielse af histone-DNA-komplekser og analyse af det rensede DNA gennem qPCR. Tilsammen giver disse tre analyser mulighed for omhyggelig validering af specifikke forhold, styrke og virkningsmekanisme af nye HATi.

Introduction

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylation af lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner1,2,3,4. Nyere forskning viser, at KATs og deres acetyltransferase funktion kan fremme solid tumor vækst4,,5,,6,,7,,8,9. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP)/p300 to paraloge KATs, der regulerer mange signalveje i kræft2,3. CBP/p300 har en vel karakteriseret histon acetyltransferase (HAT) funktion og katalysse Histone 3 Lysin 27 acetylation (H3K27ac)2,4,5,10,11, en vigtig markør for aktive smagsforstærkere, promotor regioner og aktiv gen transskription12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske co-aktivatorer for pro-vækst signalering veje i faste tumorer ved at aktivere transskription af onkogener gennem acetylation af histonerogandre transskription faktorer4,9,15,16,17,18. På grund af deres rolle i tumor progression, CBP/p300 og andre KATs er under efterforskning for udvikling af nyehæmmere,der blokerer deres onkogen funktion4,5, 6,6,7,,8,9,18,19,20. A-485 og GNE-049 repræsenterer to vellykkede forsøg på at udvikle potente og specifikke hæmmere til CBP/p3004,9. Yderligere inhibitorer er i øjeblikket ved at blive undersøgt for CBP/p300 og andre kats.

Kvaliteten af tidligere beskrevne KAT-hæmmere (KATi) sættes spørgsmålstegn ved, med mange inhibitorer viser off måleffekter og dårlig karakterisering21. Derfor er streng karakterisering og validering af nye lægemiddelkandidater afgørende for udviklingen af kemiske sonder af høj kvalitet. Skitseret her er tre protokoller, der danner en pipeline til screening og strengt validere styrken og specificiteten af nye KATi, med særligt fokus på at hæmme HAT funktion (HATi) af KATs. CBP/p300 og deres hæmmere bruges som eksempler, men disse protokoller kan tilpasses til andre KAT'er, der har hat-funktion7.

Den første protokol er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) assay, der udnytter renset rekombinant p300 og histoner i et kontrolleret reagensglas reaktion. Denne analyse er enkel at udføre, er omkostningseffektiv, kan bruges til at screene forbindelser i en lav gennemløb indstilling, og kræver ikke radioaktive materialer. I denne protokol katalyserer rekombinant p300 lysinacetylation på histonehaler i løbet af en kort inkubationstid, og niveauerne af histonacetylation måles ved hjælp af standardimmunoblottingprocedurer. Den enzymatiske reaktion kan udføres i nærvær eller fravær af CBP/p300-hæmmere til at screene for forbindelser, der reducerer histonacetylation. Derudover kan HAT-analysen bruges til at kontrollere, om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved at vurdere deres aktivitet i forhold til andre rensede KAT'er, såsom PCAF. HAT-analysen er et glimrende udgangspunkt for at undersøge nye hæmmere på grund af sin enkelhed, lave omkostninger, og evnen til at bestemme styrken / selektiviteten af en hæmmer. Faktisk er denne protokol ofte bruges i litteraturen som en in vitro skærm5,10. Men, inhibitorer identificeret i HAT analysen er ikke altid effektive i cellekultur, fordi et reagensglas reaktion er meget enklere end en levende celle system. Det er derfor vigtigt yderligere at karakterisere hæmmere i cellekultureksperimenter22,23.

Den anden protokol i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Hæmning (ChHAI) assay. Denne cellebaserede analyse anvender histone deacetylasehæmmere (HDACi) som et værktøj til at hyperacetylate histoner i kromatin før co-inkubation med en HATi24. Basal histonacetylation kan være lav i cellekultur, hvilket gør det vanskeligt at sonde for via immunoblotting uden tilsætning af en HDACi at øge acetylation. Formålet med ChHAI-analysen er at identificere nye HATi, der kan dæmpe stigningen i histonacetylation forårsaget af HDAC-hæmning. Fordelene ved denne analyse omfatter dens lave omkostninger, relativ lethed at udføre, og brugen af celler i kultur, som giver mere fysiologisk relevans end reagensglas HAT assay. I lighed med HAT-analysen bruger denne protokol standardimmunisering til dataindsamling.

HAT og ChHAI-analyserne giver data om styrken af nye forbindelser til at hæmme global histonacetylation, men giver ikke indsigt i, hvordan disse forbindelser påvirker modifikationer i specifikke genomiske regioner. Derfor er den endelige protokol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment, der undersøger DNA-protein interaktioner i bestemte områder af genomet. I ChIP-protokollen krydslinkes kromatin for at bevare DNA-proteininteraktioner. Kromatin udvindes derefter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gennemgår selektiv immunoprecipation for det pågældende protein (f.eks. ved hjælp af et antistof, der er specifikt for H3K27ac). DNA'et renses og analyseres derefter ved hjælp af qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR bruges til at afgøre, om en ny HATi nedregulerer histonacetylation på individuelle oncogenes, såsom Cyclin D125. Mens ChIP-qPCR er en almindelig teknik, der anvendes i marken, kan det være svært at optimere4,10,26. Denne protokol indeholder tip til at undgå potentielle faldgruber, der kan opstå under udførelse af ChIP-qPCR-proceduren, og omfatter kvalitetskontrolkontroller, der skal udføres på dataene.

