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Cancer Research

हिस्टोन एसिटिलट्रांसफेरेज अवरोधकों को मान्य करने के लिए परखें

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेसिस (HATs, जिसे लिसाइन एसिटाइलट्रांसफेरेसिस के रूप में भी जाना जाता है) के अवरोधक, जैसे सीबीपी/पी300, कैंसर के इलाज के लिए संभावित चिकित्सीय हैं । हालांकि, इन अवरोधकों को मान्य करने के लिए कठोर तरीकों की आवश्यकता है। सत्यापन के लिए तीन इन विट्रो विधियों में रीकॉम्बिनेंट एसिटाइलट्रांसफेरेस के साथ हैट परख, सेल संस्कृति में हिस्टोन एसिटिलेशन के लिए इम्यूनोब्लोटिंग और सीआईपी-क्यूपीसीआर शामिल हैं।

Abstract

लिसाइन एसिटाइलट्रांसफेरेसेस (KATs) क्रोमेटिन गतिशीलता और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए हिस्टन और अन्य प्रोटीन पर लिसाइन अवशेषों के एसीटिलेशन को उत्प्रेरित करता है। सीबीपी/पी300 जैसे KATs, विविध कैंसर के ट्यूमरजीनेसिस में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में गहन जांच के अधीन हैं । KATs के हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज (हैट) समारोह को लक्षित करने वाले उपन्यास छोटे अणु अवरोधकों का विकास चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए मजबूत परख की आवश्यकता है जो संभावित अवरोधकों की विशिष्टता और शक्ति को मान्य कर सकते हैं।

यह लेख तीन तरीकों की एक पाइपलाइन को रेखांकित करता है जो उपन्यास हैट अवरोधकों (HATI) के लिए कठोर इन विट्रो सत्यापन प्रदान करते हैं। इन तरीकों में एक टेस्ट ट्यूब हैट परख, क्रोमेटिन हाइपरसेटिलेशन अवरोध (सीएचएई) परख, और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपेशन-मात्रात्मक पीसीआर (ChIP-qPCR) शामिल हैं। हैट परख में, एक टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया में हिस्टोन के साथ फिर से संयोजन किया जाता है, जो हिस्टोन पूंछ पर विशिष्ट lysine अवशेषों के एसीटिलेशन के लिए अनुमति देता है। इस प्रतिक्रिया को एक HATI द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है और साइट-विशिष्ट हिस्टोन एसिटिलेशन के सापेक्ष स्तर को इम्यूनोब्लोटिंग के माध्यम से मापा जा सकता है। टोपी परख में पहचाने गए अवरोधकों को सेलुलर वातावरण में पुष्टि करने की आवश्यकता है।

ChHAI परख उपन्यास HATI के लिए स्क्रीन करने के लिए इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग करता है जो एक हिस्टोन डेसेटाइलेस अवरोधक (एचडीएसीआई) द्वारा प्रेरित हस्टटोन के मजबूत हाइपरसेटाइलेशन को कम करता है। एचडीएसीआई के अलावा सहायक है क्योंकि हिस्टोन एसिटिलेशन के बेसल स्तर इम्यूनोब्लोटिंग के माध्यम से पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है।

हैट और सीएचई का कहना है कि हिस्टोन एसिटिलेशन में वैश्विक परिवर्तनों को मापता है, लेकिन विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में एसीटिलेशन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। इसलिए, जीन नियामक तत्वों पर हिस्टोन एसिटिलेशन स्तरों पर एचएटीआई के प्रभावों की जांच करने के लिए छग-क्यूपीसीआर का उपयोग किया जाता है। यह हिस्टोन-डीएनए परिसरों के चयनात्मक इम्यूनोप्रिपिटेशन और क्यूपीसीआर के माध्यम से शुद्ध डीएनए के विश्लेषण के माध्यम से पूरा किया जाता है। साथ में, ये तीन परख उपन्यास हैटी की विशिष्टता, शक्ति और कार्रवाई के तंत्र के सावधानीपूर्वक सत्यापन की अनुमति देते हैं।

Introduction

लिसिन एसिटाइलट्रांसफेरेस (KATs) ने हिस्टोन और गैर-हिस्टोन,प्रोटीन1,2,,3,4दोनों पर लिसाइन अवशेषों के एसीटिलेशन को उत्प्रेरित किया ।, हाल के शोध से पता चलता है कि KATs और उनके एसिटिलट्रांसफरेज कार्य ठोस ट्यूमर विकास को बढ़ावा देने के4,,5,,6,,7,8,9 कर,सकतेहैं । उदाहरण के लिए, सीआरईबी-बाइंडिंग प्रोटीन (सीबीपी) /पी300 दो पैरालॉगस केट्स हैं जो कैंसर2,,3में कई सिग्नलिंग रास्तों को विनियमित करते हैं। सीबीपी/पी 300 में एक अच्छी तरह से विशेषता हाइस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज (हैट) फ़ंक्शन और उत्प्रेरक हिस्टोन 3 लिसाइन 27 एसिटिलेशन (एच 3के27एसी)2,,4,,5,10,,11,सक्रिय एन्मेंटेवर्स, प्रमोटर क्षेत्रों और सक्रिय जीन ट्रांसक्रिप्शन12,13,,14के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर है।,, सीबीपी/पी 300 ने हिटोन और,अन्य ट्रांसक्रिप्शन कारकों,16,4,9,15, 16, 17, 18के एसिटिलेशन के माध्यम से ऑन्कोजीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करके ठोस ट्यूमर में प्रो-ग्रोथ सिग्नलिंग रास्तों के लिए महत्वपूर्ण सह-सक्रियकों के रूप में काम किया।,,1718 ट्यूमर की प्रगति में उनकी भूमिका के कारण, सीबीपी/पी300 और अन्य KATs उपन्यास अवरोधकों के विकास के लिए जांच की जा रही है जो उनके ऑन्कोजेनिक कार्य,4, 5,6,,6,7,,8,9, 19,,,19,,20को अवरुद्ध करते हैं ।19 ए-485 और जीएनई-049 सीबीपी/पी3004, 9,के लिए शक्तिशाली और विशिष्ट अवरोधकों को विकसित करने के दो सफल प्रयासों का प्रतिनिधित्वकरतेहैं । फिलहाल सीबीपी/पी300 और अन्य KATs के लिए अतिरिक्त अवरोधकों की जांच की जा रही है ।

पहले वर्णित कैट अवरोधकों (KATI) की गुणवत्ता को प्रश्न में बुलाया जा रहा है, जिसमें कई अवरोधकों को लक्ष्य प्रभाव और खराब लक्षण वर्णन21दिखाया गया है । इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले रासायनिक जांच के विकास के लिए उपन्यास दवा उम्मीदवारों का कठोर लक्षण वर्णन और सत्यापन आवश्यक है। यहां उल्लिखित तीन प्रोटोकॉल हैं जो स्क्रीनिंग के लिए एक पाइपलाइन बनाते हैं और उपन्यास KATI की शक्ति और विशिष्टता को कड़ाई से मान्य करते हैं, जिसमें KATs के हैट फ़ंक्शन (HATI) को बाधित करने पर विशेष ध्यान दिया जाता है। सीबीपी/पी 300 और उनके अवरोधकों का उपयोग उदाहरण के रूप में कियाजाताहै, लेकिन इन प्रोटोकॉलों को अन्य KATs के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिनमें हैट फ़ंक्शन 7 है।

पहला प्रोटोकॉल एक इन विट्रो हिस्टोन एसीटिलट्रांसफरेज (हैट) परख है जो नियंत्रित टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया में शुद्ध पुनर्संयोजन p300 और हिस्टोन का उपयोग करता है। यह परख प्रदर्शन करने के लिए सरल है, लागत प्रभावी है, एक कम थ्रूपुट सेटिंग में यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और रेडियोधर्मी सामग्री की आवश्यकता नहीं है। इस प्रोटोकॉल में, संक्षिप्त इनक्यूबेशन अवधि के दौरान हिस्टोन पूंछ पर लिसाइन एसिटिलेशन को पुनः संयोजन पी 300 उत्प्रेरक और हिप्थर एसिटिलेशन के स्तर को मानक इम्यूनोब्लोटिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करके मापा जाता है। हाइस्टोन एसिटिलेशन को कम करने वाले यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए सीबीपी/पी300 अवरोधकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हैट परख का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या पीसीएएफ जैसे अन्य शुद्ध KATs के खिलाफ उनकी गतिविधि का आकलन करके उपन्यास यौगिक सीबीपी/पी300 के लिए चयनात्मक हैं या नहीं। टोपी परख अपनी सादगी, कम लागत के कारण उपन्यास अवरोधकों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु है, और एक अवरोधक की शक्ति/चयनशीलता का निर्धारण करने की क्षमता है । दरअसल , इस प्रोटोकॉल का उपयोग साहित्य में अक्सर इन विट्रो स्क्रीन5,10के रूप में किया जाता है । हालांकि, टोपी परख में पहचाने गए अवरोधक सेल संस्कृति में हमेशा प्रभावी नहीं होते हैं क्योंकि एक टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया एक जीवित कोशिका प्रणाली की तुलना में बहुत सरल होती है। इसलिए, सेल कल्चर प्रयोगों में अवरोधकों को आगे बढ़ाना आवश्यक है22,23.

