Summary
Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.
Abstract
Lysine acetyltransferases (KATs) katalyseren acetylatie van lysineresiduen op histonen en andere eiwitten om chromatinedynamica en genexpressie te reguleren. KATs, zoals CBP/p300, worden intensief onderzocht als therapeutische doelstellingen toe te schrijven aan hun kritieke rol in tumorigenese van diverse kankers. De ontwikkeling van nieuwe kleine molecuulremmers gericht op de histon acetyltransferase (HAT) functie van KATs is uitdagend en vereist robuuste tests die de specificiteit en potentie van potentiële remmers kunnen valideren.
Dit artikel schetst een pijplijn van drie methoden die rigoureuze in vitro validatie voor nieuwe HAT-remmers (HATi) bieden. Deze methoden omvatten een reageerbuis HAT-test, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test, en Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve PCR (ChIP-qPCR). In de HAT-test worden recombinant HAT's geïncubeerd met histonen in een reageerbuisreactie, waardoor specifieke lysineresiduen op de histonstaarten kunnen worden geaced. Deze reactie kan worden geblokkeerd door een HATi en de relatieve niveaus van site-specifieke histonacetylatie kunnen worden gemeten via immunoblotting. Remmers geïdentificeerd in de HAT-test moeten worden bevestigd in de cellulaire omgeving.
De ChHAI-test gebruikt immunoblotting om te screenen op nieuwe HATi die de robuuste hyperacetylatie van histonen verzwakt, veroorzaakt door een histone deacetylase inhibitor (HDACi). De toevoeging van een HDACi is nuttig omdat basale niveaus van histonacetylatie moeilijk te detecteren zijn via immunoblotting.
De HAT en ChHAI testen meten wereldwijde veranderingen in histon acetylatie, maar geven geen informatie over acetylatie in specifieke genomische regio's. Daarom wordt ChIP-qPCR gebruikt om de effecten van HATi op histonacetylatieniveaus op genregulerende elementen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door selectieve immunoprecipitatie van histon-DNA complexen en analyse van het gezuiverde DNA via qPCR. Samen, deze drie tests zorgen voor de zorgvuldige validatie van de specificiteit, potentie, en werkingsmechanisme van de nieuwe HATi.
Introduction
Lysine acetyltransferases (KAT's) katalyseren de acetylatie van lysineresiduen op zowel histon- als niet-histoneiwitten1,2,3,4. Recent onderzoek toont aan dat DE's en hun acetyltransferase functie kan bevorderen vaste tumorgroei4,5,6,7,8,9. Creb-bindend eiwit (CBP)/p300 zijn bijvoorbeeld twee paralogeuze KAT's die talrijke signaleringstrajecten bij kanker2,3reguleren . CBP/p300 hebben een goed gekarakteriseerde histon acetyltransferase (HAT) functie en katalyseren Histone 3 Lysine 27 acetylatie (H3K27ac)2,4,5,10,11, een belangrijke marker voor actieve versterkers, promotor regio's en actieve gen transcriptie12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische co-activators voor pro-groeisignaleringstrajecten in vaste tumoren door transcriptie van oncogenen te activeren door acetylatie van histonen en andere transcriptiefactoren4,9,15,16,17,18.9 Vanwege hun rol in tumorprogressie worden CBP/p300 en andere KAT's onderzocht op de ontwikkeling van nieuwe remmers die hun oncogene functie4,5,6,7,,8,9,18,19,20blokkeren . A-485 en GNE-049 vertegenwoordigen twee succesvolle pogingen om krachtige en specifieke remmers te ontwikkelen voor CBP/p3004,9. Aanvullende remmers worden momenteel onderzocht voor CBP/p300 en andere KAT's.
De kwaliteit van eerder beschreven KAT-remmers (KATi) wordt in twijfel getrokken, waarbij veel remmers met doeleffecten en slechte karakterisering21pronken. Daarom is rigoureuze karakterisering en validatie van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen essentieel voor de ontwikkeling van hoogwaardige chemische sondes. Hier beschreven zijn drie protocollen die een pijplijn vormen voor screening en rigoureus valideren van de potentie en specificiteit van nieuwe KATi, met een specifieke focus op het remmen van de HAT-functie (HATi) van KATs. CBP/p300 en hun remmers worden gebruikt als voorbeelden, maar deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere KAT's die een HAT-functiehebben 7.
Het eerste protocol is een in vitro histon acetyltransferase (HAT) test die gezuiverde recombinant p300 en histonen gebruikt in een gecontroleerde reageerbuisreactie. Deze test is eenvoudig uit te voeren, is kosteneffectief, kan worden gebruikt om verbindingen te screenen in een lage doorvoerinstelling en vereist geen radioactieve materialen. In dit protocol wordt recombinant p300 lysineacetylatie op histonstaarten tijdens een korte incubatieperiode en de niveaus van histonacetylatie gemeten met behulp van standaard immunoblottingsprocedures. De enzymatische reactie kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van CBP/p300-remmers om te screenen op verbindingen die histonacetylatie verminderen. Bovendien kan de HAT-test worden gebruikt om na te gaan of nieuwe verbindingen selectief zijn voor cbp/p300 door hun activiteit te beoordelen op andere gezuiverde KAT's, zoals PCAF. De HAT-test is een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van nieuwe remmers vanwege de eenvoud, lage kosten en de mogelijkheid om de potentie/selectiviteit van een remmer te bepalen. Inderdaad, dit protocol wordt vaak gebruikt in de literatuur als een in vitro scherm5,10. Echter, remmers geïdentificeerd in de HAT-test zijn niet altijd effectief in de celcultuur, omdat een reageerbuis reactie is veel eenvoudiger dan een levend celsysteem. Daarom is het essentieel om remmers verder te karakteriseren in celkweekexperimenten22,23.
Het tweede protocol in de pijplijn is de Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test. Deze cel gebaseerde test maakt gebruik van histone deacetylase remmers (HDACi) als een instrument om histonen hyperacetylate in chromatine voor co-incubatie met een HATi24. Basale histonacetylatie kan laag zijn in de celcultuur, waardoor het moeilijk is om via immunoblotting te sonde zonder de toevoeging van een HDACi om acetylatie te verhogen. Het doel van de ChHAI-test is het identificeren van nieuwe HATi die de toename van histonacetylatie veroorzaakt door HDAC-remming kan verzachten. De voordelen van deze test zijn de lage kosten, relatieve gemak uit te voeren, en het gebruik van cellen in de cultuur, die meer fysiologische relevantie dan de reageerbuis HAT test biedt. Net als bij de HAT-test maakt dit protocol gebruik van standaard immunoblotting voor het verzamelen van gegevens.