Når disse tre protokoller bruges sammen, giver de mulighed for streng karakterisering og validering af nye HATi. Derudover tilbyder disse metoder mange fordele, fordi de er nemme at udføre, relativt billige og levere data om globale såvel som regionale histon acetylation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In vitro HAT-analyse

  1. Forberedelse af buffer
    BEMÆRK: Se tabel 1 for bufferopskrifter.
    1. Der tilberedes 5x analysebuffer og 6x natriumdycylsulfat (SDS), og opbevares ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots.
    2. Forbered 10x SDS gel løbebuffer og 10x TBST og opbevares ved stuetemperatur.
    3. Der klargørs 1x overførselsbuffer og opbevares ved 4 °C.
      FORSIGTIG: Kontroller sikkerhedsdatabladet for alle kemikalier, der anvendes i denne protokol. SDS, DTT og bromophenolblå er giftige og må ikke indtages, inhaleres eller udsættes for hud eller øjne. Se sikkerhedsdatabladet for korrekt håndteringsprocedurer. Brug en kemisk røghætte til håndtering af farlige kemikalier.
  2. HAT reaktion
    BEMÆRK: Anakarinsyre er en kendt p300-hæmmer3 og bruges som et eksempel til at demonstrere, hvordan HAT-analysen kan identificere nye p300-hæmmere. Se supplerende protokol (skema 1) for en skematisk af trin 1.2.1.
    1. Følgende enzymatiske reaktion klargørs i et 0,2 ml PCR-rør: 2 μL 5x analysebuffer 1 μL renset p300 (0,19 μg/μL), 1 μL anacardinsyre (HATi) eller DMSO-kontrol fortyndet i 1x assaybuffer og 2 μL autoklaveret ddH2O. Inkuber denne blanding for 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 3 μL af 100 μM Acetyl-CoA og 1 μL renset H3.1 (0,2 μg/μL) til reaktionen.
    2. Den komplette reaktionsblanding inkuberes ved 30 °C i 1 time i en PCR-termiskcykelcykator.
    3. Der tilsættes 2-mercaptoethanol i forholdet 1:10 til 6x SDS-prøvebufferen.
    4. Prøverne fjernes fra PCR-termocyratoren, og der tilsættes 2 μL 6x SDS (med tilsat 2-mercaptoethanol) i reaktionsblandingen.
      FORSIGTIG: 2-mercaptoethanol er giftigt og bør anvendes inde i en kemisk røghætte. Se sikkerhedsdatabladet for korrekt håndtering.
    5. Varm prøverne ved 95 °C i 5 minutter på en varmeblok og afkøles på is. Prøverne opbevares ved -20 eller -80 °C, eller der udføres gelelektrophorsis og immunblotting som beskrevet nedenfor.
  3. Gelelektrophoresis og immunpudsning
    BEMÆRK: Hvis du ikke er bekendt med gelelektrophoresis og immunafblotting, skal du se denne standardprocedure27 for at få yderligere oplysninger om, hvordan trin 1.3.1-1.3.17 udføres. Yderligere oplysninger kan findes her28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 μL prøver (fra trin 1.2.5.) i brøndene på en 4-20% gradient polyacrymidgel. Pipette 5 μL proteinstigen i en af brøndene som molekylvægtreference. Kør gelen ved 120 V i 90 minutter ved hjælp af en geltank.
    2. Gelen overføres til en polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) ved 100 V i 70 minutter ved hjælp af en overførselstank.
    3. Fjern membranen fra overførselsapparatet, og læg den i en plastbeholder. Membranen blokeres ved at tilsætte 1x TBST (indeholdende 5% mælk) til beholderen og ryst forsigtigt i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Fjern 1x TBST fra trin 1.3.3. 1:5.000 fortynding i 1x TBST indeholdende 5 % mælk ved 4 °C ved let omrystning, inkuberes membranen natten over med udvalgte stedspecifikke acetyleantistoffer (f.eks.
    5. Fjern den primære antistofopløsning. Membranen vaskes 2x med 1x TBST (ingen mælk) ved stuetemperatur med forsigtig omrystning i 15 minutter hver vask.
    6. Det sekundære antistof fortyndes ved 1:20.000 i 1x TBST (indeholdende 5% mælk), og inkuber membranen i 1 time ved stuetemperatur ved forsigtig omrystning.
    7. Den sekundære antistofopløsning fjernes. Membranen vaskes 2x med 1x TBST (ingen mælk) ved stuetemperatur med forsigtig omrystning i 15 minutter hver vask.
    8. Hæld 1x TBST ud af membranen. Bland HRP substratperoxidopløsning og HRP substrat luminolopløsning i et 1:1-forhold (1 ml af hver) og pipette 2 ml af den kombinerede opløsning til membranoverfladen.
    9. Opløsningen inkuberes med membranen i 5 min. ved stuetemperatur.
    10. Hæld overskydende chemiluminescerende underlag fra membranen på en køkkenrulle og læg membranen i plastfolie inde i en røntgenkassetteholder.
    11. Flyt til et mørkt rum dedikeret til røntgenfilm behandling. Udsæt membranen for en røntgenfilm ved at placere filmen oven på membranen og lukke kassetten i 30 s.
      BEMÆRK: Tidspunkt for kontakt mellem filmen og membranen skal bestemmes eksperimentelt. Stærke signaler kræver korte eksponeringer (sekunder), og svagere signaler kan have brug for længere eksponeringer.
    12. Fjern røntgenfilmen fra kassetten, og betaf filmen ved at køre den gennem en røntgenfilmprocessor. Se producentens manualer for at få specifikke instruktioner om, hvordan røntgenfilmen behandles.
    13. Fjern membranen fra plastfolien og vask den med ddH2O i 5 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
    14. Membranen inkuberes med 0,2 M NaOH i 5 min. ved stuetemperatur med let omrystning.
    15. Membranen vaskes med ddH2O i 5 minutter ved stuetemperatur med let omrystning.
    16. Membranen blokeres ved at tilsætte 1x TBST (indeholdende 5% mælk) til beholderen og ryst forsigtigt i 1 time ved stuetemperatur.
    17. Den næste primære antistoffortynding (f.eks. sonde for H3K27ac, hvis det første anvendte antistof var H3K18ac), rystes natten over ved 4 °C. Trin 1.3.4-1.3.17 gentages, indtil alle antistofsonder er afsluttet.