पाइपलाइन में दूसरा प्रोटोकॉल क्रोमेटिन हाइपरसेटाइलेशन अवरोध (सीएचएई) परख है। यह कोशिका आधारित परख एचएटीआई24के साथ सह-इनक्यूबेशन से पहले क्रोमेटिन में हिस्टोन डेसेटाइलीज अवरोधकों (एचडीएसीआई) को हाइपरसेटिलेट करने के लिए एक उपकरण के रूप में उपयोग करती है। बेसल हिस्टोन एसिटिलेशन सेल कल्चर में कम हो सकता है, जिससे एसीटिलेशन बढ़ाने के लिए एचडीएसीआई के अलावा इम्यूनोब्लोटिंग के जरिए जांच करना मुश्किल हो जाता है । CHHAI परख का उद्देश्य उपन्यास HATI की पहचान करना है जो एचडीएसी अवरोध के कारण हिस्टोन एसिटिलेशन में वृद्धि को कम कर सकता है। इस परख के फायदे में इसकी कम लागत, प्रदर्शन करने में सापेक्ष आसानी और संस्कृति में कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, जो परीक्षण ट्यूब हैट परख की तुलना में अधिक शारीरिक प्रासंगिकता प्रदान करता है। हैट परख के समान, यह प्रोटोकॉल डेटा संग्रह के लिए मानक इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग करता है।

हैट और सीएचई का कहना है कि वैश्विक हिस्टोन एसिटिलेशन को बाधित करने के लिए उपन्यास यौगिकों की शक्ति के बारे में डेटा प्रदान करता है, लेकिन यह अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है कि ये यौगिक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में संशोधनों को कैसे प्रभावित करते हैं। इसलिए, अंतिम प्रोटोकॉल, क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन-मात्रात्मक पॉलीमेरेज चेन रिएक्शन (ChIP-qPCR) एक सेल संस्कृति प्रयोग है जो जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करता है। सीआईपी प्रोटोकॉल में, डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन को संरक्षित करने के लिए क्रोमेटिन को क्रॉसलिंक किया जाता है। क्रोमेटिन को तब कोशिकाओं से निकाला जाता है और डीएनए-प्रोटीन परिसर ब्याज के प्रोटीन के लिए चयनात्मक इम्यूनोप्रिपिटेशन से गुजरता है (उदाहरण के लिए, H3K27ac के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना)। इसके बाद डीएनए को शुद्ध किया जाता है और क्यूपीसीआर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करने के लिए ChIP-qPCR का उपयोग किया जा सकता है कि क्या एक उपन्यास HATi अलग-अलग ऑन्कोजीन पर हिस्टोन एसिटिलेशन को डाउनरेगुलेट करता है, जैसे साइक्लिन डी1 25। जबकि सीआईपी-क्यूपीसीआर एक सामान्य तकनीक है जो क्षेत्र में,उपयोग की जाती है,4,10,26को अनुकूलित करना मुश्किल हो सकता है।, यह प्रोटोकॉल छग-क्यूपीसीआर प्रक्रिया का प्रदर्शन करते समय होने वाले संभावित नुकसान से बचने के लिए सुझाव प्रदान करता है और इसमें गुणवत्ता नियंत्रण जांच शामिल है जो डेटा पर की जानी चाहिए।

जब एक साथ उपयोग किया जाता है, तो ये तीन प्रोटोकॉल उपन्यास HATI के कठोर लक्षण वर्णन और सत्यापन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, ये विधियां कई फायदे प्रदान करती हैं क्योंकि वे प्रदर्शन करने में आसान हैं, अपेक्षाकृत सस्ते हैं और वैश्विक और क्षेत्रीय हिस्टोन एसीटिलेशन पर डेटा प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. इन विट्रो हैट परख

  1. बफर तैयारी
    नोट: बफर व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें।
    1. 5x परख बफर और 6x सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एसडीएस) तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1 एमएल एलिकोट में अलीकोट एसडीएस।
    2. बफर और 10x टीबीएस चलाने वाले 10x एसडीएस जेल तैयार करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    3. 1x ट्रांसफर बफर तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी रसायनों के लिए सुरक्षा डेटा शीट की जांच करें। एसडीएस, डीटीटी और ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के जहरीले होते हैं और इन्हें त्वचा या आंखों के संपर्क में नहीं किया जाना चाहिए। उचित हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए सुरक्षा डेटा शीट देखें। खतरनाक रसायनों से निपटने के लिए एक रासायनिक धुएं हुड का उपयोग करें।
  2. हैट रिएक्शन
    नोट: एनाकार्डिक एसिड एक ज्ञात p300 अवरोधक 3 है और यह प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में उपयोग कियाजाता है कि टोपी परख उपन्यास p300 अवरोधकों की पहचान कैसे कर सकती है। चरण1.2.1 कीयोजनाबद्ध के लिए अनुपूरक प्रोटोकॉल (योजनाबद्ध 1) देखें।
    1. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया तैयार करें: 5x परख बफर के 2 माइक्रोन, शुद्ध p300 के 1 μL (0.19 μg/μL), एनाकार्डिक एसिड (HATI) या DMSO नियंत्रण के 1x परख बफर में पतला और ऑटोक्लेवेड ddH2O. पूर्व के 2 μl कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इस मिश्रण incubate । फिर प्रतिक्रिया में 100 माइक्रोन एसिटिल-सीओए के 3 माइक्रोन और शुद्ध एच 3.1 (0.2 μg/μL) के 1 माइक्रोन जोड़ें।
    2. पीसीआर थर्मल साइकिलर में 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. 6x एसडीएस नमूना बफर में 1:10 अनुपात में 2-मर्केप्टोथेनॉल जोड़ें।
    4. पीसीआर थर्मल साइकिल चालक से नमूने निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण में 6x एसडीएस (2-मर्केप्टोथेनॉल जोड़े के साथ) के 2 माइक्रोल जोड़ें।
      सावधानी: 2-मर्केप्टोथेनॉल विषाक्त है और इसका उपयोग रासायनिक धुएं हुड के अंदर किया जाना चाहिए। उचित हैंडलिंग के लिए सुरक्षा डेटा शीट देखें।
    5. गर्मी के नमूने 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए हीट ब्लॉक पर और बर्फ पर ठंडा। नमूनों को -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या नीचे विस्तृत के रूप में जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इम्यूनोब्लोटिंग करें।
  3. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इम्यूनोब्लोटिंग
    नोट: यदि जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इम्यूनोब्लोटिंग से अपरिचित हैं, तो इस मानक प्रक्रियाको अतिरिक्त विवरण के लिए देखें कि चरण 1.3.1-1.3.17 कैसे करें। यहां अतिरिक्त जानकारी28 , 29,30,31,32,,33.32
    1. पिपेट 10 μL नमूनों (चरण 1.2.5 से) 4-20% ढाल पॉलीएक्रीलामाइड जेल के कुओं में। एक आणविक वजन संदर्भ के रूप में कुओं में से एक में प्रोटीन सीढ़ी के पिपेट 5 माइक्रोन। जेल टैंक का उपयोग करके 90 मिनट के लिए 120 वी पर जेल चलाएं।
    2. स्थानांतरण टैंक का उपयोग करके 70 मिनट के लिए 100 वी पर पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में जेल स्थानांतरित करें।
    3. स्थानांतरण तंत्र से झिल्ली निकालें और इसे एक प्लास्टिक कंटेनर में रखें। कंटेनर में 1x टीबीटी (5% दूध युक्त) जोड़कर झिल्ली को ब्लॉक करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धीरे-धीरे हिलाएं।
    4. 1x टीबीटी को चरण 1.3.3 से हटा दें। चयनित साइट-विशिष्ट एसीटाइल एंटीबॉडी (जैसे, एच 3K18ac या एच 3K27ac प्राथमिक एंटीबॉडी में 1:5,000 कमजोर पड़ने पर 1x टीबीटी में 5% दूध युक्त) कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली को रात भर इनक्यूबेट करें।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें। 15 मिनट प्रत्येक धोने के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 1x TBST (कोई दूध) के साथ झिल्ली 2x धोएं ।
    6. 1x TBST (5% दूध युक्त) में 1:20,000 पर माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें और कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली को कम करें।
    7. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें। 15 मिनट प्रत्येक धोने के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 1x TBST (कोई दूध) के साथ झिल्ली 2x धोएं ।
    8. झिल्ली से 1x टीबीस्ट को छान लें। 1:1 अनुपात (प्रत्येक के 1 एमएल) और झिल्ली की सतह के संयुक्त समाधान के पिपेट 2 एमएल में एचआरपी सब्सट्रेट पेरोक्साइड समाधान और एचआरपी सब्सट्रेट ल्यूमिनॉल समाधान मिलाएं।
    9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए झिल्ली के साथ समाधान को इनक्यूबेट करें।
    10. झिल्ली से अतिरिक्त रसायनीय सब्सट्रेट को एक कागज तौलिया पर छान लें और झिल्ली को एक्स-रे कैसेट धारक के अंदर प्लास्टिक की चादर में रखें।
    11. एक्स-रे फिल्म प्रसंस्करण के लिए समर्पित एक अंधेरे कमरे में ले जाएं। झिल्ली के ऊपर फिल्म रखकर और 30 एस के लिए कैसेट बंद करके एक एक्स-रे फिल्म के लिए झिल्ली का पर्दाफाश करें।
      नोट: फिल्म और झिल्ली के बीच संपर्क का समय प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए । मजबूत संकेतों को कम एक्सपोजर (सेकंड) की आवश्यकता होगी और कमजोर संकेतों को लंबे समय तक एक्सपोजर की आवश्यकता हो सकती है।
    12. कैसेट से एक्स-रे फिल्म निकालें और एक्स-रे फिल्म प्रोसेसर के जरिए इसे चलाकर फिल्म को प्रोसेस करें। एक्स-रे फिल्म को संसाधित करने के तरीके पर विशिष्ट निर्देशों के लिए निर्माता मैनुअल देखें।
    13. प्लास्टिक की चादर से झिल्ली निकालें और कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डीडीएच2O के साथ धोएं।
    14. कोमल मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.2 एम NaOH के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    15. कोमल मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डीडीएच2O के साथ झिल्ली धोएं।
    16. कंटेनर में 1x टीबीटी (5% दूध युक्त) जोड़कर झिल्ली को ब्लॉक करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धीरे-धीरे हिलाएं।
    17. अगले प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने जोड़ें (उदाहरण के लिए, H3K27ac के लिए जांच अगर पहले एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया H3K18ac था) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिला । सभी एंटीबॉडी जांच पूरी होने तक कदम 1.3.4-1.3.17 दोहराएं।

2. CHHAI परख

  1. इन विट्रो दवा उपचार और एसिटिलेटेड हिस्टटोन का विश्लेषण
    नोट: ए-485 एक शक्तिशाली और अच्छी तरह से विशेषता p300 HATI है2,4 . इस अवरोधक का उपयोग सेल संस्कृति में इसकी प्रभावकारिता और विशिष्टता के कारण शेष परख में किया जाएगा। एमएस-275 (एंटिनोस्टेट)24 एक एचडीएसीआई है जो स्पष्ट रूप से हिस्टोन एसिटिलेशन के स्तर को बढ़ाता है और मानक इम्यूनोब्लोटिंग के साथ एसीटिलेशन जांच का आसान पता लगाने की सुविधा के लिए उपयोग किया जाता है। देखना अनुपूरक प्रोटोकॉल (योजनाबद्ध 2) चरण 2.1 में उपयोग की जाने वाली दवा कमजोर पड़ने की योजनाबद्ध के लिए।
    1. बीज 12 अच्छी तरह से थाली में 100,000 एमसीएफ-7 कोशिकाओं और कोशिकाओं को सेल संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में 80-90% की उदारता के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। निम्नलिखित प्रायोगिक डिजाइन के लिए कुओं को चिह्नित करें: अच्छी तरह से 1: डीएमएसओ नियंत्रण (संदर्भ बिंदु); अच्छी तरह से 2: ए-485 (3 माइक्रोन); अच्छी तरह से 3: ए-485 (10 माइक्रोन); अच्छी तरह से 4: एमएस-275 (3 माइक्रोन); अच्छी तरह से 5: एमएस-275 (3 माइक्रोन) + ए-485 (3 माइक्रोन); अच्छी तरह से 6: एमएस-275 (3 माइक्रोन) + ए-485 (10 माइक्रोन) ।
      नोट: एमसीएफ-7 कोशिकाओं को बनाने के लिए, पूर्ण डीएमईएम मीडिया का उपयोग करें और कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति दें। पूर्ण DMEM नुस्खा के लिए तालिका 1 देखें।
    2. सीडिंग के बाद 24 घंटे में, पूर्ण डीएमईएम मीडिया के 4 एमएल को बाँझ 15 एमएल शंकु नली में ले जाते हैं। 3 माइक्रोन एमएस-275 की अंतिम एकाग्रता के लिए माध्यम के 4 एमएल तक एमएस-275 (डीएमएसओ में 6 mm) के पिपेट 2 माइक्रोन।
    3. एक अलग बाँझ 15 एमएल शंकु नली में माध्यम के 4 एमएल करने के लिए DMSO के पिपेट 2 माइक्रोन।
      चेतावनी: DMSO की उचित हैंडलिंग के लिए सुरक्षा डेटा शीट की जांच करें। कुछ दस्ताने प्रकार DMSO से निपटने के लिए मूल्यांकन नहीं कर रहे हैं ।
    4. कोशिका संस्कृति माध्यम को कुओं 4-6 से और पिपेट 3 माइक्रोएम एमएस-275 के 1 एमसीएल मध्यम (चरण 2.1.2) में प्रत्येक अच्छी तरह से। अप्रयुक्त पतला एमएस-275 त्यागें।
    5. कोशिका संस्कृति माध्यम को कुओं से 1-3 और पतला डीएमएसओ (चरण 2.1.3) के पिपेट 1 एमएल प्रत्येक कुएं में ले जाता है। अप्रयुक्त पतला डीएमएसओ को त्यागें।
    6. एमएस-275 (वेल्स 4-6) के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में एसिटाइलेटेड हिटोन के संचय की अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए इनक्यूबेटर और इनक्यूबेट कोशिकाओं को वापस करें।
      नोट: एमएस-२७५ एक HDACi है और हिस्टोन हाइपरसेटाइलेशन24का कारण होगा । यह 4 घंटे पूर्व इनक्यूबेशन एमएस-275 ए-485 के अलावा से पहले हाइपरसेटाइलेशन को प्रेरित करने की अनुमति देने के लिए आवश्यक है, जो हिस्टोन एसीटिलेशन2,,4को कम करता है।
    7. एमएस-275 के साथ इनक्यूबेशन के 4 घंटे के बाद, अलग बाँझ 1.5 एमएल ट्यूबों में पाइपिंग द्वारा निम्नलिखित कमजोर पड़ने की तैयारी करें: डीएमओ के 1.0 माइक्रोन से डीएमईएम मीडिया के 1 एमएल; डीएमएसओ का 0.5 माइक्रोन और डीएमईएम मीडिया के 1 मिलियन से 0.5 माइक्रोन ए-485 (6 mM) डीएमओ के 0.5 माइक्रोन और डीएमईएम मीडिया के 1 एमसीएल को ए-485 (20 mm) का 0.5 माइक्रोन; डीएमएसओ का 0.5 माइक्रोन और एमएस-275 (6 एमएम) का 0.5 माइक्रोन डीएमईएम मीडिया का 1 मिलियन 1 मिलियन 0.5 ए-485 (6 mM) के μL और एमएस के 0.5 माइक्रोन (6 mM) DMEM मीडिया के 1 mL करने के लिए; 0.5 μL के ए-485 (20 mM) और एमएस के 0.5 माइक्रोन -275 (6 mM) DMEM मीडिया के 1 mL करने के लिए।
    8. कोशिका संस्कृति माध्यम को कुओं से 1-6 और पिपेट 1 की 1 मिलील तक अच्छी तरह से 1, कमजोर पड़ने से 2 अच्छी तरह से 2, कमजोर पड़ने 3 से अच्छी तरह से 3, कमजोर पड़ने 4 से अच्छी तरह से 4, कमजोर पड़ने 5 से अच्छी तरह से 5, और कमजोर पड़ने 6 से अच्छी तरह से 6 ।
      नोट: एक सामान्य नियम प्रयोगात्मक समूहों के बीच DMSO (विलायक) सामग्री को संतुलित करना है और सेलुलर विषाक्तता और प्रसार में परिवर्तन से बचने के लिए सेल संस्कृति में 0.1% DMSO सामग्री से अधिक नहीं है।
    9. 20 घंटे के लिए इनक्यूबेटर और संस्कृति के लिए कोशिकाओं को वापस।
    10. 20 घंटे के बाद, 1-6 कुओं से सेल संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें।
    11. पीबीएस के 1 एमएल को 1-6 कुओं में पिपिंग करके कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस को आकांक्षी करें।
    12. 1x निष्क्रिय लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें (तालिका 1देखें) कुओं में 1-6। फ्रीज-गल और कोशिकाओं के लाइसिस के लिए रात भर −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सेल कल्चर प्लेट (निष्क्रिय लाइसिस बफर में नमूनों के साथ) ।
      सावधानी: बफर बनाने से पहले सभी रसायनों के लिए सुरक्षा डेटा शीट की जांच करें। सीडीटीए गंभीर आंखों को नुकसान और जलन का कारण बन सकता है।
    13. 10 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर गल नमूने । नमूनों को अलग करने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब स्थानांतरित करें और तुरंत बर्फ पर रखें।
    14. प्रत्येक नमूने की प्रोटीन एकाग्रता को मापें। प्रोटीन एकाग्रता कई अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल34का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है।
    15. आवश्यक के रूप में पतला करने के लिए 1x निष्क्रिय लाइसिस बफर का उपयोग करके नमूनों 1-6 (बराबर मात्रा में) के बीच प्रोटीन एकाग्रता को बराबरी करें।
    16. 6x एसडीएस नमूना बफर में 1:10 अनुपात में 2-मर्केप्टोथेनॉल जोड़ें।
    17. 1x एसडीएस नमूना बफर की अंतिम एकाग्रता के लिए 1-6 नमूनों में 2-मर्केप्टोथेनॉल के साथ 6x एसडीएस नमूना बफर जोड़ें।
    18. गर्मी के नमूने 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए हीट ब्लॉक पर और बर्फ पर ठंडा। नमूनों को 2.1.19 चरण तक -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    19. पिपेट एक 4-20% ढाल पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में कुओं के नमूनों के लिए 30 माइक्रोग्राम प्रोटीन युक्त मात्रा। प्रोटोकॉल 1 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार इम्यूनोब्लोटिंग प्रक्रिया करें।

3. छग-क्यूपीसीआर

नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को एक उदाहरण के रूप में p300 के अवरोधकों के लिए वर्णित किया गया है।

  1. बफर तैयारी
    नोट: बफर व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें। नीचे दिए गए चैआईपी प्रोटोकॉल (जैसे बफर व्यंजनों, धोने के समय और अपकेंद्रित्र समय) के सामान्य चरणों को संशोधित किया जाता है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) और साहित्य35, 36,से निर्माता की सिफारिशों से अनुकूलित कियाजाताहै।
    1. तैयार करें सीआईपी कमजोर पड़ने का बफर, न्यूक्लियी सूजन बफर, लो साल्ट वॉश बफर, हाई साल्ट वॉश बफर, लिसल वॉश बफर और टीई बफर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एसडीएस लाइसिस बफर, 10x ग्लाइसिन बफर और चिप इल्यूशन बफर तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      सावधानी: उचित हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए बफ़र्स बनाने से पहले सभी रसायनों के लिए सुरक्षा डेटा शीट की जांच करें।
  2. दवा उपचार
    नोट: चरण3.2में उपयोग की जाने वाली दवा कमजोर पड़ने की योजनाबद्ध के लिए पूरक प्रोटोकॉल (योजनाबद्ध 3) देखें।
    1. बीज एमसीएफ-7 कोशिकाओं में दो 15 सेमी संस्कृति व्यंजन और कोशिकाओं को विकसित करने के लिए 90% पूर्ण DMEM माध्यम के 12 एमएल में। निम्नलिखित प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए व्यंजन चिह्नित करें: डिश 1: डीएमएसओ नियंत्रण (संदर्भ बिंदु); डिश 2: ए-485 (3 माइक्रोन) ।
      नोट: एमसीएफ-7 कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, पूर्ण डीएमईएम मीडिया का उपयोग करें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस परबढ़ें। पूर्ण DMEM नुस्खा के लिए तालिका 1 देखें।
    2. एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में, डीएमईएम मीडिया के पिपेट 12 एमएल और डीएमएसओ के पिपेट 6 माइक्रोन। अच्छी तरह मिलाएं।
    3. एक अलग बाँझ 15 एमएल शंकु नली में, डीएमईएम मीडिया के पिपेट 12 एमएल और ए-485 (डीएमएसओ में 6 mM) के पिपेट 6 माइक्रोन (डीएमएसओ में 6 mm) 3 माइक्रोन ए-485 की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। अच्छी तरह मिलाएं।
    4. डिश 1 और 2 से मीडिया को आकांक्षी ।
    5. डीटीएम (चरण 3.2.2.) में पतला डीएमएसओ के 12 एमएल को डिश 1 में जोड़ें।
    6. डिश 2 में डीएमईएम (चरण 3.2.3.) में 3 माइक्रोनएम ए-485 का 12 एमएल जोड़ें।
    7. इनक्यूबेटर के लिए सेल संस्कृति व्यंजन वापस और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  3. सेल निर्धारण
    1. पिपेट 330 माइक्रोन (27.5 माइक्रोन प्रति एमएल) 37% फॉर्मलडिहाइड का पूरा मीडिया में और धीरे-धीरे प्लेट को मिलाने के लिए घूमता है।
      सावधानी: फॉर्मलडिहाइड विषाक्त है। उचित हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए सुरक्षा डेटा शीट देखें।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. प्लेट में 10x ग्लाइसिन के पिपेट 2 एमएल और मिश्रण करने के लिए भंवर।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, बर्फ पर व्यंजन रखें और प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल का एक एलिकोट गल जाएं।
    6. 3.1 चरण में तैयार बफर का उपयोग करके डीएमएसओ और ए-485 नमूनों दोनों के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
      1. प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 1:1,000 कमजोर पड़ने के साथ पीबीएस की 2 एमसीएल
      2. प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के 1:1,000 कमजोर पड़ने के साथ नाभिक सूजन बफर का 1 एमएल
      3. प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 1:1,000 कमजोर पड़ने के साथ एसडीएस लाइसिस बफर का 0.5 एमएल
    7. सेल कल्चर डिश से मीडिया को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को दो बार ठंडे पीबीएस के 15 एमएल से धोएं ।
    8. प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (चरण 3.3.6.1) के साथ पीबीएस के पिपेट 2 एमसीएल सेल संस्कृति व्यंजनों के लिए। कोशिका स्क्रैपर का उपयोग करके कोशिकाओं को समाधान में उठाएं।
    9. सेल सस्पेंशन को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त पीबीएस के साथ शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    10. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 x ग्राम पर स्पिन ट्यूब।
    11. गोली के लिए प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (चरण 3.3.6.2) के साथ नाभिक सूजन बफर के सुपरनेट और पिपेट 1 एमसीएल को एस्पिरेट करें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर गोली और इनक्यूबेट को फिर से खर्च करें।
    12. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,700 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    13. गोली के लिए प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (चरण 3.3.6.3) के साथ एसडीएस लाइसिस बफर के सुपरनेट और पिपेट 0.5 एमएल को एस्पिरेट करें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर गोली और इनक्यूबेट को फिर से खर्च करें।
    14. क्रोमेटिन नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि चरण 3.4.1 न हो जाए या 3.4 चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  4. डीएनए सोनिकेशन
    1. एक पिपेट (130 माइक्रोल प्रत्येक) का उपयोग करके दो डीएनए सोनिकेशन ट्यूबों में डीएमएसओ नमूने (चरण 3.3.14) से क्रोमेटिन के 130 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    2. एक पिपेट (130 माइक्रोल प्रत्येक) का उपयोग करके दो डीएनए सोनिकेशन ट्यूबों में ए-485 नमूने (चरण 3.3.14) से क्रोमेटिन के 130 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    3. निम्नलिखित सोनिकेटर सेटिंग्स का उपयोग करके लगभग 150-200 बेस जोड़ी टुकड़ों के लिए डीएनए को सोनिकेट करें: 175 की पीक एस्केम पावर (डब्ल्यू), 10% का ड्यूटी फैक्टर, 200 चक्र प्रति बर्स्ट और 430 एस उपचार समय।
      नोट: सोनीशन सेटिंग्स मॉडल के बीच भिन्न हो सकती हैं और विभिन्न सेल लाइनों के लिए उपयुक्त टुकड़ा आकार प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    4. सोनीशन के बाद बर्फ पर सैंपल रखें।
    5. सोनिकेटेड क्रोमेटिन को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पिपेट और सेंट्रलाइज का उपयोग करके 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. एक नई ट्यूब के लिए सुपरनेट (सोनिकेटेड क्रोमेटिन होता है) पिपेट करें और मलबे को त्यागें। सोनिकेटेड क्रोमेटिन को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (सीआईपी)
    नोट: चरण3.5में आईपी समूहों की योजनाबद्ध के लिए अनुपूरक प्रोटोकॉल (योजनाबद्ध 3) देखें।
    1. डीएमएसओ के लिए सोनिकेटेड क्रोमेटिन की प्रोटीन सामग्री और चरण 3.4.6 से ए-485 नमूनों को मापें। प्रोटीन सामग्री को अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल34का उपयोग करके मापा जा सकता है।
      नोट: सादगी के लिए, यह प्रोटोकॉल मान लेगा कि प्रोटीन की मात्रा बराबर है और सोनिकेटेड क्रोमेटिन के 100 माइक्रोन का उपयोग किया जाएगा। अन्यथा, प्रोटीन सामग्री को समान मात्रा में सभी नमूनों के बीच समतुल्य होने की आवश्यकता होगी।
    2. दो 1.5 एमएल ट्यूब (100 माइक्रोल प्रत्येक) के लिए डीएमएसओ सोनिकेटेड क्रोमेटिन के पिपेट 100 माइक्रोल। प्रत्येक ट्यूब में 1:1,000 कमजोर पड़ने वाले चैप कमजोर पड़ने बफर (प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 1:1,000 कमजोर पड़ने वाले) के पिपेट 400 माइक्रोन को 500 माइक्रोन तक कुल मात्रा लाने के लिए। 500 माइक्रोन तक कुल मात्रा लाने के लिए। 5 μL ट्यूब से समाधान के 5 माइक्रोन निकालें और DMSO इनपुट के रूप में -20 C ° पर स्टोर करें।
    3. एक-485 सोनिकेटेड क्रोमेटिन के पिपेट 100 माइक्रोन दो 1.5 एमएल ट्यूब (100 माइक्रोल प्रत्येक) के लिए। प्रत्येक ट्यूब में 500 माइक्रोन तक कुल मात्रा लाने के लिए प्रत्येक ट्यूब में चिप कमजोर पड़ने बफर (प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल का 1:1000 कमजोर पड़ने वाला) के पिपेट 400 माइक्रोन करें। 500 माइक्रोन तक कुल मात्रा लाने के लिए। 5 μL ट्यूब से समाधान का 5 माइक्रोन निकालें और एक-485 इनपुट के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. एक पिपेट का उपयोग करके, डीएमएसओ और ए-485 नमूनों के लिए संबंधित ट्यूबों में इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (आईपी) एंटीबॉडी (जैसे गैर-विशिष्ट आईजीजी नियंत्रण या एच 3K27ac विशिष्ट एंटीबॉडी) जोड़ें: आईजीजी एंटीबॉडी (5-10 माइक्रोग्राम) के साथ डीएमएसओ क्रोमेटिन के आईपी #1; आईपी #2 D3K27ac एंटीबॉडी (5-10 माइक्रोन) के साथ DMSO क्रोमेटिन; आईपी #3 आईजीजी एंटीबॉडी (5-10 माइक्रोग्राम) के साथ ए-485 क्रोमेटिन; आईपी #4 H3K27ac एंटीबॉडी (5-10 μg) के साथ एक-४८५ क्रोमेटिन ।
    5. प्रत्येक ट्यूब में 20 माइक्रोन प्रोटीन एक चुंबकीय मोती जोड़ें। सुनिश्चित करें कि मोती अच्छी तरह से निलंबित कर रहे हैं।
    6. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घुमाएं।
    7. प्रोटीन को गोली दें एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके एक चुंबकीय मोती और सुपरनैंट को हटा दें। मोतियों को परेशान न करें।
    8. मोतियों को कम नमक धोने वाले बफर के 500 माइक्रोन से 1 एमएल के साथ धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। एक त्वरित स्पिन नीचे प्रदर्शन करें, एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके मोतियों को गोली दें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    9. मोतियों को 500 माइक्रोन से 1 एमएल हाई साल्ट वॉश बफर से धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। एक त्वरित स्पिन नीचे प्रदर्शन करें, एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके मोतियों को गोली दें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    10. एलआईसीएल वॉश बफर के 500 माइक्रोन से 1 एमएल के साथ मोतियों को धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक घुमाएं। एक त्वरित स्पिन नीचे प्रदर्शन करें, एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके मोतियों को गोली दें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    11. मोतियों को 500 माइक्रोन से 1 एमएल ते बफर से धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। एक त्वरित स्पिन नीचे प्रदर्शन करें। 3.5.14 चरण तक ते बफर में मोतियों को रखें।
    12. फ्रीजर से इनपुट नमूने (चरण 3.5.2 और 3.5.3 से) निकालें और बर्फ पर रखें।
    13. प्रोटीनेज के एक एलिकोट गल ।
    14. एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग कर मोतियों को गोली मारें और मोतियों से ते बफर को हटा दें (चरण 3.5.11 से)।
    15. इनपुट नमूनों सहित हर नमूने में 100 μL ChIP elution बफर + 1 माइक्रोन प्रोटीनेज कश्मीर जोड़ें। थर्मोसाइकिलर का उपयोग करके 2 घंटे के लिए 62 डिग्री सेल्सियस पर मिलाने के साथ नमूने इनक्यूबेट करें।
    16. 2 घंटे के बाद, थर्मोसाइकिल का उपयोग करके 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी के नमूने।
    17. नमूनों को कमरे के तापमान में ठंडा करें।
    18. एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करते हुए पैलेट चुंबकीय मोती और सुपरनैंट (ब्याज के डीएनए शामिल हैं) को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    19. एक मानक पीसीआर सफाई किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध।
    20. शुद्ध डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और मानक क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल में टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। क्यूपीसीआर चलाने के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।
  6. ChIP-qPCR डेटा विश्लेषण
    नोट: ChIP-qPCR परिणामों का विश्लेषण करने के लिए दो सामान्य तरीके आईजीजी एंटीबॉडी और 1% इनपुट विधि पर गुना संवर्धन हैं। दोनों विश्लेषण विधियों के लिए एक उत्कृष्ट टेम्पलेट एक वाणिज्यिक स्रोत द्वारा प्रदान कियाजाताहै जल्दी से प्रत्येक आईपी एंटीबॉडी के लिए गुना संवर्धन की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/
    1. गुना संवर्धन और % इनपुट की गणना करने के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी (गैर-विशिष्ट आईजीजी, आईपी एच 3K27ac एंटीबॉडी, और 1% इनपुट) के लिए प्राप्त क्यूपीसीआर डेटा से एब्लेक्ट मानों को विश्लेषण टेम्पलेट में इसी क्षेत्र में कॉपी और पेस्ट करें और 1% इनपुट स्वचालित रूप से आबाद हो जाएंगे।

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Representative Results

इन विट्रो हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफरेज (हैट) परख का उपयोग उन यौगिकों के लिए जांच करने के लिए किया जा सकता है जो एक हिस्टोन सब्सट्रेट की ओर p300 टोपी गतिविधि को रोकते हैं। चित्रा 1A टोपी परख के लिए एक प्रयोगात्मक योजनाबद्ध प्रदान करता है। एनाकार्डिक एसिड, एक ज्ञात HATi3,,38, 12.5-100माइक्रोन से एक एकाग्रता रेंज में इस परख में उपयोग किया गया था। 100 माइक्रोन में, एनाकार्डिक एसिड ने हिपस्टोन 3, लिसिन 9 और 18 बनाम नियंत्रण डीएमएसओ उपचार(चित्रा 1B,लेन 5 बनाम लेन 1) में पी 300 उत्प्रेरक हाइस्टोन एसीटिलेशन को डाउनरेगुलेट किया। इस परख में एक एकाग्रता सीमा का उपयोग किया गया था क्योंकि कम दवा खुराक p300 टोपी गतिविधि(चित्रा 1B, लेन 2-4बनाम लेन 1) को बहुत बाधित नहीं कर सकते हैं। लेन 6 में, कोई एसीटिल-सीओए प्रतिक्रिया में जोड़ा गया था और p300 उत्प्रेरक के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और पुनर्संयोजन H3.1(चित्रा 1B)पर हिस्टोन एसिटिलेशन के बेसल स्तर के लिए । p300 और H3.1 प्रोटीन के स्तर का उपयोग लोडिंग नियंत्रण(चित्रा 1B)के रूप में किया गया था। इन इम्यूनोब्लॉट परिणामों को इमेजजे39 (चित्रा 1C)का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। गुना परिवर्तन प्रत्येक एसीटिलेशन जांच के लिए DMSO नियंत्रण के बैंड तीव्रता के लिए प्रत्येक नमूने के बैंड तीव्रता की तुलना करके गणना की गई । 100 माइक्रोनएम पर एनाकार्डिक एसिड के लिए क्वांटिफिकेशन एच 3K18ac और H3K9ac बनाम डीएमएसओ नियंत्रण में शक्तिशाली कमी दिखाता है, जो चित्र 1बीमें दृश्य परिणामों की पुष्टि करता है।

क्रोमेटिन हाइपरसेटिलेशन अवरोध (सीएचएई) परख में, एचडीएसीआई का उपयोग क्रोमेटिन में हिस्टन को हाइपरसेटिलेट करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाता है, जो एचटीआई24के साथ सह-इनक्यूबेशन से पहले, जैसे कि पी 300 अवरोधक ए-4852,,4। इस परख का उद्देश्य एचडीएसीआई द्वारा प्रेरित हाइस्टोन हाइपरसेटिलेशन को कम करने के लिए एचएटीआई की प्रभावकारिता का निर्धारण करना है। चित्रा 2A ChHAI परख के लिए एक प्रयोगात्मक योजनाबद्ध प्रदान करता है । इस परख में, एचडीएसीआई एमएस-275 के साथ एमसीएफ-7 कोशिकाओं का उपचार कई lysine अवशेषों(चित्रा 2B,लेन 4 बनाम लेन 1) पर हिस्टोन 3 पर दृढ़ता से अप्रेय किया गया एसिटिलेशन। H3K18ac और H3K27ac के बेसल स्तर कम थे, ChHAI परख में एक HDACi जोड़ने के लाभों को दिखा(चित्रा 2B,लेन 1-3) । एमएस-275 के साथ ए-485 के अलावा एच 3K18 और H3K27 में बढ़ी हुई हिस्टोन एसिटिलेशन को क्षीण करता है, लेकिन H3K9(चित्रा 2B,लेन 4-6) नहीं। महत्वपूर्ण बात, H3K9ac सेल संस्कृति2में p300 द्वारा विनियमित नहीं है, इस प्रयोग में ए-485 की विशिष्टता दिखा रहा है। इन इम्यूनोब्लॉट परिणामों की मात्रा चित्रा 2 सीमें निर्धारित की गई थी । गुना परिवर्तन प्रत्येक नमूना के बैंड तीव्रता की तुलना एमएस-२७५ अकेले (लेन 4) प्रत्येक एसीटिलेशन जांच के लिए बैंड तीव्रता से की गई । लेन 1-3 मात्रा निर्धारित नहीं थे क्योंकि H3K18ac और H3K27ac बेसल के स्तर का पता नहीं लगाया गया ।

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन-मात्रात्मक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (ChIP-qPCR) एक सेल कल्चर प्रयोग है जो जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करता है । इसका उपयोग जीन नियामक तत्वों पर हैटी के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है जो ऑन्कोजीन अभिव्यक्ति25को नियंत्रित करते हैं । चित्रा 3A ChIP-qPCR प्रोटोकॉल के लिए एक प्रयोगात्मक योजनाबद्ध प्रदान करता है। एमसीएफ-7 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 3 μM A-485 के साथ इलाज किया गया Histone-डीएनए परिसरों के इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के माध्यम से ChIP-qPCR के अधीन थे H3K27ac(चित्रा 3)में समृद्ध । प्यूरिफाइड डीएनए का विश्लेषण साइक्लिन डी1 प्रमोटर सीक्वेंस के लिए किया गया था । ChIP-qPCR प्राइमर जीनोम में एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम के खिलाफ डिजाइन किए हैं और उपजी डीएनए की सापेक्ष राशि का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। उपजी डीएनए की मात्रा जांच के तहत जीनोमिक क्षेत्र में ब्याज के प्रोटीन की बहुतायत को दर्शाता है । दरअसल, DMSO नमूने में, आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी द्वारा उपजी डीएनए साइक्लिन D1 प्रमोटर(चित्रा 3B)के लिए qPCR प्रतिक्रिया में H3K27ac एंटीबॉडी की तुलना में एक उच्च सीटी मूल्य पैदा करता है । यह इंगित करता है कि गैर-विशिष्ट आईजीजी नियंत्रण ने साइक्लिन डी 1 प्रमोटर में एच 3K27ac विशिष्ट एंटीबॉडी की तुलना में कम डीएनए-प्रोटीन परिसरों को उपजी। यह गैर-विशिष्ट आईजीजी नियंत्रण(चित्रा 3B)पर H3K27ac के 632.73 गुना संवर्धन का अनुवाद करता है।

यह गुना संवर्धन इस बात का सबूत देता है कि एच 3K27ac विशिष्ट एंटीबॉडी सफलतापूर्वक इम्यूनोप्रिपिटेटेड एसिटिलेटेड हिस्टिटोन और एच 3K27ac को साइक्लिन डी 1 प्रमोटर में समृद्ध किया जाता है। H3K27ac एंटीबॉडी की गुणवत्ता को मान्य करने के बाद, DMSO और ए-485 इलाज समूहों के बीच एक तुलना की जा सकती है। जैसा कि चित्रा 3 सीमें दिखाया गया है, ए-485 %इनपुट विधि (एन = 2 के प्रतिनिधि परिणाम) का उपयोग करके सिक्लिन डी 1 प्रमोटर बनाम डीएमएसओ नियंत्रण पर H3K27ac संवर्धन को कम करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि ए-485 को सेल कल्चर2, 4,में H3K27ac को काफी कम करने के लिए जानाजाताहै।

प्रयोगात्मक प्रवृत्ति पुन: उत्पन्न होने के बावजूद, छग-क्यूपीसीआर कच्चे % इनपुट मान स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकते हैं। इसलिए, नियंत्रण और दवा उपचार10के बीच प्रजनन अनुपात दिखाने के लिए डेटा को DMSO नियंत्रण के सामान्यीकृत प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत करना उपयोगी हो सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 डीमें, ए-485 साइक्लिन डी 1 प्रमोटर (एन = 2) में एच 3K27ac अधिभोग को काफी हद तक कम करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट (* पी & 0.05) पर आधारित था।

Figure 1
चित्रा 1: एनाकार्डिक एसिड एक टोपी परख में p300 एंजाइमेटिक गतिविधि को रोकता है। (क)हैट परख का एक योजनाबद्ध आरेख, जो एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को दर्शाता है । (ख)एनाकार्डिक एसिड ने डीएमएसओ नियंत्रण उपचार (लेन 1) बनाम 100 माइक्रोन (लेन 5) पर H3K18 और H3K9 में p300 एंजाइमेटिक गतिविधि और डाउनरेलेट हाइस्टोन एसीटिलेशन को बाधित किया। लेन 6 प्रतिक्रिया में एसीटिल-सीओए का अभाव है और हिस्टोन एसीटिलेशन के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। (ग)इम्यूनोब्लॉट के परिणाम (बी) की मात्रा निर्धारित की गई थी । गुना परिवर्तन प्रत्येक एसीटिलेशन जांच के लिए DMSO नियंत्रण के बैंड तीव्रता के लिए प्रत्येक नमूने के बैंड तीव्रता की तुलना करके गणना की गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: p300 अवरोधक ए-485 शक्तिशाली ChHAI परख में हिस्टोन हाइपरएसेटाइलेशन क्षीण हो जाता है। (A)छई परख का एक योजनाबद्ध आरेख । (ख)एमसीएफ-7 कोशिकाओं में, एचडीएसी अवरोधक एमएस-275 ने एच 3के18, K27 और K9 (लेन 4) बनाम डीएमएसओ नियंत्रण (लेन 1) में शक्तिशाली रूप से अपैलेटली हिस्टोन एसीटिलेशन किया। एक-४८५ के अलावा, एक ज्ञात p300 टोपी अवरोधक, एमएस के साथ-२७५ H3K18 और K27 में हिस्टोन एसीटिलेशन में वृद्धि तनु, लेकिन नहीं H3K9 (लेन 5-6 बनाम लेन 4) । (ग)इम्यूनोब्लॉट के परिणाम (बी) की मात्रा निर्धारित की गई थी । गुना परिवर्तन प्रत्येक नमूना के बैंड तीव्रता की तुलना एमएस-२७५ अकेले (लेन 4) प्रत्येक एसीटिलेशन जांच के लिए बैंड तीव्रता से की गई । लेन 1-3 मात्रा निर्धारित नहीं थे क्योंकि H3K18ac और H3K27ac बेसल के स्तर का पता नहीं लगाया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: p300 अवरोधक ए-485 Cyclin D1 प्रमोटर पर H3K27ac स्तर को कम कर देता है जैसा कि ChIP-qPCR द्वारा मापा जाता है। (ए)चैप-क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध आरेख। (ख)आईजीजी और एच3के27ैक इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए साइक्लिन डी1 प्रमोटर के लिए प्रतिनिधि क्यूपीसीआर सीटी मान । आईजीजी नियंत्रण का उच्च सीटी मूल्य था, जो यह दर्शाता है कि एच 3K27ac एंटीबॉडी ने गैर-विशिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी पर H3K27ac के लिए सफलतापूर्वक समृद्ध किया। (C)एमसीएफ-7 कोशिकाओं (एन = 2 के प्रतिनिधि परिणाम) में डीएमएसओ नियंत्रण उपचार की तुलना में साइक्लिन डी 1 प्रमोटर में 24 घंटे डाउनरेटेड एच 3K27ac के लिए ए-485 (3 माइक्रोन) उपचार। (घ)दो स्वतंत्र सीआईपी प्रयोगों से प्राप्त इनपुट को डीएमएसओ नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में डीएमएसओ नियंत्रण में सामान्यीकृत किया गया था । एमसीएफ-7 कोशिकाओं में ए-485 के साथ उपचार साइक्लिन डी 1 प्रमोटर में H3K27ac अधिभोग को काफी हद तक कम करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट (* पी & 0.05) पर आधारित था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बफ़र नुस्खा
10X ग्लाइसिन बफर PBS के साथ ग्लाइसिन के 18.74 ग्राम भंग होने तक और 200 मिलीलीटर करने के लिए PBS जोड़ें।
10X रनिंग बफर 250 एमएमएम ट्रिस, 1.9 एम ग्लाइसिन, 1% एसडीएस
1000 मिलीलीटर एच2ओ में 30.0 ग्राम ट्रिस बेस, 144.0 ग्राम ग्लाइसिन और 10.0 ग्राम एसडीएस को भंग करें। बफर का पीएच 8.3 होना चाहिए और पीएच समायोजन की आवश्यकता नहीं है। कमरे के तापमान पर चल रहे बफर को स्टोर करें और उपयोग से पहले 1X तक पतला करें।
10X टीबीस्ट 2.42 ग्राम ट्रिस बेस, एनएसीएल का 8जी, 50% ट्वीन 20 का 2 मिलीलीटर, 1 लीटर में ddH2O जोड़ें
5% दूध के साथ 1X टीबीस्ट 1X टीबीटी के लगभग 100 मिलीलीटर प्रति 5g पाउडर दूध
5X परख बफर: 500 mM HEPES, पीएच 7.5, 0.4% ट्राइटन एक्स-100
5X निष्क्रिय लाइसिस बफर एक जलीय स्टॉक जिसमें 125 एमएम ट्रिस, पीएच 7.8, 10 एमएम 1,2-सीडीटीए, 10 एमएम डीटीटी, 5 मिलीग्राम/एमएल बीएसए, 5% (vol/vol) ट्राइटन एक्स-100 और 50% (vol/vol) ddH2O में ग्लाइसरोल होता है।
6x सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) 0.375 एम ट्रिस पीएच 6.8, 6 मिलीलीटर ग्लाइसेरोल, 1.2 ग्राम एसडीएस, 0.93 ग्राम 1,4-डायिटोथ्रेटोल (डीटीटी), 6 एमजी ब्रोमोफेनोल ब्लू, 10 मिलीलीटर पानी जोड़ें।
सीआईपी कमजोर पड़ने बफर 0.01% एसडीएस, 1.1% ट्राइटन एक्स-100, 1.2 एमएम ईडीटीए, 167 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 167 एमएम एनएसीएल
सीआईपी एल्यूशन बफर ऑटोक्लेवेड ddH2O में 1% एसडीएस (w/v) और 0.1 एम NaHCO3
एमसीएफ-7 सेल के लिए पूरा डीएमईएम: Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) 10% गोजातीय बछड़ा सीरम (बीसीएस), पेनिसिलिन (10 इकाइयों/मिलीलीटर), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 मिलीग्राम/मिलीलीटर) के साथ पूरक
हाई साल्ट वॉश बफर 01% एसडीएस, 1% ट्राइटन एक्स-100, 2 एमएम ईडीटीए, 200 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 500 एमएम एनएसीएल।
लिसल वॉश बफर 0.25 एम एलआईसीएल, 1% एनपी-40, 1% सोडियम डिऑक्सीकोटल, 1 एमएम ईडीटीए, 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0।
कम नमक धोने बफर 01% एसडीएस, 1% ट्राइटन एक्स-100, 2 एमएम ईडीटीए, 200 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 150 एमएम एनएसीएल।
नाभिक सूजन बफर 5 एमएम पाइप पीएच 8.0, 85 एमएम केसीएल, 0.5% एनपी-40
एसडीएस लाइसिस बफर 1% एसडीएस, 10 एमएम ईडीटीए, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0
ते बफर 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम ईडीटीए।
बफर ट्रांसफर 25 एमएमएम ट्रिस, 190 m m m ग्लाइसिन, 20% मेथनॉल की जांच करें और पीएच 8.3 यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।