De HAT en ChHAI testen geven gegevens over de potentie van nieuwe verbindingen voor het remmen van wereldwijde histonacetylatie, maar geven geen inzicht in hoe deze verbindingen wijzigingen in specifieke genomische regio's beïnvloeden. Daarom is het uiteindelijke protocol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) een celkweekexperiment dat DNA-eiwitinteracties onderzoekt in specifieke gebieden van het genoom. In het ChIP-protocol wordt chromatine gekoppeld om DNA-eiwitinteracties te behouden. De chromatine wordt vervolgens uit cellen geëxtraheerd en het DNA-eiwitcomplex ondergaat selectieve immunoprecipitatie voor het eiwit van belang (bijvoorbeeld met behulp van een antilichaam specifiek voor H3K27ac). Het DNA wordt vervolgens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van qPCR. ChIP-qPCR kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen of een nieuwe HATi histonacetylatie downreguleert bij individuele oncogenen, zoals Cyclin D125. Hoewel ChIP-qPCR een veelgebruikte techniek is die in het veld wordt gebruikt, kan het moeilijk zijn om4,10,,26te optimaliseren . Dit protocol biedt tips voor het vermijden van mogelijke valkuilen die kunnen optreden tijdens het uitvoeren van de ChIP-qPCR-procedure en bevat kwaliteitscontroles die op de gegevens moeten worden uitgevoerd.
Wanneer ze samen worden gebruikt, maken deze drie protocollen het mogelijk om nieuwe HATi rigoureus te karakteriseren en valideren. Bovendien bieden deze methoden veel voordelen omdat ze gemakkelijk uit te voeren zijn, relatief goedkoop en gegevens te verstrekken over zowel wereldwijde als regionale histonacetylatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro HAT-test
- Buffervoorbereiding
LET OP: Zie tabel 1 voor bufferrecepten.- Bereid 5x testbuffer en 6x Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) en bewaar bij -20 °C. Aliquot SDS in 1 mL aliquots.
- Bereid 10x SDS gel running buffer en 10x TBST en op te slaan op kamertemperatuur.
- Bereid 1x transferbuffer voor en bewaar bij 4 °C.
LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt. SDS, DTT en bromofenolblauw zijn giftig en mogen niet worden ingenomen, ingeademd of blootgesteld aan de huid of ogen. Zie veiligheidsgegevens voor de juiste afhandelingsprocedures. Gebruik een chemische rookkap voor het hanteren van gevaarlijke chemicaliën.
- HAT reactie
OPMERKING: Anacardzuur is een bekende p300-remmer3 en wordt gebruikt als voorbeeld om aan te tonen hoe de HAT-test nieuwe p300-remmers kan identificeren. Zie Aanvullend Protocol (Schematisch 1) voor een schema van stap 1.2.1.- Bereid de volgende enzymatische reactie voor in een 0,2 mL PCR-buis: 2 μL 5x testbuffer, 1 μL gezuiverde p300 (0,19 μg/μL), 1 μL anacardzuur (HATi) of DMSO-regeling verdund in 1x testbuffer en 2 μL autogeklaved ddH2O. Pre-incubeer dit mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 3 μL van 100 μM Acetyl-CoA en 1 μL gezuiverde H3.1 (0,2 μg/μL) aan de reactie toe.
- Het volledige reactiemengsel incubeer bij 30 °C gedurende 1 uur in een PCR thermische cycler.
- Voeg 2-mercaptoethanol toe met een verhouding van 1:10 aan de 6x SDS-monsterbuffer.
- Verwijder monsters uit de PCR thermal cycler en voeg 2 μL 6x SDS (met 2-mercaptoethanol toegevoegd) toe aan het reactiemengsel.
LET OP: 2-mercaptoethanol is giftig en moet worden gebruikt in een chemische rookkap. Zie veiligheidsgegevens voor een goede behandeling. - Verwarm monsters bij 95 °C gedurende 5 minuten op een warmteblok en koel af op ijs. Bewaar de monsters op -20 of -80 °C of voer gelelektroforese en immunoblotting uit zoals hieronder beschreven.
- Gel elektroforese en immunoblotting
OPMERKING: Als u niet bekend bent met gelelektroforese en immunoblotting, raadpleegt u deze standaardprocedure27 voor meer informatie over het uitvoeren van stappen 1.3.1-1.3.17. Aanvullende informatie is hier te vinden28,29,30,31,32,33.- Pipette 10 μL monsters (vanaf stap 1.2.5.) in de putten van een 4-20% gradiënt polyacrylamide gel. Pipette 5 μL eiwitladder in één van de putten als moleculaire gewichtsverwijzing. Voer de gel op 120 V voor 90 min met behulp van een gel tank.
- Breng de gel met behulp van een transfertank 70 minuten over op een polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan bij 100 V gedurende 70 minuten.
- Haal het membraan uit het transferapparaat en plaats het in een plastic container. Blokkeer het membraan door 1x TBST (met 5% melk) aan de container toe te voegen en schud voorzichtig 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de 1x TBST uit stap 1.3.3. Incubeer het membraan 's nachts met geselecteerde locatiespecifieke acetylantilichamen (bijvoorbeeld H3K18ac of H3K27ac primaire antilichamen bij een 1:5.000 verdunning in 1x TBST met 5% melk) bij 4 °C met zacht schudden.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing. Was het membraan 2x met 1x TBST (geen melk) bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 15 min per wasbeurt.
- Verdun het secundaire antilichaam bij 1:20.000 in 1x TBST (met 5% melk) en incubbateren het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Was het membraan 2x met 1x TBST (geen melk) bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 15 min per wasbeurt.
- Giet de 1x TBST uit het membraan. Meng hrp-substraatperoxideoplossing en HRP-substraat luminoloplossing in een 1:1-verhouding (1 mL van elk) en pipet 2 mL van de gecombineerde oplossing met het membraanoppervlak.
- Broed de oplossing met het membraan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Giet overtollig chemiluminescent substraat van het membraan af op een papieren handdoek en plaats het membraan in plastic folie in een röntgencassettehouder.
- Ga naar een donkere kamer gewijd aan x-ray film verwerking. Stel het membraan bloot aan een röntgenfilm door de film bovenop het membraan te plaatsen en de cassette voor 30 s te sluiten.
OPMERKING: Het contacttijd tussen de film en het membraan moet experimenteel worden bepaald. Sterke signalen hebben korte belichtingen (seconden) nodig en zwakkere signalen kunnen langere belichtingen nodig hebben. - Verwijder de röntgenfilm uit de cassette en verwerk de film door deze door een röntgenfilmprocessor te laten lopen. Raadpleeg de handleidingen van de fabrikant voor specifieke instructies voor het verwerken van de röntgenfilm.