2. ChHAI-analyse

  1. In vitro lægemiddel behandlinger og analyse af acetylated histoner
    BEMÆRK: A-485 er en potent og godt karakteriseret p300 HATi2,4 . Denne hæmmer vil blive udnyttet i de resterende analyser på grund af dens effektivitet og specificitet i cellekultur. MS-275 (Entinostat)24 er en HDACi, der markant øger histon acetylation niveauer og bruges til at lette lettere påvisning af acetylation sonder med standard immunoblotting. Se Supplerende protokol (Skematisk 2) for et skematisk af de lægemiddelfortyndinger, der anvendes i trin 2.1.
    1. Frø 100.000 MCF-7 celler i en 12 brøndplade og lad cellerne vokse til 80-90% sammenløb i 1 ml cellekulturmedium. Marker brøndene for følgende eksperimentelle design: godt 1: DMSO kontrol (referencepunkt); godt 2: A-485 (3 μM); godt 3: A-485 (10 μM); godt 4: MS-275 (3 μM); godt 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); godt 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      BEMÆRK: Til dyrkning af MCF-7-celler skal der anvendes komplette DMEM-medier, og cellerne kan vokse ved 37 °C med 5 % CO2. Se tabel 1 for komplet DMEM opskrift.
    2. Ved 24 timer efter såning pipetteres 4 ml komplet DMEM-medie til et sterilt 15 ml konisk rør. Pipette 2 μL MS-275 (6 mM i DMSO) til 4 ml medium for en endelig koncentration på 3 μM MS-275.
    3. Pipette 2 μL DMSO til 4 ml medium i et separat sterilt 15 ml konisk rør.
      FORSIGTIG: Kontroller sikkerhedsdatabladet for korrekt håndtering af DMSO. Nogle handsketyper er ikke klassificeret til håndtering af DMSO.
    4. Aspirere cellekulturmediet fra brøndene 4-6 og pipette 1 ml 3 μM MS-275 i medium (trin 2.1.2) til hver brønd. Udmid ubrugt fortyndet MS-275.
    5. Aspirere cellekulturmediet fra brøndene 1-3 og pipette 1 ml fortyndet DMSO (trin 2.1.3) til hver brønd. Kassér ubrugt fortyndet DMSO.
    6. Returnere cellerne til inkubatoren og inkubere i 4 timer for at tillade akkumulering af acetylerede histoner i celler, der eksponeres for MS-275 (brønde 4-6).
      BEMÆRK: MS-275 er en HDACi og vil forårsage histone hyperacetylation24. Denne 4 h præ-inkubation er nødvendig for at give MS-275 at fremkalde hyperacetylation før tilsætning af A-485, hvilket reducerer histon acetylation2,4.
    7. Efter 4 timers inkubation med MS-275 forberedes følgende fortyndinger i separate sterile 1,5 ml rør ved pipettering: 1,0 μL DMSO til 1 ml DMEM-medier; 0,5 μL DMSO og 0,5 μL A-485 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier 0,5 μL DMSO og 0,5 μL A-485 (20 mM) til 1 ml DMEM-medier 0,5 μL DMSO og 0,5 μL MS-275 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier 0,5 μL A-485 (6 mM) og 0,5 μL MS-275 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier 0,5 μL A-485 (20 mM) og 0,5 μL MS-275 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier.
    8. Aspirere cellekulturmediet fra brønde 1-6 og pipette 1 ml fortynding 1 til godt 1, fortynding 2 til godt 2, fortynding 3 til godt 3, fortynding 4 til godt 4, fortynding 5 til godt 5 og fortynding 6 til godt 6.
      BEMÆRK: En generel regel er at afbalancere DMSO (opløsningsmiddel) indhold mellem forsøgsgrupper og ikke at overstige 0,1% DMSO indhold i cellekultur for at undgå cellulære toksicitet og ændringer i spredning.
    9. Returner cellerne til kuvøse og kultur i 20 timer.
    10. Efter 20 timer aspirere cellekulturmediet fra brøndene 1-6.
    11. Vask cellerne ved at pipettere 1 ml PBS til brønde 1-6. Aspirere PBS.
    12. Der tilsættes 100 μL 1x passiv lysisbuffer (se tabel 1) til brønde 1-6. Opbevar cellekulturpladen (med prøver i passiv lysisbuffer) ved −80 °C natten over for fryse-optøning og lysis af celler.
      FORSIGTIG: Kontroller sikkerhedsdatabladet for alle kemikalier, før du laver buffere. CDTA kan forårsage alvorlige øjenskader og irritation.
    13. Tø prøver ved stuetemperatur med forsigtig omrystning i 10 min. Overfør prøverne til separate 1,5 ml rør og straks placere på is.
    14. Mål proteinkoncentrationen i hver prøve. Proteinkoncentrationen kan bestemmes ved hjælp af flere veletablerede protokoller34.
    15. Ækvibibrer proteinkoncentration mellem prøverne 1-6 (i samme volumen) med 1x passiv lysisbuffer til at fortynde, efter behov.
    16. Tilføj 2-mercaptoethanol i et 1:10 forhold til 6x SDS prøvebuffer.
    17. Der tilsættes 6x SDS-prøvebuffer med 2-mercaptoethanol til prøverne 1-6 til en endelig koncentration af 1x SDS-prøvebuffer.
    18. Varm prøverne ved 95 °C i 5 minutter på en varmeblok og afkøles på is. Prøverne kan opbevares ved -20 °C eller -80 °C indtil trin 2.1.19.
    19. Pipette et volumen, der indeholder 30 μg protein til prøver 1-6 til brøndene i en 4-20% gradient polyacrylamid gel. Udfør immunblotting procedure i henhold til protokollen beskrevet i protokol 1.

3. ChIP-qPCR

BEMÆRK: Nedenstående protokol er beskrevet for hæmmere af p300 som et eksempel.