तालिका 1: बफ़र्स और समाधान के व्यंजनों का उपयोग किया जाता है।

अनुपूरक फाइलें: प्रोटोकॉल 1-3 के लिए अनुपूरक प्रायोगिक योजनाएं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जीन ट्रांसक्रिप्शन2,3को विनियमित करने के लिए लिसाइन एसिटाइलट्रांसफेरेसेस (KATs) हाइस्टोन पूंछ और ट्रांसक्रिप्शन कारकों पर कई लिसाइन अवशेषों का इस्टल करें। पिछले दो दशकों में किए गए कार्य से पता चला है कि सीबीपी/पी300, पीसीएएफ और जीसीएन5 जैसे केएटीएस, ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के साथ बातचीत करते हैं और कई ठोस,ट्यूमर प्रकार4,5, 9, 15,,916,,17, 18में,ट्यूमर वृद्धि को चलाने में मदद,15करते18हैं। ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने में उनकी उभरती भूमिका के कारण, KATs कैंसर के इलाज में उपंयास लक्ष्य के रूप में जांच की जा रही है । उपन्यास कैट अवरोधकों (KATI) को क्लिनिक में उपयोग करने के लिए जाने से पहले शक्ति, चयन और सुरक्षा के लिए सावधानीपूर्वक और कड़ाई से परीक्षण करने की आवश्यकता है। हाल के साक्ष्यों से पता चला है कि पहले वर्णित KATI यौगिक लक्ष्य प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं और वैज्ञानिक साहित्य में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने से पहले खराब विशेषता थे क्योंकि रासायनिक जांच21। इसलिए, KATI लक्षण वर्णन के लिए कठोर तरीकों की आवश्यकता है। यहां वर्णित तीन प्रोटोकॉल हैं जिनका उपयोग KATs के हिस्टोन एसिटिलट्रांसफेरेज (हैट) फ़ंक्शन को लक्षित करने वाले उपन्यास अवरोधकों को चित्रित और मान्य करने के लिए एक साथ किया जा सकता है: एक इन विट्रो हैट परख, CHHAI परख, और ChIP-qPCR। ये प्रोटोकॉल उदाहरण के रूप में सीबीपी/पी300 और उनके अवरोधकों का उपयोग करते हैं, लेकिन इन तरीकों को अन्य KATs की जांच में भविष्य के आवेदन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है ।

हैट परख एक टेस्ट ट्यूब में टोपी समारोह को बाधित करने में शक्ति के लिए यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए सरल और लागत प्रभावी तरीका है। शुद्ध HATs (या तो recombinant4,,10 या इम्यूनोप्रिपिटेटेड४०)इस परख में परीक्षण किया जा सकता है, लेकिन recombinant CBP/p300 इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है । सीबीपी/पी300 में एक एंजाइमैटिक हैट डोमेन है जो एसिटिल-सीओए से एक एसिटिल समूह को एक लक्ष्य सब्सट्रेट3पर एक लिसिन अवशेषों में स्थानांतरित करता है। सबसे अधिक विशेषता सीबीपी/पी300 हिस्टोन लक्ष्य हिस्टोन 3 Lysine 18 और 27 (H3K18 और H3K27, क्रमशः)2,,3,10,,11हैं ।, हैट परख में, शुद्ध p300 हैट डोमेन को एक सब्सट्रेट के रूप में एसीटिल-सीओए और हिस्टोन 3.1 के साथ इनक्यूबेटेड किया गया है। इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, p300 H3K18 और H3K27 सहित कई H3.1 अवशेषों पर एसीटिलेशन उत्प्रेरित करेगा । इन अवशेषों पर एसीटिलेशन की सापेक्ष बहुतायत इम्यूनोब्लोटिंग के माध्यम से मापा जा सकता है। इस टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया का उपयोग उपन्यास यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है जो p300 से बांधते हैं और अपनी टोपी गतिविधि (HATI) को रोकते हैं। उदाहरण के लिए, एनाकार्डिक एसिड, एक ज्ञात HATi38,डीएमएसओ नियंत्रण(चित्रा 1B,लेन 5 बनाम लेन 1) की तुलना में एच 3के 18 और एच 3के 9 दोनों में हिस्टोन एसिटिलेशन को शक्तिशाली रूप से डाउनरेगुलेट करता है। प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाओं(चित्रा 1B, लेन 1-5)या हाइस्टोन एसिटिलेशन के p300 उत्प्रेरक(चित्रा 1B,लेन 6) में एसीटिल-सीओए जोड़ना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। एसिटिल-सीओए की अनुपस्थिति का उपयोग पी 300 उत्प्रेरक के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में और पुनर्संयोजन एच 3.1 पर हिस्टोन एसिटिलेशन के बेसल स्तर के लिए भी किया जा सकता है।

हैट परख करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक प्रतिक्रिया को p300, H3.1 और एसीटाइल-सीओए की समान राशि प्राप्त हो। इम्यूनोब्लॉट में एच 3.1 और पी 300 का स्तर जेल के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में काम करता है। इस परख के लिए साइट स्पेसिफिक हिस्टोन एसिटाइल एंटीबॉडी या पैन-एसिटाइल एंटीबॉडी का इस्तेमाल इम्यूनोब्लोटिंग के लिए किया जा सकता है। इम्यूनोब्लॉट गुणवत्ता में सुधार करने के लिए अनुकूलन करते समय इम्यूनोब्लोटिंग के लिए मान्य एंटीबॉडी का उपयोग करना और शुरू में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल अनुभाग में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के संदर्भ के लिए हैं और प्रारंभिक प्रयोगों के परिणामों के आधार पर कमजोरियों को बदला जा सकता है (उदाहरण के लिए, यदि संकेत बहुत मजबूत है तो एंटीबॉडी को और पतला किया जा सकता है)। अपनी सादगी के कारण, टोपी परख उपन्यास अवरोधकों स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक प्रयोग है। हालांकि, टोपी परख नुकसान है । टोपी परख के साथ एक बड़ी चिंता का विषय यह है कि यौगिकों कि एक परीक्षण ट्यूब में प्रभावी रहे है एक जीवित प्रणाली में अप्रभावी साबित हो सकता है । यह एक मुद्दा है क्योंकि सेल संस्कृति में यौगिक प्रभावकारिता सेलुलर पारमीक्षा मुद्दों, सेलुलर चयापचय, और यौगिक स्थिरता द्वारा बदला जा सकता है । इसके अलावा, KATs, विशेष रूप से CBP/p300, कई प्रोटीन प्रोटीन बातचीत है कि सेल,संस्कृति3,४१,४२में उनकी कैट गतिविधि को विनियमित है ।, इसलिए, सेल कल्चर प्रयोगों में टोपी परख में पहचाने गए अवरोधकों को आगे बढ़ाना आवश्यक है20,23.