- Haal het membraan uit de plastic folie en was het met ddH2O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Incubeer het membraan met 0,2 M NaOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Was het membraan met ddH2O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Blokkeer het membraan door 1x TBST (met 5% melk) aan de container toe te voegen en schud voorzichtig 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg de volgende primaire antilichaamverdunning toe (bijvoorbeeld sonde voor H3K27ac als het eerste gebruikte antilichaam H3K18ac was) en schud 's nachts bij 4 °C. Herhaal stap 1.3.4-1.3.17 totdat alle antilichaamsondes zijn voltooid.
2. ChHAI-test
- In vitro medicamenteuze behandelingen en analyse van geacetyleerde histonen
LET OP: A-485 is een krachtige en goed gekarakteriseerde p300 HATi2,4 . Deze remmer zal worden gebruikt in de resterende tests als gevolg van de werkzaamheid en specificiteit in de celcultuur. MS-275 (Entinostat)24 is een HDACi die de histonacetylatieniveaus aanzienlijk verhoogt en wordt gebruikt om de detectie van acetylatiesondes met standaard immunoblotting gemakkelijker te detecteren. Zie Aanvullend protocol (Schematisch 2) voor een schema van de verdunningen van geneesmiddelen die in stap 2.1 worden gebruikt.- Zaad 100.000 MCF-7 cellen in een 12 putplaat en laat cellen groeien tot 80-90% samenvloeiing in 1 mL celkweekmedium. Markeer de putten voor het volgende experimentele ontwerp: goed 1: DMSO-besturingselement (referentiepunt); goed 2: A-485 (3 μM); goed 3: A-485 (10 μM); goed 4: MS-275 (3 μM); goed 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); goed 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
OPMERKING: Voor het kweken van MCF-7 cellen gebruikt u complete DMEM-media en laat u cellen groeien bij 37 °C met 5% CO2. Zie Tabel 1 voor het volledige DMEM recept. - Om 24 uur na het zaaien, pipette 4 mL van volledige DMEM media naar een steriele 15 mL conische buis. Pipet 2 μL MS-275 (6 mM in DMSO) tot 4 mL medium voor een uiteindelijke concentratie van 3 μM MS-275.
- Pipette 2 μL DMSO tot 4 mL medium in een aparte steriele 15 mL conische buis.
LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor een goede behandeling van DMSO. Sommige soorten handschoenen zijn niet geschikt voor het hanteren van DMSO. - Aspirate de cel cultuur medium van putten 4-6 en pipet 1 mL van 3 μM MS-275 in medium (stap 2.1.2) om elke put. Gooi ongebruikte verdunde MS-275 weg.
- Aspirate de cel cultuur medium van putten 1-3 en pipet 1 mL van verdunde DMSO (stap 2.1.3) om elke put. Gooi ongebruikte verdunde DMSO weg.
- Breng de cellen terug naar de couveuse en broed gedurende 4 uur om ophoping van geacetyleerde histonen mogelijk te maken in cellen die zijn blootgesteld aan MS-275 (putten 4-6).
OPMERKING: MS-275 is een HDACi en zal histon hyperacetylatie24veroorzaken. Deze 4 uur pre-incubatie is nodig om MS-275 hyperacetylatie te laten induceren vóór de toevoeging van A-485, wat histonacetylatie2,4vermindert . - Bereid na 4 uur incubatie met MS-275 de volgende verdunningen in afzonderlijke steriele 1,5 mL-buizen door pipetteren: 1,0 μL DMSO tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO en 0,5 μL A-485 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO en 0,5 μL A-485 (20 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO en 0,5 μL MS-275 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL A-485 (6 mM) en 0,5 μL MS-275 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media; 0,5 μL A-485 (20 mM) en 0,5 μL MS-275 (6 mM) tot 1 mL DMEM-media.
- Aspirate de cel cultuur medium van putten 1-6 en pipet 1 mL van verdunning 1 tot goed 1, verdunning 2 tot goed 2, verdunning 3 tot goed 3, verdunning 4 tot goed 4, verdunning 5 tot goed 5, en verdunning 6 tot goed 6.
OPMERKING: Een algemene regel is om DMSO (solvent) gehalte in evenwicht te brengen tussen experimentele groepen en niet meer dan 0,1% DMSO-gehalte in celcultuur te overschrijden om cellulaire toxiciteit en veranderingen in proliferatie te voorkomen. - Breng de cellen terug naar de couveuse en cultuur voor 20 uur.
- Na 20 uur, aspirate de cel cultuur medium van putten 1-6.
- Was de cellen door 1 mL PBS te pipetten naar putten 1-6. De PBS aanzuigen.
- Voeg 100 μL 1x passieve lysebuffer (zie tabel 1)toe aan putten 1-6. Bewaar celkweekplaat (met monsters in passieve lysebuffer) bij −80 °C 's nachts voor vriesdooi en lyse van cellen.
LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen voordat u buffers maakt. CDTA kan ernstig oogletsel en irritatie veroorzaken. - Dooi monsters bij kamertemperatuur met zachte schudden gedurende 10 min. Breng monsters over om buizen van 1,5 mL te scheiden en plaats onmiddellijk op ijs.
- Meet de eiwitconcentratie van elk monster. De eiwitconcentratie kan worden bepaald aan de hand van verschillende gevestigde protocollen34.
- Equilibrate eiwitconcentratie tussen monsters 1-6 (in een gelijk volume) met behulp van 1x passieve lyse buffer te verdunnen, indien nodig.
- Voeg 2-mercaptoethanol toe met een verhouding van 1:10 tot 6x SDS-monsterbuffer.
- Voeg 6x SDS-monsterbuffer met 2-mercaptoethanol toe aan monsters 1-6 aan een uiteindelijke concentratie van 1x SDS-monsterbuffer.
- Verwarm monsters bij 95 °C gedurende 5 minuten op een warmteblok en koel af op ijs. Monsters kunnen tot stap 2.1.19 worden opgeslagen bij -20 °C of -80 °C.
- Pipette een volume met 30 μg eiwit voor monsters 1-6 aan de putten in een 4-20% gradiënt polyacrylamide gel. Immunoblotting procedure uitvoeren volgens protocol beschreven in Protocol 1.
- Zaad 100.000 MCF-7 cellen in een 12 putplaat en laat cellen groeien tot 80-90% samenvloeiing in 1 mL celkweekmedium. Markeer de putten voor het volgende experimentele ontwerp: goed 1: DMSO-besturingselement (referentiepunt); goed 2: A-485 (3 μM); goed 3: A-485 (10 μM); goed 4: MS-275 (3 μM); goed 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); goed 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
3. ChIP-qPCR
OPMERKING: Het onderstaande protocol wordt beschreven voor remmers van p300 als voorbeeld.