  1. Forberedelse af buffer
    BEMÆRK: Se tabel 1 for bufferopskrifter. De generelle trin i ChIP-protokollen (f.eks. bufferopskrifter, vasketider og centrifugeringstider) nedenfor ændres og tilpasses fra fabrikantens anbefalinger af et kommercielt tilgængeligt sæt (se materialetabel) og fralitteraturen 35,36.
    1. Forbered ChIP-fortyndingsbufferen, kernehævningsbufferen, en buffer med lav saltvask, høj saltvaskbuffer, LiCl-vaskebuffer og TE-buffer. Opbevares ved 4 °C.
    2. Forbered SDS lysis buffer, 10x glycin buffer og ChIP elution buffer. Opbevares ved stuetemperatur.
      FORSIGTIG: Kontroller sikkerhedsdatabladet for alle kemikalier, før du laver buffere for at sikre korrekt håndtering.
  2. Narkotikabehandling
    BEMÆRK: Se tillægsprotokol (skematisk 3) for en skematisk af de lægemiddelfortyndinger, der anvendes i trin 3.2.
    1. Seed MCF-7 celler i to 15 cm kultur retter og vokse celler til 90% sammenløb i 12 ml af den komplette DMEM medium. Marker retterne til følgende eksperimentelle design: Parabol 1: DMSO kontrol (referencepunkt); Fad 2: A-485 (3 μM).
      BEMÆRK: Til dyrkning af MCF-7-celler skal du bruge komplette DMEM-medier og vokse ved 37 °C med 5 % CO2. Se tabel 1 for komplet DMEM opskrift.
    2. I et sterilt 15 ml konisk rør pipettes 12 ml DMEM-medier og pipette 6 μL DMSO. Bland godt.
    3. I et separat sterilt 15 ml konisk rør pipetteres 12 ml DMEM-medier og pipette 6 μL A-485 (6 mM i DMSO) for at få en endelig koncentration på 3 μM A-485. Bland godt.
    4. Aspirere medierne fra fad 1 og 2.
    5. Der tilsættes 12 ml fortyndet DMSO i DMEM (trin 3.2.2.) til ret 1.
    6. Der tilsættes 12 ml 3 μM A-485 i DMEM (trin 3.2.3.) til ret 2.
    7. Returner cellekultur retter til inkubatoren og inkubere i 24 timer.
  3. Cellefiksering
    1. Pipette 330 μL (27,5 μL pr. ml) af 37% formaldehyd til det komplette medie og drej forsigtigt pladen for at blande den.
      FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt. Se sikkerhedsdatabladet for korrekt håndteringsprocedurer.
    2. Inkuber i 10 min ved stuetemperatur.
    3. Pipette 2 ml 10x glycin til pladen og hvirvle til at blande.
    4. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    5. Efter inkubation, placere retter på is og tø en aliquot af protease hæmmer cocktail.
    6. Forbered følgende løsninger til både DMSO- og A-485-prøverne ved hjælp af de buffere, der er udarbejdet i trin 3.1.
      1. 2 ml PBS med en 1:1.000 fortynding af proteasehæmmercocktail
      2. 1 ml kernehævningsbuffer med en 1:1.000 fortynding af proteasehæmmercocktail
      3. 0,5 ml SDS lysis buffer med en 1:1.000 fortynding af proteasehæmmercocktail
    7. Aspirere medierne fra cellekulturen og vask cellerne to gange med 15 ml kold PBS.
    8. Pipette 2 ml PBS med proteasehæmmercocktail (trin 3.3.6.1) til cellekulturretterne. Løft cellerne til opløsning ved hjælp af en celleskraber.
    9. Overfør cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør. Indsaml de resterende celler med yderligere PBS, hvis det er nødvendigt.
    10. Spin rør ved 800 x g ved 4 °C i 5 min. for at pellete cellerne.
    11. Inspirer supernatanten og pipette 1 ml kerner hævelse buffer med proteasehæmmer cocktail (trin 3.3.6.2) til pellet. Opslæm pellet og inkuber på is i 10 min.
    12. Centrifugerørene ved 2.700 x g ved 4 °C i 5 min. til pelletkerner.
    13. Inspirer supernatanten og pipette 0,5 ml SDS lysis buffer med proteasehæmmercocktail (trin 3.3.6.3) til pellet. Opslæm pellet og inkuber på is i 10 min.
    14. Kroatinprøverne opbevares ved -80 °C indtil trin 3.4.1, eller gå straks til trin 3.4.
  4. DNA-sonikering
    1. 130 μL kromatin overføres fra DMSO-prøven (trin 3.3.14) til to DNA-sonikeringsrør ved hjælp af en pipette (130 μL hver).
    2. 130 μL kromatin overføres fra A-485-prøven (trin 3.3.14) til to DNA-sonikeringsrør ved hjælp af en pipette (130 μL hver).
    3. Sonikere DNA'et til ca. 150-200 baseparfragmenter ved hjælp af følgende sonikatorindstillinger: Peak Incident Power (W) på 175, toldfaktor på 10%, 200 cyklusser pr. burst og 430 s behandlingstid.
      BEMÆRK: Indstillingerne for sonikering kan variere mellem modeller, og indstillingerne skal muligvis justeres for at opnå en passende fragmentstørrelse for forskellige cellelinjer.
    4. Hold prøver på is efter sonikering.
    5. Kromatin overføres til et 1,5 ml rør ved hjælp af en pipette og centrifuge ved 10.000 x g ved 4 °C i 10 min. til pelletaffald.
    6. Pipette supernatant (indeholder sonikeret kromatin) til et nyt rør og kassér snavs. Sonikeret kromatin kan opbevares ved -80 °C.
  5. Kromatin immunoprecipation (ChIP)
    BEMÆRK: Se Supplerende protokol (Skema 3) for et skema over IP-grupperne i trin 3.5.
    1. Proteinindholdet i det sonikerede kromatin for DMSO- og A-485-prøverne fra trin 3.4.6 måles. Proteinindholdet kan måles ved hjælp af veletablerede protokoller34.
      BEMÆRK: For nemheds skyld vil denne protokol antage, at proteinindholdet er lige, og at der anvendes 100 μL sonikeret kromatin. Ellers skal proteinindholdet fordeles mellem alle prøver i samme volumen.
    2. Pipette 100 μL DMSO sonikeret kromatin til to 1,5 ml rør (100 μL hver). Pipette 400 μL ChIP-fortyndingsbuffer (indeholdende en 1:1.000 fortynding af proteasehæmmercocktailen) til hvert rør for at bringe det samlede volumen op til 500 μL. Fjern 5 μL af opløsningen fra et af rørene og opbevares ved -20 °C som DMSO-indgang.
    3. Pipette 100 μL A-485 sonikeret kromatin til to 1,5 ml rør (100 μL hver). Pipette 400 μL ChIP-fortyndingsbuffer (indeholdende en 1:1000 fortynding af proteasehæmmercocktailen) til hvert rør for at bringe det samlede volumen op til 500 μL. Fjern 5 μL af opløsningen fra et af rørene og opbevares ved -20 °C som A-485 Indgang.
    4. Ved hjælp af en pipette tilsættes immunoprecipationantistoffet (IP) (f.eks. ikke-specifik IgG-kontrol eller H3K27ac specifikt antistof) til de tilsvarende rør til DMSO- og A-485-prøverne: IP #1 DMSO chromatin med IgG-antistof (5-10 μg); IP #2 DMSO-kromatin med H3K27ac antistof (5-10 μg) IP #3 A-485 kromatin med IgG-antistof (5-10 μg) IP #4 A-485 kromatin med H3K27ac antistof (5-10 μg).
    5. Tilsæt 20 μL protein En magnetisk perler til hvert rør. Sørg for, at perlerne er godt opspjænret.
    6. Prøverne roteres natten over ved 4 °C.
    7. Pellet proteinet En magnetisk perler ved hjælp af en magnetisk separator og fjern supernatanten. Forstyr ikke perlerne.
    8. Perlerne vaskes med 500 μL til 1 ml af den lave saltvaskbuffer, og der roteres i 5 minutter ved 4 °C. Udfør en hurtig spin ned, pellet perlerne ved hjælp af en magnetisk separator, og fjern supernatanten.
    9. Perlerne vaskes med 500 μL til 1 ml af den høje saltvaskbuffer, og der roteres i 5 minutter ved 4 °C. Udfør en hurtig spin ned, pellet perlerne ved hjælp af en magnetisk separator, og fjern supernatanten.
    10. Perlerne vaskes med 500 μL til 1 ml licl-vaskebufferen, og der roteres i 5 minutter ved 4 °C. Udfør en hurtig spin ned, pellet perlerne ved hjælp af en magnetisk separator, og fjern supernatanten.
    11. Perlerne vaskes med 500 μL til 1 ml TE-buffer, og der roteres i 5 minutter ved 4 °C. Udfør en hurtig spin ned. Hold perlerne i TE buffer indtil trin 3.5.14.
    12. Inputprøver (fra trin 3.5.2 og 3.5.3) fjernes fra fryseren og opbevares på is.
    13. Tø en aliquot af Proteinase K.
    14. Pellet perlerne ved hjælp af en magnetisk separator og fjern TE buffer fra perlerne (fra trin 3.5.11).
    15. Der tilsættes 100 μL ChIP-elution-buffer + 1 μL Proteinase K til hver prøve, herunder inputprøverne. Inkuber prøver med omrystning ved 62 °C i 2 timer ved hjælp af en termocykator.
    16. Efter 2 timer opvarmes prøverne til 95 °C i 10 minutter ved hjælp af en termocykator.
    17. Afkøl prøverne til stuetemperatur.
    18. Pellet magnetiske perler ved hjælp af en magnetisk separator og overføre supernatant (indeholder DNA af interesse) til en ny 1,5 ml rør.
    19. Rens DNA'et ved hjælp af et standard PCR-oprydningssæt.
    20. Det rensede DNA kan opbevares ved -20 °C og kan bruges som skabeloner i standard qPCR-protokoller. Følg producentprotokollerne for kørsel af qPCR.
  6. ChIP-qPCR-dataanalyse
    BEMÆRK: To almindelige metoder til at analysere ChIP-qPCR resultater er fold berigelse over IgG antistof og 1% Input metode. En fremragende skabelon for begge analysemetoder leveres af en kommerciel kilde , der kan bruges til hurtigt at beregne foldberigelse for hvert IP-antistof /mål af interesse37.
    1. For at beregne foldberigelse og % input kopieres og indsættes ΔCt-værdierne ud fra de qPCR-data, der er opnået for hvert antistof (ikke-specifikt IgG, IP H3K27ac-antistoffet og 1 % input) i det tilsvarende område i analyseskabelonen, og Fold Enrichment og Yield % Input udfyldes automatisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro histone acetyltransferase (HAT) assay kan bruges til at sonde for forbindelser, der hæmmer p300 HAT aktivitet mod en histone substrat. Figur 1A giver et eksperimentelt skematisk for HAT-analysen. Anakarinsyre, en kendt HATi3,38, blev udnyttet i denne analyse i en koncentration spænder fra 12.5-100 μM. Ved 100 μM nedregulerer anacardinsyre p300 histonacetylation ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrol-DMSO-behandlingen (Figur 1B, vognbane 5 versus vognbane 1). En koncentration område blev udnyttet i denne analyse, fordi lavere lægemiddeldoser ikke i høj grad hæmmer p300 HAT aktivitet (Figur 1B,baner 2-4 versus lane 1). I vognbane 6 blev der ikke føjet nogen Acetyl-CoA til reaktionen og fungerer som en negativ kontrol for p300-katalyse og for basale niveauer af histonacetylation på rekombinant H3.1 (Figur 1B). p300- og H3.1-proteinniveauer blev anvendt som belastningskontrol (Figur 1B). Disse immunoblotresultater blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ39 (Figur 1C). Fold-ændringerne blev beregnet ved at sammenligne båndintensiteten for hver prøve med dmso-kontrollens båndintensitet for hver acetylationssonde. Kvantificering for anakarinsyre ved 100 μM viser kraftig reduktion i H3K18ac og H3K9ac i forhold til DMSO-kontrollen, hvilket bekræfter de visuelle resultater i figur 1B.

I Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, HDACi bruges som et redskab til hyperacetylate histoner i kromatin før co-inkubation med en HATi24, såsom p300-hæmmer A-4852,4. Formålet med denne analyse er at bestemme effekten af HATi for at dæmpe histon hyperacetylation induceret af HDACi. Figur 2A giver et eksperimentelt skematisk for ChHAI-analysen. I denne analyse, behandling af MCF-7 celler med HDACi MS-275 stærkt upregulated acetylation på Histone 3, på flere lysin rester (Figur 2B, vognbane 4 versus vognbane 1). De basale niveauer af H3K18ac og H3K27ac var lave, hvilket viste fordelene ved at tilføje en HDACi i ChHAI-analysen (Figur 2B, vognbane 1-3). Tilføjelsen af A-485 med MS-275 dæmper den øgede histone acetylation ved H3K18 og H3K27, men ikke H3K9 (Figur 2B, baner 4-6). Vigtigere er det, H3K9ac er ikke reguleret af p300 i cellekultur2, der viser specificiteten af A-485 i dette eksperiment. Disse immunoblotresultater blev kvantificeret i figur 2C. Fold ændringer blev beregnet ved at sammenligne båndet intensiteten af hver prøve til båndet intensiteten af MS-275 alene (Lane 4) for hver acetylation sonde. Vognbane 1-3 blev ikke kvantificeret, fordi der ikke blev fundet høje høje niveauer af H3K18ac og H3K27ac.