क्रोमेटिन हाइपरसेटिलेशन अवरोध (सीएचएई) परख पाइपलाइन में दूसरा प्रोटोकॉल है और सेल संस्कृति में उपन्यास अवरोधकों के प्रभावों को मान्य करने के लिए उपयोगी है। यह परख कोशिकाओं में हिस्टोन हाइपरसेटाइलेशन को प्रेरित करने के लिए एचडीएसी अवरोधकों (एचडीएसीआई)24 का उपयोग करती है क्योंकि बेसल एसीटिलेशन इम्यूनोब्लॉट पर पता लगाने के लिए बहुत कम हो सकता है। पसंद की सेल लाइनों को एचडीएसीआई के साथ पूर्व-इनक्यूबेटेड किया जाता है ताकि एचएटीआई के अलावा एसिटिलेटेड क्रोमेटिन के संचय की अनुमति दी जा सके। एचडीएसीआई और एचएटीआई को सह-इनक्यूबेटिंग करने के बाद, कोशिकाओं को विशिष्ट हिस्टोन एसिटिलेशन साइटों के लिए मानक इम्यूनोब्लोटिंग प्रक्रियाओं के अधीन किया जाता है। इस परख का उद्देश्य एचडीएसीआई द्वारा प्रेरित हिस्टोन हाइपरसेटिलेशन को कम करने के लिए उपन्यास हाती की प्रभावकारिता का निर्धारण करना है। HDACi के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में डीएमएसओ सॉल्वेंट(चित्रा 2B,लेन 4 बनाम लेन 1) के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की तुलना में हिस्टोन एसिटिलेशन का काफी उच्च स्तर होना चाहिए। एचडीएसीआई के साथ एचटीआई के अलावा अकेले एचडीएसीआई उपचार(चित्रा 2B, लेन 5-6बनाम लेन 4) की तुलना में इम्यूनोब्लॉट सिग्नल को कम करने की उम्मीद है। हिस्टोन एसिटिलेशन(चित्रा 2 बी,लेन 1-3) के बेसल स्तर का पता लगाना मुश्किल है और इस प्रोटोकॉल में एचडीएसीआई जोड़ने के महत्व को उजागर करता है। एमएस-275 (एंटिनोस्टैट) का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है लेकिन अन्य एचडीएसीआई का उपयोग24,,43किया जा सकता है। एमएस-275 में कक्षा 1 एचडीएसी बनाम परिवर्तनीय सांद्रता की सूचना दी गई है और आम तौर पर क्रमशः43, 44,,44नैनोमोलर सांद्रता के लिए नैनोमोलर के साथ HDAC1 और HDAC3 को रोकता है। साहित्य45, 46, 47,46,में एमएस-275 सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कियाजाताहै, लेकिन 3 माइक्रोन उपचार एमसीएफ-7 कोशिकाओं में हिस्टोन एसिटिलेशन में एक मजबूत और प्रजनन योग्य वृद्धि प्रदान करता है। इसलिए, एक अलग सेल लाइन का उपयोग करते समय CHHAI परख के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एचडीएसीआई और एचएटीआई सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक प्रारंभिक स्क्रीन प्रदर्शन करना फायदेमंद हो सकता है।

हैट परख के समान, इम्यूनोब्लॉट प्रोटोकॉल को उचित एंटीबॉडी, इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और सावधानीपूर्वक नियंत्रित नमूना लोडिंग के उपयोग के माध्यम से गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए सावधानीपूर्वक नियंत्रित नमूना लोडिंग आवश्यक है और सभी नमूनों की प्रोटीन सामग्री को बराबर करने के माध्यम से और इम्यूनोब्लॉट जेल के कुओं में नमूनों की समान मात्रा को पाइपिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में जांच के लिए पैन-एसिटाइल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इसे साइट-विशिष्ट एसीटाइल एंटीबॉडी के साथ पूरक किया जाना चाहिए क्योंकि केTs में कुछ हिस्टोन लिसिन अवशेषों के लिए विशिष्टता है और HATi सेल संस्कृति,,1, 2, 4,,5,210, 11में सभी हिस्टोन एसिटिलेशन साइटों को प्रभावित नहीं करता,4है।, अवरोधक जो हैट और छई परख दोनों में हिस्टोन एसिटिलेशन को कम करने में शक्तिशाली हैं, आगे के मूल्यांकन के लिए मजबूत उम्मीदवार हैं। महत्वपूर्ण बात, टोपी और CHHAI परख केवल हिस्टोन acetylation में वैश्विक परिवर्तन के बारे में डेटा प्रदान करने की सीमा है । यह सीमा जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों में उपन्यास HATI के प्रभावों की विशेषता की आवश्यकता पैदा करती है।

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन-मात्रात्मक पॉलीमेरेज चेन रिएक्शन (ChIP-qPCR) पाइपलाइन में अंतिम प्रोटोकॉल है और जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का मूल्यांकन करता है। इस परख में, H3K27ac में समृद्ध जीनोमिक क्षेत्रों इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (आईपी) के माध्यम से शुद्ध कर रहे है और qPCR में डीएनए प्राइमर का उपयोग कर विश्लेषण किया । यह तकनीक जीन प्रमोटरों और बढ़ाने वालों में हिस्टोन संशोधनों को कैसे प्रभावित करती है, इस बारे में मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। ChIP-qPCR एक मजबूत तकनीक है और पूरे जीनोम अनुक्रमण (जैसे, ChIP-seq) की तुलना में कम महंगा है, लेकिन परिणाम को प्रभावित करने वाले कई चरणों के कारण अनुकूलन करना मुश्किल हो सकता है। सही ढंग से अनुकूलित करने के लिए सबसे कठिन कदम कदम 3.5, इम्यूनोप्रिपिटेशन है। इस कदम को अनुकूलित करना मुश्किल है क्योंकि यदि चरण 3.5.20 में शुद्ध डीएनए अत्यधिक पतला है तो यह क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया में खराब परिणाम पैदा कर सकता है (उदाहरण के लिए, लक्ष्य जीन अनुक्रम और बहुत उच्च CTct मूल्यों का कोई प्रवर्धन नहीं)। आईपी स्टेप की सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है, जैसे ब्याज के प्रोटीन लक्ष्य की बहुतायत और आईपी एंटीबॉडी की गुणवत्ता। आईपी चरण की सफलता को सत्यापित करने के लिए आईपी एच 3K27ac एंटीबॉडी बनाम आईजीजी नियंत्रण की गुणवत्ता को मान्य करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, चित्र 3बीमें, H3K27ac विशिष्ट एंटीबॉडी गैर-विशिष्ट आईजीजी नियंत्रण पर 632.73 गुना संवर्धन प्रदर्शित करता है। यह इंगित करता है कि H3K27ac एंटीबॉडी उच्च गुणवत्ता है और H3K27ac साइक्लिन D1 प्रमोटर में समृद्ध है। आईपी एंटीबॉडी के सत्यापन के बाद, डीएमएसओ और ए-485 इलाज समूहों के बीच तुलना की जा सकती है। जैसा कि चित्रा 3 सीमें दिखाया गया है, ए-485 %इनपुट विधि (एन = 2 के प्रतिनिधि परिणाम) का उपयोग करके सिक्लिन डी 1 प्रमोटर बनाम डीएमएसओ नियंत्रण पर H3K27ac संवर्धन को कम करता है। यदि आईपी एंटीबॉडी कम गुणवत्ता वाला साबित होता है और प्रारंभिक प्रयोगों में गुना संवर्धन नहीं दिखाता है, तो चरण 3.2.1 में सेल संख्या बढ़ाने का प्रयास करें। उच्च सेल संख्या lysate के कुल प्रोटीन सामग्री में वृद्धि करके गरीब एंटीबॉडी गुणवत्ता के लिए क्षतिपूर्ति में मदद कर सकते हैं और आईपी प्रतिक्रिया में अधिक प्रोटीन जोड़ने के लिए अनुमति देगा।

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Disclosures

लेखकों के हित या खुलासे के लिए कोई संघर्ष नहीं करना है ।

Acknowledgments

इस काम को जेम्स और एस्तेर किंग बायोमेडिकल रिसर्च प्रोग्राम (6JK03 और 20K07), और बैंकहेड-कोले कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (4BF02 और 6BC03), फ्लोरिडा डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ, फ्लोरिडा ब्रेस्ट कैंसर फाउंडेशन और यूएफ हेल्थ कैंसर सेंटर के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त, हम प्रकाशन प्रक्रिया के दौरान उनके समर्थन के लिए डॉ जचारी ओस्किंग और डॉ एंड्रिया लिन को धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

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References

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Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

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