- Buffervoorbereiding
LET OP: Zie tabel 1 voor bufferrecepten. De algemene stappen van het ChIP-protocol (bijv. bufferrecepten, wastijden en centrifugatietijden) hieronder worden aangepast en aangepast aan de aanbevelingen van de fabrikant van een commercieel verkrijgbaar kit (zie Tabel van materialen)en uit de literatuur35,36.- Bereid de ChIP verdunningsbuffer, de zwellingbuffer van de kernen, een lage zoutwasbuffer, een hoge zoutwasbuffer, licl-wasbuffer en TE-buffer voor. Bewaar bij 4 °C.
- Bereid de SDS lyse buffer, 10x glycine buffer en ChIP elution buffer voor. Bewaar op kamertemperatuur.
LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen voordat u buffers maakt om een goede behandeling te garanderen.
- Medicamenteuze behandeling
OPMERKING: Zie Aanvullend Protocol (Schematisch 3) voor een schema van de verdunningen van geneesmiddelen die in stap 3.2 worden gebruikt.- Zaad MCF-7 cellen in twee 15 cm kweekschotels en kweekcellen tot 90% samenvloeiing in 12 mL van het volledige DMEM-medium. Markeer de gerechten voor het volgende experimentele ontwerp: Gerecht 1: DMSO-controle (referentiepunt); Schotel 2: A-485 (3 μM).
OPMERKING: Voor het kweken van MCF-7 cellen, gebruik maken van complete DMEM media en groeien bij 37 °C met 5% CO2. Zie Tabel 1 voor het volledige DMEM recept. - In een steriele conische buis van 15 mL, pipet 12 mL DMEM-media en pipet 6 μL DMSO. Meng goed.
- In een aparte steriele conische buis van 15 mL, pipet 12 mL DMEM-media en pipet 6 μL A-485 (6 mM in DMSO) om een uiteindelijke concentratie van 3 μM A-485 te krijgen. Meng goed.
- De media van schotel 1 en 2 aanzuigen.
- Voeg de 12 mL verdunde DMSO in DMEM (stap 3.2.2.) toe aan schotel 1.
- Voeg de 12 mL van 3 μM A-485 in DMEM (stap 3.2.3.) toe aan schotel 2.
- Breng de celkweekgerechten terug naar de couveuse en broed je 24 uur.
- Zaad MCF-7 cellen in twee 15 cm kweekschotels en kweekcellen tot 90% samenvloeiing in 12 mL van het volledige DMEM-medium. Markeer de gerechten voor het volgende experimentele ontwerp: Gerecht 1: DMSO-controle (referentiepunt); Schotel 2: A-485 (3 μM).
- Celfixatie
- Pipette 330 μL (27,5 μL per mL) van 37% formaldehyde naar de volledige media en draai de plaat voorzichtig om te mengen.
LET OP: Formaldehyde is giftig. Zie veiligheidsgegevens voor de juiste afhandelingsprocedures. - Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Pipette 2 mL van 10x glycine aan de plaat en wervelen om te mengen.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Na incubatie, plaats gerechten op ijs en ontdooien een aliquot van protease remmer cocktail.
- Bereid de volgende oplossingen voor zowel de DMSO- als de A-485-monsters voor met behulp van de buffers die in stap 3.1 zijn opgesteld.
- 2 mL PBS met een verdunning van 1:1.000 van de proteaseremmercocktail
- 1 mL van kernen zwelling buffer met een 1:1,000 verdunning van de proteaseremmer cocktail
- 0,5 mL SDS lyse buffer met een verdunning van 1:1.000 van de proteaseremmercocktail
- Aspirate de media uit de celkweek gerechten en was de cellen twee keer met 15 mL koude PBS.
- Pipette 2 mL PBS met de proteaseremmercocktail (stap 3.3.6.1) naar de celkweekgerechten. Til de cellen in oplossing met behulp van een cel schraper.
- Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis. Verzamel indien nodig de resterende cellen met extra PBS.
- Draai buizen met 800 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Aspirate de supernatant en pipet 1 mL van kernen zwelling buffer met de protease remmer cocktail (stap 3.3.6.2) naar de pellet. Resuspend de pellet en incubeer op ijs voor 10 min.
- Centrifugeren de buizen op 2.700 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten tot pelletkernen.
- Aspirate de supernatant en pipet 0,5 mL SDS lyse buffer met de protease remmer cocktail (stap 3.3.6.3) naar de pellet. Resuspend de pellet en incubeer op ijs voor 10 min.
- Bewaar de chromatinemonsters bij -80 °C tot stap 3.4.1 of ga onmiddellijk door naar stap 3.4.
- Pipette 330 μL (27,5 μL per mL) van 37% formaldehyde naar de volledige media en draai de plaat voorzichtig om te mengen.
- DNA-sonatie
- Breng 130 μL chromatine uit DMSO-monster (stap 3.3.14) over naar twee DNA-sonische buizen met behulp van een pipet (elk 130 μL).
- Breng 130 μL chromatine over van het A-485 monster (stap 3.3.14) naar twee DNA-sonische buizen met behulp van een pipet (elk 130 μL).
- Soniceer het DNA tot ongeveer 150-200 basispaarfragmenten met behulp van de volgende sonicator-instellingen: Peak Incident Power (W) van 175, Duty Factor van 10%, 200 cycli per burst en 430 s behandelingstijd.
OPMERKING: De instellingen voor sonicatie kunnen verschillen tussen modellen en de instellingen moeten mogelijk worden aangepast om de juiste fragmentgrootte voor verschillende cellijnen te bereiken. - Houd monsters op ijs na sonicatie.
- Breng de gesonische chromatine met behulp van een pipet en centrifuge bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten over op een buis van 10 mL.
- Pipette de supernatant (bevat gesonische chromatine) naar een nieuwe buis en gooi het puin. Sonicated chromatine kan worden opgeslagen bij -80 °C.
- Chromatine immunoprecipitatie (ChIP)
OPMERKING: Zie Aanvullend Protocol (Schematic 3) voor een schema van de IP-groepen in stap 3.5.- Meet het eiwitgehalte van de gesonische chromatine voor de DMSO- en A-485-monsters van stap 3.4.6. Eiwitgehalte kan worden gemeten met behulp van gevestigde protocollen34.
OPMERKING: Voor de eenvoud gaat dit protocol ervan uit dat het eiwitgehalte gelijk is en 100 μL sonisch chromatine wordt gebruikt. Anders moet het eiwitgehalte in gelijke mate tussen alle monsters worden geëquilibreerd. - Pipette 100 μL dmso-gesononiceerde chromatine tot twee 1,5 mL-buizen (elk 100 μL). Pipette 400 μL chip verdunningsbuffer (met een verdunning van 1:1.000 van de proteaseremmercocktail) naar elke buis om het totale volume tot 500 μL te brengen. Verwijder 5 μL van de oplossing uit een van de buizen en bewaar bij -20 °C als DMSO-invoer.
- Pipette 100 μL a-485 gesononiceerde chromatine tot twee 1,5 mL buizen (elk 100 μL). Pipette 400 μL chip verdunningsbuffer (met een verdunning van 1:1000 van de proteaseremmercocktail) naar elke buis om het totale volume tot 500 μL te brengen. Verwijder 5 μL van de oplossing uit een van de buizen en bewaar bij -20 °C als A-485 Input.
- Voeg met behulp van een pipet het antilichaam (IMMUNOprecipitatie) (bijvoorbeeld niet-specifieke IgG-controle of H3K27ac-specifiek antilichaam) toe aan de overeenkomstige buizen voor de DMSO- en A-485-monsters: IP-#1 DMSO-chromatine met IgG-antilichamen (5-10 μg); IP-#2 DMSO-chromatine met H3K27ac-antilichaam (5-10 μg); IP-#3 A-485 chromatine met IgG-antilichaam (5-10 μg); IP-#4 A-485 chromatine met H3K27ac-antilichaam (5-10 μg).
- Voeg 20 μL eiwit toe Aan elke buis een magnetische kralen. Zorg ervoor dat de kralen zijn goed geresuspended.
- Draai de monsters 's nachts op 4 °C.
- Pellet het eiwit Een magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de supernatant. Stoor de kralen niet.
- Was de kralen met 500 μL tot 1 mL van de lage zoutwasbuffer en draai 5 min bij 4 °C. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider, en verwijder de supernatant.
- Was de kralen met 500 μL tot 1 mL van de hoge zoutwasbuffer en draai 5 min bij 4 °C. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider, en verwijder de supernatant.
- Was de kralen met 500 μL tot 1 mL van de LiCl wasbuffer en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider, en verwijder de supernatant.
- Was de kralen met 500 μL tot 1 mL TE-buffer en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voer een snelle spin down uit. Bewaar de kralen in de TE-buffer tot stap 3.5.14.
- Verwijder inputmonsters (vanaf stap 3.5.2 en 3.5.3) uit de vriezer en houd ze op ijs.
- Ontdooi een aliquot van Proteinase K.
- Pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de TE buffer uit de kralen (vanaf stap 3.5.11).
- Voeg 100 μL ChIP elutiebuffer + 1 μL Proteinase K toe aan elk monster, inclusief de inputmonsters. Incubeermonsters met schudden op 62 °C gedurende 2 uur met behulp van een thermocycler.
- Na 2 uur worden de monsters gedurende 10 minuten met behulp van een thermocycler op 95 °C geplaatst.
- Koel de monsters af op kamertemperatuur.
- Pellet magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en overdracht supernatant (bevat het DNA van belang) naar een nieuwe 1,5 mL buis.
- Zuiver het DNA met behulp van een standaard PCR cleanup kit.
- Het gezuiverde DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C en kan worden gebruikt als sjablonen in standaard qPCR-protocollen. Volg de protocollen van de fabrikant voor het uitvoeren van qPCR.
- Meet het eiwitgehalte van de gesonische chromatine voor de DMSO- en A-485-monsters van stap 3.4.6. Eiwitgehalte kan worden gemeten met behulp van gevestigde protocollen34.
- ChIP-qPCR-gegevensanalyse
OPMERKING: Twee veelvoorkomende methoden om ChIP-qPCR-resultaten te analyseren zijn vouwverrijking ten opzichte van het IgG-antilichaam en de 1% invoermethode. Een uitstekende sjabloon voor beide analysemethoden wordt geleverd door een commerciële bron kan worden gebruikt om snel te berekenen vouwverrijking voor elk IP-antilichaam / doel van belang37.- Om vouwverrijking en % invoer te berekenen, worden de ΔCt-waarden van de qPCR-gegevens die voor elk antilichaam zijn verkregen (niet-specifieke IgG, het IP H3K27ac-antilichaam en het invoer van 1%) automatisch in het overeenkomstige gebied in de analysesjabloon en de fold enrichment en opbrengst % invoer automatisch ingevuld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in vitro histon acetyltransferase (HAT) test kan worden gebruikt om te sonde voor verbindingen die p300 HAT activiteit remmen in de richting van een histon substraat. Figuur 1A biedt een experimenteel schema voor de HAT-test. Anacardzuur, een bekende HATi3,38, werd gebruikt in deze test in een concentratiebereik van 12,5-100 μM. Bij 100 μM, anacardzuur downreguleert p300 gekatalyseerd histon acetylatie op Histone 3, Lysines 9 en 18 versus de controle DMSO behandeling (Figuur 1B, baan 5 versus baan 1). Een concentratie bereik werd gebruikt in deze test, omdat lagere doseringen van geneesmiddelen niet sterk kan remmen p300 HAT activiteit (Figuur 1B, rijstroken 2-4 versus baan 1). In Lane 6 werd geen Acetyl-CoA aan de reactie toegevoegd en dient als een negatieve controle voor p300-katalyse en voor basale niveaus van histonacetylatie op recombinant H3.1 (Figuur 1B). p300 en H3.1 eiwitniveaus werden gebruikt als belastingscontrole(figuur 1B). Deze immunoblot resultaten werden gekwantificeerd met imagej39 (figuur 1C). Vouwveranderingen werden berekend door de bandintensiteit van elk monster te vergelijken met de bandintensiteit van de DMSO-controle voor elke acetylatiesonde. Kwantificering voor anacardzuur op 100 μM toont een krachtige vermindering van H3K18ac en H3K9ac versus de DMSO-controle, wat de visuele resultaten in figuur 1Bbevestigt.
In de Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test wordt HDACi gebruikt als een hulpmiddel om histonen in chromatine te hyperacetyleren vóór co-incubatie met een HATi24, zoals p300-remmer A-4852,4. Het doel van deze test is het bepalen van de werkzaamheid van HATi voor het verzachten van histonhypacetylatie geïnduceerd door HDACi. Figuur 2A biedt een experimenteel schema voor de ChHAI-test. In deze test, de behandeling van MCF-7 cellen met HDACi MS-275 sterk upregulated acetylation op Histone 3, op verschillende lysine residuen (Figuur 2B, baan 4 versus baan 1). De basale niveaus van H3K18ac en H3K27ac waren laag, waaruit de voordelen van het toevoegen van een HDACi in de ChHAI-test(figuur 2B, rijstroken 1-3) lieten zien. De toevoeging van A-485 met MS-275 verzwakt de verhoogde histonacetylatie bij H3K18 en H3K27, maar niet H3K9 (Figuur 2B, rijstroken 4-6). Belangrijk is dat H3K9ac niet wordt gereguleerd door p300 in celcultuur2, met de specificiteit van A-485 in dit experiment. Deze immunoblot resultaten werden gekwantificeerd in figuur 2C. Vouw veranderingen werden berekend door het vergelijken van de band intensiteit van elk monster aan de band intensiteit van MS-275 alleen (Lane 4) voor elke acetylatie sonde. Rijstroken 1-3 werden niet gekwantificeerd omdat H3K18ac en H3K27ac basale niveaus niet werden gedetecteerd.
Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) is een celkweekexperiment dat DNA-eiwitinteracties onderzoekt in specifieke gebieden van het genoom. Het kan worden gebruikt om de effecten van HATi te onderzoeken op genregulerende elementen die de controle op de cogene expressie25. Figuur 3A biedt een experimenteel schema voor het ChIP-qPCR-protocol. MCF-7 cellen behandeld met 3 μM A-485 gedurende 24 uur werden onderworpen aan ChIP-qPCR door middel van immunoprecipitatie van histon-DNA complexen verrijkt in H3K27ac (Figuur 3). Het gezuiverde DNA werd geanalyseerd voor de Cyclin D1 promotor sequentie. ChIP-qPCR primers zijn ontworpen tegen een specifieke DNA-sequentie in het genoom en worden gebruikt om de relatieve hoeveelheid neergeslagen DNA te detecteren. De hoeveelheid neergeslagen DNA weerspiegelt de overvloed van het eiwit van belang in de genomische regio in onderzoek. In het DMSO-monster produceert het DNA dat door het IgG-bestrijdingsantilichaam wordt neergeslagen een hogere Ct-waarde dan het H3K27ac-antilichaam in de qPCR-reactie voor de Cyclische D1-promotor (figuur 3B). Dit geeft aan dat de niet-specifieke IgG-controle minder DNA-eiwitcomplexen neerslaat dan de H3K27ac specifieke antilichaam bij de Cyclische D1-promotor. Dit vertaalt zich in een 632,73-voudige verrijking van H3K27ac over de niet-specifieke IgG-controle(figuur 3B).
Deze vouwverrijking levert het bewijs dat het H3K27ac specifieke antilichaam met succes geantiopte geacetyleerde histonen bevat en dat H3K27ac is verrijkt bij de Cyclin D1 promotor. Na validering van de kwaliteit van het H3K27ac-antilichaam kan een vergelijking worden gemaakt tussen de behandelde DMSO- en A-485-groepen. Zoals blijkt uit figuur 3C,vermindert A-485 de H3K27ac-verrijking bij de Cyclische D1-promotor ten opzichte van de DMSO-besturingselement met behulp van de %Input-methode (representatief resultaat van n=2). Belangrijk is dat A-485 is bekend dat h3K27ac aanzienlijk te verminderen in de celcultuur2,4.
ChIP-qPCR raw %Invoerwaarden kunnen zeer variabel zijn tussen onafhankelijke biologische replica's, ondanks dat de experimentele trend reproduceerbaar is. Daarom kan het nuttig zijn om de gegevens te presenteren als een genormaliseerd percentage van DMSO-controle om de reproduceerbare verhouding tussen controle en medicamenteuze behandeling10aan te tonen. Bijvoorbeeld, in figuur 3D, A-485 aanzienlijk downregulates H3K27ac bezetting op de Cyclische D1 promotor (n = 2). Statistische analyse was gebaseerd op de T-test van de student (*P < 0,05).
Figuur 1: Anacardzuur remt p300 enzymatische activiteit in een HAT-test. (A) Een schematisch diagram van de HAT-test, die de enzymatische reactie afbeeldt. (B) Anacardzuur sterk geremd p300 enzymatische activiteit en downregulated histon acetylatie bij H3K18 en H3K9 op 100 μM (baan 5) versus de DMSO controle behandeling (baan 1). Lane 6 mist Acetyl-CoA in de reactie en diende als een negatieve controle voor histon acetylatie. (C) De immunoblot resultaten in (B) werden gekwantificeerd. Vouwveranderingen werden berekend door de bandintensiteit van elk monster te vergelijken met de bandintensiteit van de DMSO-controle voor elke acetylatiesonde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: p300-remmer A-485 verzwakt krachtig histon hyperacetylatie in de ChHAI-test. aA) Een schematisch diagram van de ChHAI-test. (B) In MCF-7-cellen heeft HDAC-remmer MS-275 zijntonacetylatie bij H3K18, K27 en K9 (baan 4) ten opzichte van de DMSO-regeling (baan 1) krachtig opgevoerd. De toevoeging van A-485, een bekende p300 HAT-remmer, met MS-275 verzwakte de toename van histonacetylatie bij H3K18 en K27, maar niet H3K9 (rijstroken 5-6 versus rijstrook 4). (C) De immunoblot resultaten in (B) werden gekwantificeerd. Vouw veranderingen werden berekend door het vergelijken van de band intensiteit van elk monster aan de band intensiteit van MS-275 alleen (Lane 4) voor elke acetylatie sonde. Rijstroken 1-3 werden niet gekwantificeerd omdat H3K18ac en H3K27ac basale niveaus niet werden gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: p300-remmer A-485 verlaagt H3K27ac-niveaus op de Cyclische D1-promotor, zoals gemeten door ChIP-qPCR. (A) Een schematisch diagram van het ChIP-qPCR-protocol. (B) Representatieve qPCR Ct-waarden voor de Cyclische D1-promotor voor de IgG- en H3K27ac-immunoprecipitaties. De IgG-controle had een hogere Ct-waarde, wat aangeeft dat het H3K27ac-antilichaam met succes verrijkte voor H3K27ac over het niet-specifieke IgG-antilichaam. (C) A-485 (3 μM) behandeling voor 24 uur downregulated H3K27ac bij de Cyclische D1 promotor in vergelijking met de DMSO controlebehandeling in MCF-7 cellen (representatief resultaat van n=2). (D) De %Input van twee onafhankelijke ChIP-experimenten werd genormaliseerd tot de DMSO-controle als percentage van de DMSO-controle. Behandeling met A-485 in MCF-7 cellen aanzienlijk downregulates H3K27ac bezetting bij de Cyclin D1 promotor. Statistische analyse was gebaseerd op de T-test van de student (*P < 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buffer | Recept | |
| 10X Glycine buffer | 18,74 g glycine met PBS tot ze zijn opgelost en voeg PBS toe aan 200 ml. | |
| 10x lopende buffer | 250 mM Tris, 1,9 M glycine, 1% SDS Los 30,0 g Tris-basis, 144,0 g g g glycine en 10,0 g SDS op in 1000 ml H2O. De pH van de buffer moet 8,3 zijn en er is geen pH-aanpassing vereist. Bewaar de lopende buffer op kamertemperatuur en verdun voor gebruik tot 1X. |
|
| 10X TBST | 2,42 g Tris-basis, 8 g NaCl, 2 ml 50% Tween 20, voeg ddH2O toe aan 1 liter | |
| 1X TBST met 5% melk | 5g melkpoeder per ongeveer 100 ml 1x TBST | |
| 5X Test buffer: | 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100 | |
| 5X Passieve lysis buffer | maak een waterige voorraad met 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 en 50% (vol/vol) glycerol in ddH2O. | |
| 6X Natrium Dodecylsulfaat (SDS) | 0,375 M Tris pH 6.8, 6 ml glycerol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 mg bromophenolblauw, voeg water toe aan 10 ml. | |
| ChIP verdunningsbuffer | 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl | |
| ChIP Elution Buffer | 1% SDS (w/v) en 0,1 M NaHCO3 in autoclaved ddH2O | |
| Complete DMEM voor MCF-7 cellen: | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% boviene kalfsserum (BCS), penicilline (10 eenheden/ml) en streptomycine (10 mg/ml) | |
| Hoge zoutwasbuffer | 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl. | |
| LiCl wasbuffer | 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0. | |
| Lage zoutwasbuffer | 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl. | |
| Kernen zwelling buffer | 5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40 | |
| SDS lyse buffer | 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 | |
| TE-buffer | 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. | |
| Overdrachtsbuffer | 25 mM Tris, 190 mM glycine, 20% methanol en controleer de pH en pas indien nodig aan op pH 8.3. | |
Tabel 1: Recepten van de gebruikte buffers en oplossing.
Aanvullende dossiers: Aanvullende experimentele schema's voor protocollen 1-3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lysine acetyltransferases (KATs) acetylaat verschillende lysine residuen op histon staarten en transcriptie factoren om gen transcriptie te reguleren2,3. Uit onderzoek in de afgelopen twee decennia is gebleken dat KAT's, zoals CBP/p300, PCAF en GCN5, interageren met oncogene transcriptiefactoren en tumorgroei stimuleren in verschillende vaste tumortypen4,5,9,15,16,17,18. Vanwege hun opkomende rol in het bevorderen van tumorgroei, worden KAT's onderzocht als nieuwe doelwitten bij de behandeling van kanker. Nieuwe KAT-remmers (KATi) moeten zorgvuldig en grondig worden getest op potentie, selectiviteit en veiligheid voordat ze in de kliniek worden gebruikt. Recent bewijs heeft aangetoond dat eerder beschreven KATi-verbindingen off doeleffecten vertonen en slecht werden gekarakteriseerd voordat ze op grote schaal werden gebruikt in de wetenschappelijke literatuur als chemische sondes21. Daarom zijn rigoureuze methoden nodig voor KATi-karakterisering. Hier beschreven zijn drie protocollen die samen kunnen worden gebruikt om nieuwe remmers te karakteriseren en te valideren die zich richten op de histonacetyltransferase (HAT) functie van KATs: een in vitro HAT-test, de ChHAI-test en ChIP-qPCR. Deze protocollen gebruiken CBP/p300 en hun remmers als voorbeelden, maar deze methoden kunnen gemakkelijk worden aangepast voor toekomstige toepassing bij het onderzoeken van andere KAT's.
De HAT-test is eenvoudig en een kosteneffectieve manier om verbindingen te screenen op potentie bij het remmen van de HAT-functie in een reageerbuis. Gezuiverde HAT's (recombinant4,,10 of immunoprecipitated40)kunnen in deze test worden getest, maar recombinant CBP/p300 wordt als voorbeeld in dit protocol gebruikt. CBP/p300 hebben een enzymatisch HAT-domein dat een acetylgroep van Acetyl-CoA overbrengt naar een lysineresidu op een doelsubstraat3. De meest gekarakteriseerde CBP/p300 histone doelen zijn Histone 3 Lysine 18 en 27 (H3K18 en H3K27, respectievelijk)2,3,10,11. In de HAT-test wordt het gezuiverde p300 HAT domein geïncubeerd met Acetyl-CoA en Histone 3.1 als substraat. Tijdens de incubatietijd zal p300 acetylatie katalyseren op verschillende H3.1-residuen, waaronder H3K18 en H3K27. De relatieve overvloed aan acetylatie op deze residuen kan worden gemeten via immunoblotting. Deze reageerbuisreactie kan worden gebruikt om te screenen op nieuwe verbindingen die zich binden aan p300 en de HAT-activiteit (HATi) remmen. Bijvoorbeeld, anacardzuur, een bekende HATi38, sterk downregulates histon acetylatie op zowel H3K18 en H3K9 in vergelijking met de DMSO controle (Figuur 1B, baan 5 versus baan 1). Het is van cruciaal belang om Acetyl-CoA toe te voegen aan de experimentele reacties(figuur 1B, Lanes 1-5) of p300 katalyse van histonacetylatie zal niet optreden(figuur 1B, Lane 6). De afwezigheid van Acetyl-CoA kan ook worden gebruikt als een negatieve controle voor p300 katalyse en voor basale niveaus van histonacetylatie op recombinant H3.1.
Bij het uitvoeren van de HAT-test is het belangrijk om ervoor te zorgen dat elke reactie dezelfde hoeveelheid p300, H3.1 en Acetyl-CoA ontvangt. H3.1 en p300 niveaus in de immunoblot dienen als lading controles voor de gel. Voor deze test kunnen sitespecifieke histonacetylantilichamen of een pan-acetylantilichaam worden gebruikt voor immunoblotting. Bij het optimaliseren van de immunoblot-kwaliteit is het van cruciaal belang om gevalideerde antilichamen te gebruiken voor immunoblotting en in eerste instantie de aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaamverdunning op te volgen. De antilichaamverdunningen die in de sectie Protocol worden gebruikt, zijn ter referentie en de verdunningen kunnen worden gewijzigd op basis van de resultaten van de eerste experimenten (bijvoorbeeld als het signaal te sterk is, kan het antilichaam verder worden verdund). Door zijn eenvoud is de HAT-test een uitstekend startexperiment voor het screenen van nieuwe remmers. Echter, de HAT test heeft nadelen. Een grote zorg met de HAT-test is dat verbindingen die effectief zijn in een reageerbuis ineffectief kunnen blijken in een levend systeem. Dit is een probleem omdat samengestelde werkzaamheid in de celcultuur kan worden gewijzigd door cellulaire doorlaatbaarheid kwesties, cellulaire metabolisme, en samengestelde stabiliteit. Bovendien hebben KAT's, met name CBP/p300, veel eiwit-eiwitinteracties die hun KAT-activiteit in celcultuur3,41,42reguleren . Daarom is het essentieel om remmers die in de HAT-test zijn geïdentificeerd in celkweekexperimenten20,23verderte karakteriseren .
De Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test is het tweede protocol in de pijplijn en is nuttig voor het valideren van de effecten van nieuwe remmers in de celcultuur. Deze test maakt gebruik van HDAC-remmers (HDACi)24 om histonhypacetylatie in cellen te induceren omdat basale acetylatie te laag kan zijn om op een immunoblot te detecteren. De cellijnen van keuze zijn vooraf geïncubeerd met een HDACi om accumulatie van geacetyleerde chromatine mogelijk te maken voordat een HATi wordt toegetoevoek. Na co-incubatering van de HDACi en HATi worden de cellen gelysed en onderworpen aan standaard immunoblottingprocedures voor specifieke histonacetylatielocaties. Het doel van deze test is het bepalen van de werkzaamheid van nieuwe HATi voor het verzachten van histon hyperacetylatie geïnduceerd door HDACi. Cellen die aan HDACi zijn blootgesteld, moeten aanzienlijk hogere niveaus van histonacetylatie hebben dan cellen die zijn blootgesteld aan het DMSO-oplosmiddel(figuur 2B, baan 4 versus baan 1). Toevoeging van de HATi samen met de HDACi zal naar verwachting het immunoblot signaal te verminderen in vergelijking met de HDACi behandeling alleen(Figuur 2B, rijstroken 5-6 versus baan 4). Basale niveaus van histonacetylatie(figuur 2B, Lanes 1-3) zijn moeilijk op te sporen en benadrukt het belang van het toevoegen van een HDACi in dit protocol. MS-275 (Entinostat) wordt gebruikt als voorbeeld, maar andere HDACi kan worden gebruikt24,43. MS-275 heeft variabele gerapporteerde remmende concentraties versus HDAC's van klasse I en remt hdac1 en HDAC3 over het algemeen met nanomolar tot lage micromolarconcentraties, respectievelijk43,44. Een breed scala aan MS-275 concentraties wordt gebruikt in de literatuur45,46,47, maar een 3 μM behandeling zorgt voor een robuuste en reproduceerbare toename van histon acetylatie in MCF-7 cellen. Daarom kan het nuttig zijn om een eerste scherm uit te voeren met een breed scala aan HDACi- en HATi-concentraties om de optimale concentratie voor de ChHAI-test te bepalen bij het gebruik van een andere cellijn.
Net als bij de HAT-test moet het immunoblot-protocol mogelijk worden geoptimaliseerd om kwaliteitsresultaten te verkrijgen door het gebruik van geschikte antilichamen, optimale antilichaamverdunningen en zorgvuldig gecontroleerde monsterbelasting. Zorgvuldig gecontroleerde monsterbelasting is essentieel voor het welslagen van dit protocol en kan worden bereikt door het eiwitgehalte van alle monsters in evenwicht te brengen en door hetzelfde volume monsters in de putten van de immunoblotgel te pipetten. Een pan-acetyl antilichaam kan worden gebruikt voor het onderzoeken in dit protocol. Het moet echter worden aangevuld met sitespecifieke acetylantilichamen, omdat KAT's specificiteit hebben voor bepaalde histonlysineresiduen en HATi niet alle histonacetylatielocaties in celkweek1,2,4,,5,10,11heeft . Remmers die krachtig zijn in het verminderen van histon acetylatie in zowel de HAT en ChHAI testen zijn sterke kandidaten voor verdere evaluatie. Belangrijk is dat de HAT en ChHAI testen hebben de beperking van alleen het verstrekken van gegevens over de wereldwijde veranderingen in histon acetylatie. Deze beperking creëert de noodzaak om de effecten van nieuwe HATi op specifieke gebieden van het genoom te karakteriseren.
Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) is het uiteindelijke protocol in de pijplijn en evalueert DNA-eiwit interacties in specifieke gebieden van het genoom. In deze test worden genomische regio's verrijkt met H3K27ac gezuiverd door immunoprecipitatie (IP) en geanalyseerd met behulp van DNA-primers in qPCR. Deze techniek geeft mechanistisch inzicht in hoe HATi histone modificaties beïnvloedt bij genpromotors en versterkers. ChIP-qPCR is een robuuste techniek en is minder duur dan whole-genome sequencing (bijvoorbeeld ChIP-seq), maar het kan moeilijk zijn om te optimaliseren als gevolg van vele stappen die de uitkomst beïnvloeden. De moeilijkste stap om correct te optimaliseren is stap 3.5, de immunoprecipitatie. Deze stap is moeilijk te optimaliseren, want als het gezuiverde DNA in stap 3.5.20 sterk verdunt, kan dit slechte resultaten veroorzaken in de qPCR-reactie (bijvoorbeeld geen versterking van de doelgensequentie en zeer hoge ΔCt-waarden). Het succes van de IP-stap is afhankelijk van verschillende factoren, zoals de overvloed van het eiwitdoelwit van belang en de kwaliteit van het IP-antilichaam. Het is van cruciaal belang om de kwaliteit van het IP H3K27ac-antilichaam ten opzichte van de IgG-controle te valideren om het succes van de IP-stap te verifiëren. In figuur 3Btoont het H3K27ac-specifieke antilichaam bijvoorbeeld een 632,73-voudige verrijking ten opzichte van de niet-specifieke IgG-controle. Dit geeft aan dat het H3K27ac-antilichaam van hoge kwaliteit is en dat H3K27ac is verrijkt bij de Cyclin D1 promotor. Na validatie van het IP-antilichaam kan een vergelijking worden gemaakt tussen de behandelde DMSO- en A-485-groepen. Zoals blijkt uit figuur 3C,vermindert A-485 de H3K27ac-verrijking bij de Cyclische D1-promotor ten opzichte van de DMSO-besturingselement met behulp van de %Input-methode (representatief resultaat van n=2). Als het IP-antilichaam van lage kwaliteit blijkt te zijn en geen vouwverrijking vertoont in de eerste experimenten, probeer dan de celnummers in stap 3.2.1 te verhogen. Hogere celaantallen kunnen helpen de slechte antilichaamkwaliteit te compenseren door het totale eiwitgehalte van het lysaat te verhogen en zal het mogelijk maken om meer eiwitten aan de IP-reactie toe te voegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten of onthullingen te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van James en Esther King Biomedical Research Program (6JK03 en 20K07), en Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 en 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, en UF Health Cancer Center. Daarnaast willen we Dr. Zachary Osking en Dr. Andrea Lin bedanken voor hun steun tijdens het publicatieproces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
- Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
- Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
- Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
- Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
- Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
- Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
- Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
- Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
- Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
- Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
- Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
- Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
- Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
- Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
- Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
- Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
- Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
- Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
- Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
- Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
- Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
- Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
- ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
- Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
- Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
- Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
- Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
- Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
- Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
- Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
- Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
- Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
- Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).