Chromatin Immunoprecipitation-kvantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) er et cellekultureksperiment, der undersøger DNA-protein interaktioner på bestemte områder af genomet. Det kan bruges til at undersøge virkningerne af HATi på genregulerende elementer , der styrer oncogene udtryk25. Figur 3A indeholder et eksperimentelt skematisk for ChIP-qPCR-protokollen. MCF-7 celler behandlet med 3 μM A-485 i 24 timer blev udsat for ChIP-qPCR gennem immunoprecipitation af histone-DNA-komplekser beriget med H3K27ac (Figur 3). Det rensede DNA blev analyseret for Cyclin D1 promotorsekvensen. ChIP-qPCR primere er designet mod en specifik DNA-sekvens i genomet og bruges til at detektere den relative mængde udfældet DNA. Mængden af udfældet DNA afspejler den overflod af protein af interesse på den genomiske region, der undersøges. I DMSO-prøven giver det DNA, der udfældes af IgG-kontrolantistoffet, en højere Ct-værdi end H3K27ac-antistoffet i qPCR-reaktionen for Cyclin D1-promotoren (figur 3B). Dette indikerer, at den ikke-specifikke IgG-kontrol udfældede færre DNA-proteinkomplekser end det H3K27ac specifikke antistof ved Cyclin D1 promotor. Dette svarer til en 632,73 gange berigelse af H3K27ac over den ikke-specifikke IgG kontrol (Figur 3B).

Denne sammensætning viser, at det H3K27ac specifikke antistof med succes immunaffakterede acetylerede histoner, og at H3K27ac er beriget på Cyclin D1 promotor. Efter validering af kvaliteten af H3K27ac antistof, kan der foretages en sammenligning mellem DMSO og A-485 behandlede grupper. Som vist i figur 3Creducerer A-485 H3K27ac-berigelse ved Cyclin D1-promotoren i forhold til DMSO-styringen ved hjælp af %Input-metoden (repræsentativt resultat af n=2). Vigtigere er det, A-485 er kendt for at reducere H3K27ac i cellekultur2,4.

ChIP-qPCR rå %Input værdier kan være meget varierende mellem uafhængige biologiske replikater, på trods af den eksperimentelle tendens er reproducerbar. Derfor kan det være nyttigt at præsentere dataene som en normaliseret procentdel af DMSO-kontrol for at vise det reproducerbare forhold mellem kontrol og narkotikabehandling10. I figur 3D, A-485, nedregulerer H3K27ac-belægningen f.eks. Statistisk analyse var baseret på Student's t-test (*P < 0,05).

Figure 1
Figur 1: Anakarbinsyre hæmmer p300 enzymatisk aktivitet i en HAT-analyse. (A) Et skematisk diagram over HAT-analysen, der viser den enzymatiske reaktion. (B) Anacardinsyre hæmmede p300 enzymatisk aktivitet og nedregulerede histonacetylation ved H3K18 og H3K9 ved 100 μM (vognbane 5) i forhold til DMSO-kontrolbehandlingen (vognbane 1). Lane 6 mangler Acetyl-CoA i reaktionen og tjente som en negativ kontrol for histone acetylation. cC) Immunoblot-resultaterne i punkt B blev kvantificeret. Fold-ændringerne blev beregnet ved at sammenligne båndintensiteten for hver prøve med dmso-kontrollens båndintensitet for hver acetylationssonde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: p300-hæmmer A-485 dæmper kraftigt histonhyperacetylation i ChHAI-analysen. (A) Et skematisk diagram over ChHAI-analysen. (B) I MCF-7 celler, HDAC hæmmer MS-275 kraftigt upregulated histon acetylation på H3K18, K27 og K9 (lane 4) versus DMSO kontrol (vognbane 1). Tilføjelsen af A-485, en kendt p300 HAT-hæmmer, med MS-275 dæmpet stigningen i histone acetylation ved H3K18 og K27, men ikke H3K9 (baner 5-6 versus lane 4). cC) Immunoblot-resultaterne i punkt B blev kvantificeret. Fold ændringer blev beregnet ved at sammenligne båndet intensiteten af hver prøve til båndet intensiteten af MS-275 alene (Lane 4) for hver acetylation sonde. Vognbane 1-3 blev ikke kvantificeret, fordi der ikke blev fundet høje høje niveauer af H3K18ac og H3K27ac. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: P300-hæmmer A-485 nedsætter H3K27ac-niveauerne ved Cyclin D1-promotoren målt ved ChIP-qPCR. (A) Et skematisk diagram over ChIP-qPCR-protokollen. b)Repræsentative qPCR-ct-værdier for Cyclin D1-promotoren for IgG- og H3K27ac-immunoprecipationerne. IgG-kontrollen havde en højere Ct-værdi, hvilket indikerer, at H3K27ac-antistoffet med succes blev beriget for H3K27ac over det ikke-specifikke IgG-antistof. c) A-485 (3 μM) behandling i 24 h nedreguleret H3K27ac hos Cyclin D1-promotoren sammenlignet med DMSO-kontrolbehandlingen i MCF-7-celler (repræsentativt resultat af n=2). dD) %Input fra to uafhængige ChIP-forsøg blev normaliseret til DMSO-kontrollen i procent af DMSO-kontrollen. Behandling med A-485 i MCF-7 celler betydeligt downregulates H3K27ac belægning på Cyclin D1 promotor. Statistisk analyse var baseret på Student's t-test (*P < 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer Opskrift
10X Glycine buffer 18,74 g glycin med PBS, indtil den er opløst, og tilsættes PBS til 200 ml.
10X løbebuffer 250 mM Tris, 1,9 M glycin, 1% SDS
30,0 g Tris-base, 144,0 g glycin og 10,0 g SDS opløses i 1000 ml H2O. Bufferens pH-pH skal være 8,3, og der kræves ingen pH-justering. Opbevar løbebufferen ved stuetemperatur og fortyndes til 1X før brug.
10X TBST 2,42 g Tris base, 8g NaCl, 2 ml 50% Tween 20, tilsæt ddH2O til 1 liter
1X TBST med 5% mælk 5g mælkepulver pr. ca. 100 ml 1X TBST
5X analysebuffer: 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100
5X Passiv lysisbuffer lave et vandigt materiel indeholdende 125 mM Tris, pH 7,8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 og 50% (vol/vol) glycerol i ddH2O.
6X Natrium Dodecyl sulfat (SDS) 0,375 M Tris pH 6.8, 6 ml glycerol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 mg bromophenolblåt, tilsættes vand til 10 ml.
ChIP-fortyndingsbuffer 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl
ChIP Elution Buffer 1% SDS (w/v) og 0,1 M NaHCO3 i autoclaved ddH2O
Komplet DMEM til MCF-7-celler: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% kvæg kalv serum (BCS), penicillin (10 enheder / ml), og streptomycin (10 mg / ml)
Høj salt vask buffer 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl.
LiCl vaskebuffer 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholate, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
Lav salt vask buffer 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl.
Kerner hævelse buffer 5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40
SDS lysis buffer 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,0
TE-buffer 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA.
Overførselsbuffer 25 mM Tris, 190 mM glycin, 20% methanol og kontroller pH-automaten og justeres til pH 8,3, hvis det er nødvendigt.

Tabel 1: Opskrifter på de anvendte buffere og løsninger.

Supplerende sager: Supplerende forsøgsskemaer for protokol 1-3. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylate flere lysinrester på histonehaler og transskriptionsfaktorer til regulering af gentranskription2,3. Arbejde i de sidste to årtier har afsløret, at KNG'er, såsom CBP/p300, PCAFogGCN5, interagere med onkogen transskription faktorer og bidrage til at drive tumorvækst i flere solide tumortyper4,,5,9,15,16,17,18. På grund af deres nye rolle i at fremme tumorvækst, er KATs ved at blive undersøgt som nye mål i kræftbehandling. Nye KAT-hæmmere (KATi) skal testes omhyggeligt og grundigt for styrke, selektivitet og sikkerhed, før de flyttes til brug i klinikken. Nylige beviser har vist, at tidligere beskrevne KATi forbindelser udviser off mål effekter og var dårligt karakteriseret, før de er meget udbredt i den videnskabelige litteratur som kemiske sonder21. Derfor er strenge metoder nødvendige for KATi karakterisering. Beskrevet her er tre protokoller, der kan bruges sammen til at karakterisere og validere nye hæmmere rettet mod histone acetyltransferase (HAT) funktion af KATs: en in vitro HAT assay, ChHAI assay, og ChIP-qPCR. Disse protokoller bruger CBP/p300 og deres hæmmere som eksempler, men disse metoder kan nemt tilpasses til fremtidig anvendelse i forbindelse med undersøgelse af andre KAT'er.

HAT-analysen er enkel og en omkostningseffektiv måde at screene forbindelser for styrke i at hæmme HAT-funktion i et reagensglas. Rensede HATs (enten rekombinant4,,10 eller immunafciperet40)kan testes i denne analyse, men rekombinant CBP/p300 bruges som eksempel i denne protokol. CBP/p300 har et enzymatisk HAT-domæne, der overfører en acetylgruppe fra Acetyl-CoA til en lysinrester på et målunderlag3. De mest karakteriserede CBP/p300 histonemål er Histone 3 Lysin 18 og 27 (henholdsvis H3K18 og H3K27)2,3,10,11. I HAT-analysen inkuberes det rensede p300 HAT-domæne med Acetyl-CoA og Histone 3.1 som substrat. I inkubationstiden vil p300 katalysere acetylation på flere H3.1-rester, herunder H3K18 og H3K27. Den relative forekomst af acetylation på disse rester kan måles via immunblotting. Denne reagensglas reaktion kan bruges til at screene for nye forbindelser, der binder sig til p300 og hæmmer sin HAT aktivitet (HATi). For eksempel, anakarinsyre, en kendt HATi38, potent downregulates histone acetylation på både H3K18 og H3K9 i forhold til DMSO kontrol (Figur 1B, vognbane 5 versus vognbane 1). Det er af afgørende betydning at tilføje Acetyl-CoA til de eksperimentelle reaktioner (Figur 1B,Vognbane 1-5) eller p300 katalyse histonacetylation vil ikke forekomme(Figur 1B, Lane 6). Fraværet af Acetyl-CoA kan også anvendes som en negativ kontrol for p300 katalyse og for basale niveauer af histonacetylation på rekombinant H3.1.

Når HAT-analysen udføres, er det vigtigt at sikre, at hver reaktion modtager den samme mængde p300, H3.1 og Acetyl-CoA. H3.1 og p300 niveauer i immunoblot tjene som belastning kontrol for gelen. Til denne analyse kan stedsspecifikke histoneacetyblonde antistoffer eller et pan-acetylantistof anvendes til immunblotting. Når optimere til at forbedre immunoblot kvalitet er det afgørende at bruge validerede antistoffer til immunblotting og i første omgang følge producentens anbefalinger for antistof fortynding. De antistoffortyndinger, der anvendes i protokolafsnittet, er til reference, og fortyndingerne kan ændres på grundlag af resultaterne af de første forsøg (f.eks. hvis signalet er for stærkt, kan antistoffet fortyndes yderligere). På grund af sin enkelhed, hat analysen er en fremragende start eksperiment for screening nye hæmmere. Men HAT analysen har ulemper. En stor bekymring med HAT assay er, at forbindelser, der er effektive i et reagensglas kan vise sig ineffektiv i et levende system. Dette er et problem, fordi sammensat effekt i cellekultur kan ændres ved cellulære permeabilitet spørgsmål, cellulære stofskifte, og sammensat stabilitet. Desuden har KATs, specielt CBP/p300, mange proteinproteininteraktioner, der regulerer deres KAT-aktivitet i cellekultur3,,41,42. Det er derfor vigtigt yderligere at karakterisere de inhibitorer , der er identificeret i HAT-analysen i cellekultureksperimenter20,23.

Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay er den anden protokol i rørledningen og er nyttig til validering af virkningerne af nye hæmmere i cellekultur. Denne analyse anvender HDAC-hæmmere (HDACi)24 til at fremkalde histon hyperacetylation i celler, fordi basal acetylation kan være for lav til at detektere på et immunoblot. De cellelinjer, der vælges, er præinskuberet med en HDACi for at muliggøre akkumulering af acetyleret kromatin før tilsætning af en HATi. Efter co-inkubering af HDACi og HATi lyses cellerne og underkastes standardimmunblottingprocedurer for specifikke histoneacetylationssteder. Formålet med denne analyse er at bestemme effekten af nye HATi for at dæmpe histon hyperacetylation induceret af HDACi. Celler, der eksponeres for HDACi, skal have betydeligt højere niveauer af histonacetylation end celler, der eksponeres for DMSO-opløsningsmidlet(Figur 2B,vognbane 4 versus vognbane 1). Tilsætning af HATi sammen med HDACi forventes at reducere immunoblot signal i forhold til HDACi behandling alene (Figur 2B, baner 5-6 versus vognbane 4). Basale niveauer af histoneacetylation (Figur 2B, Vognbane 1-3) er vanskelige at opdage og fremhæver vigtigheden af at tilføje en HDACi i denne protokol. MS-275 (Entinostat) bruges som eksempel, men andre HDACi kan bruges24,43. MS-275 har variable rapporterede hæmmende koncentrationer i forhold til klasse I HDACs og hæmmer generelt HDAC1 og HDAC3 med nanomolar til lave mikromolarkoncentrationer,henholdsvis 43,44. En bred vifte af MS-275 koncentrationer anvendes i litteraturen45,46,47, men en 3 μM behandling giver en robust og reproducerbar stigning i histon acetylation i MCF-7 celler. Det kan derfor være gavnligt at udføre en indledende skærm med en bred vifte af HDACi- og HATi-koncentrationer for at bestemme den optimale koncentration for ChHAI-analysen, når der anvendes en anden cellelinje.

I lighed med HAT-analysen kan det være nødvendigt at optimere immunoblotprotokollen for at opnå kvalitetsresultater ved hjælp af passende antistoffer, optimale antistoffortyndinger og omhyggeligt kontrolleret prøvebelastning. Omhyggeligt kontrolleret prøvebelastning er afgørende for denne protokols succes og kan opnås ved at lybre proteinindholdet i alle prøver og gennem pipettering af samme volumen af prøver i brøndene i immunoblotgelen. Et pan-acetyl antistof kan bruges til sondering i denne protokol. Det bør dog suppleres med stedsspecifikke acetylantistoffer, fordi KS'er har specificitet for visse histonelyinrester, og HATi påvirker ikke alle histoneacetylationssteder i cellekultur1,2,4,5,10,11. Hæmmere, der er potente til at reducere histone acetylation i både HAT og ChHAI assays er stærke kandidater til yderligere evaluering. Vigtigere er det, hat og ChHAI assays har den begrænsning kun at give data om globale ændringer i histone acetylation. Denne begrænsning skaber behov for at karakterisere virkningerne af nye HATi på bestemte områder af genomet.

Chromatin Immunoprecipitation-kvantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) er den endelige protokol i rørledningen og evaluerer DNA-protein interaktioner på specifikke områder af genomet. I denne analyse renses genomiske regioner beriget med H3K27ac gennem immunudfrielse (IP) og analyseres ved hjælp af DNA-primere i qPCR. Denne teknik giver mekanistisk indsigt i, hvordan HATi påvirker histone modifikationer hos genpromotorer og smagsforstærkere. ChIP-qPCR er en robust teknik og er billigere end helgenomsekvens (f.eks. Det sværeste skridt til korrekt optimering er trin 3.5, immunoprecipitation. Dette trin er vanskeligt at optimere, for hvis det rensede DNA i trin 3.5.20 er meget fortyndet, kan det forårsage dårlige resultater i qPCR-reaktionen (f.eks. ingen forstærkning af målgensekvensen og meget høje ΔCt-værdier). IP-trinnets succes afhænger af flere faktorer, såsom den overflod af proteinmål af interesse og kvaliteten af IP-antistoffet. Det er afgørende at validere kvaliteten af IP H3K27ac antistof versus IgG kontrol for at kontrollere succesen af IP-trin. I figur 3Bviser H3K27ac-specifikt antistof f.eks. Dette indikerer, at H3K27ac-antistoffet er af høj kvalitet, og at H3K27ac er beriget på Cyclin D1 promotor. Efter validering af IP-antistoffet kan der foretages en sammenligning mellem de behandlede DMSO- og A-485-grupper. Som vist i figur 3Creducerer A-485 H3K27ac-berigelse ved Cyclin D1-promotoren i forhold til DMSO-styringen ved hjælp af %Input-metoden (repræsentativt resultat af n=2). Hvis IP-antistoffet viser sig at være lav kvalitet og ikke viser fold berigelse i indledende forsøg, kan du prøve at øge celletallene i trin 3.2.1. Højere celletal kan bidrage til at kompensere for dårlig antistofkvalitet ved at øge lysatets samlede proteinindhold og vil gøre det muligt at tilsætte mere protein til IP-reaktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter eller afsløringer at gøre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra James og Esther King Biomedical Research Program (6JK03 og 20K07), og Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 og 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, og UF Health Cancer Center. Derudover vil vi gerne takke Dr. Zachary Osking og Dr. Andrea Lin for deres støtte under offentliggørelsesprocessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

Cancer Research lysin acetyltransferaser KDs CBP/p300 histone acetyltransferase hæmmere screening metoder histone acetylation epigenetik kræft genregulering
Analyser til validering af Histone Acetyltransferase hæmmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter