Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyser for validering av histone acetyltransferasehemmere

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

Hemmere av histone acetyltransferaser (HATs, også kjent som lysin acetyltransferaser), som CBP/p300, er potensielle terapeutiske midler for behandling av kreft. Imidlertid er det nødvendig med strenge metoder for å validere disse hemmerne. Tre in vitro metoder for validering inkluderer HAT-analyser med rekombinante acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylering i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Abstract

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på histoner og andre proteiner for å regulere kromatindynamikk og genuttrykk. KATs, som CBP/p300, er under intens undersøkelse som terapeutiske mål på grunn av deres kritiske rolle i tumorigenesis av ulike kreftformer. Utviklingen av nye små molekylhemmere rettet mot histone acetyltransferase (HAT)-funksjonen til KATs er utfordrende og krever robuste analyser som kan validere spesifisiteten og styrken til potensielle hemmere.

Denne artikkelen skisserer en rørledning av tre metoder som gir streng in vitro validering for nye HAT-hemmere (HATi). Disse metodene inkluderer et testrør HAT analyse, Kromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativ PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinante HATs med histoner i en reagensrørreaksjon, noe som åpner for acetylering av spesifikke lysinrester på histonehalene. Denne reaksjonen kan blokkeres av en HATi, og de relative nivåene av stedsspesifikk histonesecetylering kan måles via immunoblotting. Hemmere identifisert i HAT-analysen må bekreftes i cellulært miljø.

ChHAI-analysen bruker immunoblotting til å screene for romanen HATi som demper den robuste hyperacetyleringen av histoner indusert av en histondeacetylasehemmer (HDACi). Tilsetning av en HDACi er nyttig fordi basale nivåer av histone acetylering kan være vanskelig å oppdage via immunoblotting.

HAT- og ChHAI-analysene måler globale endringer i histoneseedylering, men gir ikke informasjon om acetylering i bestemte genomiske regioner. Derfor brukes ChIP-qPCR til å undersøke effekten av HATi på histone acetyleringsnivåer ved genregulatoriske elementer. Dette oppnås gjennom selektiv immunforekomst av histone-DNA-komplekser og analyse av renset DNA gjennom qPCR. Sammen gir disse tre analysene mulighet for nøye validering av spesifisitet, styrke og virkningsmekanisme av romanen HATi.

Introduction

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner1,,2,,3,,4. Nyere forskning viser at KATs og deres acetyltransferase funksjon kan fremme solid tumorvekst4,5,6,7,8,9. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP) / p300 to paraloge KATs som regulerer mange signalveier i kreft2,3. CBP/p300 har en godt karakterisert histone acetyltransferase (HAT) funksjon og katalysere Histone 3 Lysine 27 acetylering (H3K27ac)2,4,5,10,11, en viktig markør for aktive enhancers, promotor regioner og aktiv gentranskripsjon12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske medaktivatorer for pro-vekst signalisering veier i faste svulster ved å aktivere transkripsjon av onkogener gjennom acetylering av histoner og andretranskripsjonsfaktorer 4,9,15,16,17,18. På grunn av deres rolle i tumorprogresjon, CBP/p300 og andre KATs er under etterforskning for utvikling av nye hemmere som blokkerer deres onkogenefunksjon 4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 og GNE-049 representerer to vellykkede forsøk på å utvikle potente og spesifikke hemmere for CBP/p3004,,9. Ytterligere hemmere er under etterforskning for CBP/p300 og andre KATs.

Kvaliteten på tidligere beskrevne KAT-hemmere (KATi) blir stilt spørsmålstegn ved, med mange hemmere som viser frem måleffekter og dårlig karakterisering21. Derfor er streng karakterisering og validering av nye legemiddelkandidater avgjørende for utviklingen av kjemiske sonder av høy kvalitet. Skissert her er tre protokoller som danner en rørledning for screening og grundig validering av styrken og spesifisiteten til romanen KATi, med et spesielt fokus på å hemme HAT-funksjonen (HATi) av KATs. CBP/p300 og deres hemmere brukes som eksempler, men disse protokollene kan tilpasses for andre KATs som har en HAT-funksjon7.

Den første protokollen er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) analyse som benytter renset rekombinant p300 og histoner i en kontrollert reagensrørreaksjon. Denne analysen er enkel å utføre, er kostnadseffektiv, kan brukes til å screene forbindelser i en lav gjennomstrømmingsinnstilling, og krever ikke radioaktive materialer. I denne protokollen, rekombinant p300 katalyser lysin acetylering på histone haler i løpet av en kort inkubasjonsperiode og nivåene av histone acetylering måles ved hjelp av standard immunoblotting prosedyrer. Den enzymatiske reaksjonen kan utføres i nærvær eller fravær av CBP/p300-hemmere for å screene for forbindelser som reduserer histonesecetylering. I tillegg kan HAT-analysen brukes til å kontrollere om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved å vurdere deres aktivitet mot andre rensede KATs, for eksempel PCAF. HAT-analysen er et utmerket utgangspunkt for å undersøke nye inhibitorer på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og evnen til å bestemme styrken / selektiviteten til en inhibitor. Faktisk er denne protokollen ofte brukt i litteraturen som en in vitro skjerm5,10. Imidlertid er inhibitorer identifisert i HAT-analysen ikke alltid effektive i cellekulturen fordi en testrørreaksjon er mye enklere enn et levende cellesystem. Derfor er det viktig å ytterligere karakterisere hemmere i cellekultureksperimenter22,23.

Den andre protokollen i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI)-analysen. Denne cellebaserte analysen benytter histondeacetylasehemmere (HDACi) som et verktøy for å hyperacetylate histoner i kromatin før samtidig inkubasjon med en HATi24. Basal histone acetylering kan være lav i cellekultur, noe som gjør det vanskelig å sondere for via immunoblotting uten tilsetning av en HDACi for å øke acetylering. Formålet med ChHAI-analysen er å identifisere romanen HATi som kan dempe økningen i histone acetylering forårsaket av HDAC hemming. Fordelene med denne analysen inkluderer lave kostnader, relativ letthet å utføre, og bruk av celler i kultur, noe som gir mer fysiologisk relevans enn testrøret HAT analyse. I likhet med HAT-analysen bruker denne protokollen standard immunoblotting for datainnsamling.

HAT- og ChHAI-analysene gir data om styrken av nye forbindelser for å hemme global histone acetylering, men gir ikke innsikt i hvordan disse forbindelsene påvirker modifikasjoner på bestemte genomiske regioner. Derfor er den endelige protokollen, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment som undersøker DNA-proteininteraksjoner på bestemte områder av genomet. I ChIP-protokollen er kromatin krysskoblet for å bevare DNA-proteininteraksjoner. Kromatin ekstraheres deretter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gjennomgår selektiv immunforekomst for protein av interesse (f.eks. ved hjelp av et antistoff som er spesifikt for H3K27ac). DNA blir deretter renset og analysert ved hjelp av qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR brukes til å avgjøre om en roman HATi nedregerer histonesecetylering ved individuelle onkogener, for eksempel Cyclin D125. Mens ChIP-qPCR er en vanlig teknikk som brukes i feltet, kan det være vanskelig åoptimalisere 4,,10,,26. Denne protokollen inneholder tips for å unngå potensielle fallgruver som kan oppstå mens du utfører ChIP-qPCR-prosedyren, og inkluderer kvalitetskontrollkontroller som skal utføres på dataene.

Når de brukes sammen, tillater disse tre protokollene streng karakterisering og validering av romanen HATi. I tillegg tilbyr disse metodene mange fordeler fordi de er enkle å utføre, relativt billige og gir data om global samt regional histone acetylering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In vitro HAT-analyse

  1. Klargjøring av buffer
    MERK: Se tabell 1 for bufferoppskrifter.
    1. Forbered 5x analysebuffer og 6x natrium dodecylsulfat (SDS) og oppbevar ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots.
    2. Forbered 10x SDS gel kjører buffer og 10x TBST og lagre ved romtemperatur.
    3. Forbered 1x overføringsbuffer og oppbevar ved 4 °C.
      FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for alle kjemikalier som brukes i denne protokollen. SDS, DTT og bromofenolblå er giftige og skal ikke inn tas i bruk, inhaleres eller utsettes for hud eller øyne. Se sikkerhetsdatabladet for riktige håndteringsprosedyrer. Bruk en kjemisk røykhette til håndtering av farlige kjemikalier.
  2. HAT reaksjon
    MERK: Anakarsyre er en kjent p300-hemmer3 og brukes som et eksempel for å demonstrere hvordan HAT-analysen kan identifisere nye p300-hemmere. Se Tilleggsprotokoll (skjematisk 1) for en skjematisk av trinn 1.2.1.
    1. Forbered følgende enzymatiske reaksjon i et 0,2 ml PCR-rør: 2 μL 5x analysebuffer, 1 μL renset p300 (0,19 μg/μL), 1 μL anakarinsyre (HATi) eller DMSO-kontroll fortynnet i 1x analysebuffer og 2 μL autoklavet ddH2O. Forhåndsinkuber denne blandingen i 10 min ved romtemperatur. Tilsett deretter 3 μL av 100 μM Acetyl-CoA og 1 μL renset H3,1 (0,2 μg/μL) til reaksjonen.
    2. Inkuber hele reaksjonsblandingen ved 30 °C i 1 time i en PCR termisk cycler.
    3. Legg til 2-mercaptoethanol med et 1:10-forhold til 6x SDS-prøvebufferen.
    4. Fjern prøver fra PCR termisk cycler og tilsett 2 μL av 6x SDS (med 2-mercaptoethanol lagt) til reaksjonsblandingen.
      FORSIKTIG: 2-merkaptoetanol er giftig og bør brukes inne i en kjemisk røykhette. Se sikkerhetsdatabladet for riktig håndtering.
    5. Varmeprøver ved 95 °C i 5 min på en varmeblokk og avkjøl på is. Oppbevar prøvene ved -20 eller -80 °C eller utfør gelelektroforese og immunoblotting som beskrevet nedenfor.
  3. Gel elektroforese og immunoblotting
    MERK: Hvis det ikke er kjent med gelelektroforese og immunoblotting, se dennestandardprosedyren 27 for mer informasjon om hvordan du utfører trinn 1.3.1-1.3.17. Ytterligere informasjon finner du her28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 μL prøver (fra trinn 1.2.5.) inn i brønnene til en 4-20% gradient polyakrylamid gel. Pipette 5 μL protein stige inn i en av brønnene som en molekylær vekt referanse. Kjør gelen på 120 V i 90 min ved hjelp av en geltank.
    2. Overfør gelen til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved 100 V i 70 minutter ved hjelp av en overføringstank.
    3. Fjern membranen fra overføringsapparatet og legg den i en plastbeholder. Blokker membranen ved å tilsette 1x TBST (som inneholder 5 % melk) i beholderen og rist forsiktig i 1 time ved romtemperatur.
    4. Fjern 1x TBST fra trinn 1.3.3. Inkuber membranen over natten med utvalgte stedsspesifikke acetyls antistoffer (f.eks. H3K18ac eller H3K27ac primære antistoffer ved en 1:5000 fortynning i 1x TBST som inneholder 5 % melk) ved 4 °C med mild risting.
    5. Fjern den primære antistoffoppløsningen. Vask membranen 2x med 1x TBST (ingen melk) ved romtemperatur med mild risting i 15 min hver vask.
    6. Fortynn det sekundære antistoffet ved 1:20,000 i 1x TBST (inneholder 5% melk) og inkuber membranen i 1 time ved romtemperatur med mild risting.
    7. Fjern den sekundære antistoffløsningen. Vask membranen 2x med 1x TBST (ingen melk) ved romtemperatur med mild risting i 15 min hver vask.
    8. Tøm 1x TBST fra membranen. Bland HRP substratperoksidoppløsning og HRP-substrat luminoloppløsning i et 1:1-forhold (1 ml av hver) og pipette 2 ml av den kombinerte oppløsningen til membranoverflaten.
    9. Inkuber oppløsningen med membranen i 5 min ved romtemperatur.
    10. Tøm overflødig chemiluminescerende substrat fra membranen på et papirhåndkle og legg membranen i plastfolie inne i en røntgenkassettholder.
    11. Flytt til et mørkt rom dedikert til røntgenfilmbehandling. Utsett membranen for en røntgenfilm ved å plassere filmen på toppen av membranen og lukke kassetten i 30 s.
      MERK: Kontakttid mellom filmen og membranen må bestemmes eksperimentelt. Sterke signaler vil trenge korte eksponeringer (sekunder) og svakere signaler kan trenge lengre eksponeringer.
    12. Fjern røntgenfilmen fra kassetten og behandle filmen ved å kjøre den gjennom en røntgenfilmprosessor. Se produsentens håndbøker for spesifikke instruksjoner om hvordan du behandler røntgenfilmen.
    13. Fjern membranen fra plastfolie og vask den med ddH2O i 5 min ved romtemperatur med mild risting.
    14. Inkuber membranen med 0,2 M NaOH i 5 min ved romtemperatur med mild risting.
    15. Vask membranen med ddH2O i 5 min ved romtemperatur med mild risting.
    16. Blokker membranen ved å tilsette 1x TBST (som inneholder 5 % melk) i beholderen og rist forsiktig i 1 time ved romtemperatur.
    17. Tilsett neste primære antistofffortynning (f.eks. sonde for H3K27ac hvis det første antistoffet som ble brukt var H3K18ac) og rist over natten ved 4 °C. Gjenta trinn 1.3.4-1.3.17 til alle antistoffsonder er fullført.

2. ChHAI analyse

  1. In vitro medikamentbehandlinger og analyse av acetylaterte histoner
    MERK: A-485 er en potent og godt karakterisert p300 HATi2,4 . Denne hemmeren vil bli brukt i de resterende analysene på grunn av effekt og spesifisitet i cellekulturen. MS-275 (Entinostat)24 er en HDACi som markert øker histone acetylering nivåer og brukes til å lette enklere påvisning av acetylering sonder med standard immunoblotting. Se Tilleggsprotokoll (Skjematisk 2) for en skjematisk av stoffet fortynninger som brukes i trinn 2.1.
    1. Seed 100,000 MCF-7 celler i en 12 brønnplate og la cellene vokse til 80-90% samløpet i 1 ml cellekultur medium. Merk brønnene for følgende eksperimentelle design: brønn 1: DMSO-kontroll (referansepunkt); brønn 2: A-485 (3 μM); brønn 3: A-485 (10 μM); brønn 4: MS-275 (3 μM); brønn 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); brønn 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      MERK: For å dyrke MCF-7-celler, bruk komplette DMEM-medier og la cellene vokse ved 37 °C med 5 % CO2. Se tabell 1 for fullstendig DMEM oppskrift.
    2. Ved 24 timer etter såing, pipette 4 ml komplett DMEM media til en steril 15 ml konisk rør. Pipette 2 μL MS-275 (6 mM i DMSO) til 4 ml medium for en endelig konsentrasjon på 3 μM MS-275.
    3. Pipette 2 μL DMSO til 4 ml medium i et separat sterilt konisk rør på 15 ml.
      FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for riktig håndtering av DMSO. Noen hansketyper er ikke vurdert for håndtering av DMSO.
    4. Aspirer cellekulturmediet fra brønner 4-6 og pipette 1 ml 3 μM MS-275 i medium (trinn 2.1.2) til hver brønn. Kast ubrukt fortynnet MS-275.
    5. Aspirer cellekulturmediet fra brønner 1-3 og pipette 1 ml fortynnet DMSO (trinn 2.1.3) til hver brønn. Kast ubrukt fortynnet DMSO.
    6. Returner cellene til inkubatoren og inkuber i 4 timer for å tillate akkumulering av acetylaterte histoner i celler eksponert for MS-275 (brønner 4-6).
      MERK: MS-275 er en HDACi og vil forårsake histon hyperacetylering24. Denne 4 t pre-inkubasjon er nødvendig for å tillate MS-275 å indusere hyperacetylering før tilsetning av A-485, noe som reduserer histone acetylering2,4.
    7. Etter 4 timer inkubasjon med MS-275, forberede følgende fortynninger i separate sterile 1,5 ml rør ved pipettering: 1,0 μL DMSO til 1 ml DMEM media; 0,5 μL DMSO og 0,5 μL A-485 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier; 0,5 μL DMSO og 0,5 μL A-485 (20 mM) til 1 ml DMEM-medier; 0,5 μL DMSO og 0,5 μL MS-275 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier; 0,5 μL A-485 (6 mM) og 0,5 μL MS-275 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier; 0,5 μL A-485 (20 mM) og 0,5 μL MS-275 (6 mM) til 1 ml DMEM-medier.
    8. Aspirer cellekulturmediet fra brønner 1-6 og pipette 1 ml fortynning 1 til godt 1, fortynning 2 til godt 2, fortynning 3 til godt 3, fortynning 4 til godt 4, fortynning 5 til godt 5, og fortynning 6 til godt 6.
      MERK: En generell regel er å balansere DMSO (løsemiddel) innhold mellom eksperimentelle grupper og ikke å overstige 0,1% DMSO innhold i cellekultur for å unngå cellulær toksisitet og endringer i spredning.
    9. Returner cellene til inkubatoren og kulturen i 20 timer.
    10. Etter 20 timer, aspirere cellekulturmediet fra brønner 1-6.
    11. Vask cellene ved å pipettere 1 ml PBS til brønner 1-6. Aspirer PBS.
    12. Tilsett 100 μL 1x passiv lysisbuffer (se tabell 1) i brønner 1-6. Oppbevar cellekulturplaten (med prøver i passiv lysisbuffer) ved −80 °C over natten for frysetining og lysis av celler.
      FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for alle kjemikalier før du lager buffere. CDTA kan forårsake alvorlig øyeskade og irritasjon.
    13. Tin prøver ved romtemperatur med mild risting i 10 min. Overfør prøver for å skille 1,5 ml rør og legg umiddelbart på is.
    14. Mål proteinkonsentrasjon av hver prøve. Proteinkonsentrasjon kan bestemmes ved hjelp av flere veletablerteprotokoller 34.
    15. Likevekt proteinkonsentrasjon mellom prøver 1-6 (i like volum) ved hjelp av 1x passiv lysis buffer for å fortynne, etter behov.
    16. Legg til 2-mercaptoetanol med et 1:10-forhold til 6x SDS-prøvebuffer.
    17. Legg til 6x SDS-prøvebuffer med 2-mercaptoetanol i prøver 1-6 i en endelig konsentrasjon av 1x SDS-prøvebuffer.
    18. Varmeprøver ved 95 °C i 5 min på en varmeblokk og avkjøl på is. Prøver kan lagres ved -20 °C eller -80 °C til trinn 2.1.19.
    19. Pipette et volum som inneholder 30 μg protein for prøver 1-6 til brønnene i en 4-20% gradient polyakrylamid gel. Utfør immunoblottingsprosedyren i henhold til protokollen som er beskrevet i protokoll 1.

3. ChIP-qPCR

MERK: Protokollen nedenfor er beskrevet for hemmere av p300 som et eksempel.

  1. Klargjøring av buffer
    MERK: Se tabell 1 for bufferoppskrifter. De generelle trinnene i ChIP-protokollen (f.eks. bufferoppskrifter, vasketider og sentrifugeringstider) nedenfor er endret og tilpasset fra produsentens anbefalinger av et kommersielt tilgjengelig sett (se Materials tabell) og fralitteraturen 35,36.
    1. Klargjør ChIP-fortynningsbuffer, kjernerørhevingsbuffer, lav saltvaskbuffer, høy saltvaskbuffer, LiCl-vaskebuffer og TE-buffer. Oppbevares ved 4 °C.
    2. Klargjør SDS lysis buffer, 10x glycin buffer og ChIP elution buffer. Oppbevares ved romtemperatur.
      FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for alle kjemikalier før du lager buffere for å sikre riktig håndtering.
  2. Behandling av legemidler
    MERK: Se Tilleggsprotokoll (Skjematisk 3) for en skjematisk av legemiddelfortynningene som ble brukt i trinn 3.2.
    1. Seed MCF-7 celler i to 15 cm kultur retter og vokse celler til 90% samløpet i 12 ml av hele DMEM medium. Merk oppvasken for følgende eksperimentelle design: Dish 1: DMSO-kontroll (referansepunkt); Fat 2: A-485 (3 μM).
      MERK: For å dyrke MCF-7-celler, bruk komplette DMEM-medier og vokse ved 37 °C med 5 % CO2. Se tabell 1 for fullstendig DMEM oppskrift.
    2. I et sterilt konisk rør på 15 ml pipette 12 ml DMEM-medier og pipette 6 μL DMSO. Bland godt.
    3. I et separat sterilt konisk rør på 15 ml får pipette 12 ml DMEM-medier og pipette 6 μL A-485 (6 mM i DMSO) for å få en endelig konsentrasjon på 3 μM A-485. Bland godt.
    4. Aspirer media fra dish 1 og 2.
    5. Legg til 12 ml fortynnet DMSO i DMEM (trinn 3.2.2.) til Dish 1.
    6. Tilsett 12 ml 3 μM A-485 i DMEM (trinn 3.2.3.) i Fat 2.
    7. Returner cellekulturrettene til inkubatoren og inkuber i 24 timer.
  3. Cellefiksering
    1. Pipette 330 μL (27,5 μL per ml) på 37 % formaldehyd til hele mediet og virvle platen forsiktig for å blande.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig. Se sikkerhetsdatabladet for riktige håndteringsprosedyrer.
    2. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
    3. Pipette 2 ml 10x glycin til platen og virvle for å blande.
    4. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
    5. Etter inkubasjon, legg retter på is og tin en aliquot proteasehemmercocktail.
    6. Klargjør følgende løsninger for både DMSO- og A-485-eksemplene ved hjelp av bufferne som er klargjort i trinn 3.1.
      1. 2 ml PBS med en 1:1000 fortynning av proteasehemmeren cocktail
      2. 1 ml kjerne hevelse buffer med en 1:1,000 fortynning av protease hemmer cocktail
      3. 0,5 ml SDS lysisbuffer med en 1:1000 fortynning av proteasehemmeren cocktail
    7. Aspirer mediet fra cellekulturen retter og vask cellene to ganger med 15 ml kald PBS.
    8. Pipette 2 ml PBS med proteasehemmercocktailen (trinn 3.3.6.1) til cellekulturrettene. Løft cellene til løsning ved hjelp av en celleskraper.
    9. Overfør cellefjæringen til et mikrocentrifugerør. Samle gjenværende celler med ekstra PBS om nødvendig.
    10. Spin rør ved 800 x g ved 4 °C i 5 min for å pellet cellene.
    11. Aspirer den overnaturante og pipette 1 ml kjernehevelsesbuffer med proteasehemmercocktailen (trinn 3.3.6.2) til pelleten. Resuspend pellet og inkubere på is i 10 min.
    12. Sentrifuger rørene ved 2700 x g ved 4 °C i 5 min til pelletkjerner.
    13. Aspirer den overnaturante og pipette 0,5 ml SDS lysis buffer med proteasehemmeren cocktail (trinn 3.3.6.3) til pellet. Resuspend pellet og inkubere på is i 10 min.
    14. Oppbevar kromatinprøvene ved -80 °C til trinn 3.4.1 eller fortsett umiddelbart til trinn 3.4.
  4. DNA-sonikering
    1. Overfør 130 μL kromatin fra DMSO-prøven (trinn 3.3.14) til to DNA-sonikeringsrør ved hjelp av en pipette (130 μL hver).
    2. Overfør 130 μL kromatin fra A-485-prøven (trinn 3.3.14) til to DNA-sonikeringsrør ved hjelp av en pipette (130 μL hver).
    3. Sonicate DNA til omtrent 150-200 base pair fragmenter ved hjelp av følgende sonicator innstillinger: Peak Incident Power (W) av 175, Duty Factor på 10%, 200 sykluser per Burst og 430 s behandlingstid.
      MERK: Sonication-innstillingene kan variere mellom modeller, og innstillingene må kanskje justeres for å oppnå riktig fragmentstørrelse for ulike cellelinjer.
    4. Hold prøver på is etter sonikering.
    5. Overfør det sonikerte kromatinet til et 1,5 ml rør ved hjelp av en pipette og sentrifuge ved 10 000 x g ved 4 °C i 10 min til pelletavfall.
    6. Pipette supernatanten (inneholder sonikert kromatin) til et nytt rør og kast ruskene. Sonicated kromatin kan oppbevares ved -80 °C.
  5. Kromatin immunforebutning (ChIP)
    MERK: Se Tilleggsprotokoll (skjematisk 3) for en skjematisk av IP-gruppene i trinn 3.5.
    1. Mål proteininnholdet i det sonikerte kromatinet for DMSO- og A-485-prøvene fra trinn 3.4.6. Proteininnhold kan måles ved hjelp av veletablerteprotokoller 34.
      MERK: For enkelhets skyld vil denne protokollen anta at proteininnholdet er likt og 100 μL sonikert kromatin vil bli brukt. Ellers må proteininnholdet like mellom alle prøvene i like volum.
    2. Pipette 100 μL DMSO sonikert kromatin til to 1,5 ml rør (100 μL hver). Pipette 400 μL chip fortynningsbuffer (som inneholder en 1:1000 fortynning av proteasehemmeren cocktail) til hvert rør for å bringe totalt volum opp til 500 μL. Fjern 5 μL av oppløsningen fra et av rørene og oppbevar ved -20 °C som DMSO-inngang.
    3. Pipette 100 μL A-485 sonikert kromatin til to 1,5 ml rør (100 μL hver). Pipette 400 μL chip fortynningsbuffer (som inneholder en 1:1000 fortynning av proteasehemmeren cocktail) til hvert rør for å bringe totalt volum opp til 500 μL. Fjern 5 μL av oppløsningen fra et av rørene og oppbevar ved -20 °C som A-485 Inngang.
    4. Ved hjelp av en pipette, tilsett immunforegnelse (IP) antistoff (f.eks. ikke-spesifikk IgG-kontroll eller H3K27ac spesifikt antistoff) til tilsvarende rør for DMSO og A-485 prøver: IP #1 DMSO kromatin med IgG antistoff (5-10 μg); IP #2 DMSO kromatin med H3K27ac antistoff (5-10 μg); IP #3 A-485 kromatin med IgG antistoff (5-10 μg); IP #4 A-485 kromatin med H3K27ac antistoff (5-10 μg).
    5. Tilsett 20 μL protein A magnetiske perler til hvert rør. Pass på at perlene er godt resuspended.
    6. Roter prøvene over natten ved 4 °C.
    7. Pellet proteinet En magnetiske perler ved hjelp av en magnetisk separator og fjern det overnaturlige. Ikke forstyrr perlene.
    8. Vask perlene med 500 μL til 1 ml av den lave saltvaskbufferen og roter i 5 min ved 4 °C. Utfør en rask spinn ned, pellet perlene ved hjelp av en magnetisk separator, og fjern supernatant.
    9. Vask perlene med 500 μL til 1 ml av den høye saltvaskbufferen og roter i 5 min ved 4 °C. Utfør en rask spinn ned, pellet perlene ved hjelp av en magnetisk separator, og fjern supernatant.
    10. Vask perlene med 500 μL til 1 ml av LiCl vaskebufferen og roter i 5 min ved 4 °C. Utfør en rask spinn ned, pellet perlene ved hjelp av en magnetisk separator, og fjern supernatant.
    11. Vask perlene med 500 μL til 1 ml TE-buffer og roter i 5 min ved 4 °C. Utfør en rask spinne ned. Hold perlene i TE-bufferen til trinn 3.5.14.
    12. Fjern Inndataprøver (fra trinn 3.5.2 og 3.5.3) fra fryseren og hold på isen.
    13. Tin en aliquot av Proteinase K.
    14. Pellet perlene ved hjelp av en magnetisk separator og fjern TE-bufferen fra perlene (fra trinn 3.5.11).
    15. Tilsett 100 μL ChIP elution buffer + 1 μL proteinase K til hver prøve, inkludert input prøver. Inkuber prøver med risting ved 62 °C i 2 timer ved hjelp av termocycler.
    16. Etter 2 timer varmer du prøvene til 95 °C i 10 min med termocycler.
    17. Avkjøl prøvene til romtemperatur.
    18. Pellet magnetiske perler ved hjelp av en magnetisk separator og overføre supernatant (inneholder DNA av interesse) til en ny 1,5 ml rør.
    19. Rens DNA ved hjelp av et standard PCR-oppryddingssett.
    20. Det rensede DNA-et kan oppbevares ved -20 °C og kan brukes som maler i standard qPCR-protokoller. Følg produsentens protokoller for å kjøre qPCR.
  6. ChIP-qPCR-dataanalyse
    MERK: To vanlige metoder for å analysere ChIP-qPCR-resultater er foldberikelse over IgG-antistoffet og 1% Input-metoden. En utmerket mal for begge analysemetoder er levert av en kommersiell kilde kan brukes til raskt å beregne fold berikelse for hver IP antistoff / mål av interesse37.
    1. For å beregne fold berikelse og % Input, kopier og lim inn ΔCt-verdiene fra qPCR-dataene som er oppnådd for hvert antistoff (ikke-spesifikk IgG, IP H3K27ac-antistoffet og 1% Input) i det tilsvarende området i analysemalen, og Fold Enrichment and Yield % Input vil automatisk fylles ut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro histone acetyltransferase (HAT)-analysen kan brukes til å sondere for forbindelser som hemmer p300 HAT-aktivitet mot et histoneunderstrat. Figur 1A gir en eksperimentell skjematisk for HAT-analysen. Anacardinsyre, en kjent HATi3,38, ble brukt i denne analysen i et konsentrasjonsområde fra 12,5-100 μM. Ved 100 μM nedregregerer anakarinsyre p300 histone acetylering ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrollen DMSO behandling (Figur 1B, lane 5 versus kjørefelt 1). Et konsentrasjonsområde ble benyttet i denne analysen fordi lavere legemiddeldoser kanskje ikke i stor grad hemmer p300 HAT-aktivitet (figur 1B, kjørefelt 2-4 versus kjørefelt 1). I Lane 6 ble ingen Acetyl-CoA lagt til reaksjonen og fungerer som en negativ kontroll for p300 katalyse og for basale nivåer av histone acetylering på rekombinant H3.1 (figur 1B). proteinnivåene p300 og H3.1 ble brukt som lastekontroller (figur 1B). Disse immunoblot resultatene ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ39 (Figur 1C). Fold endringer ble beregnet ved å sammenligne båndintensiteten av hver prøve med båndintensiteten av DMSO-kontrollen for hver acetylering sonde. Kvantifisering for anakarinsyre ved 100 μM viser potent reduksjon i H3K18ac og H3K9ac versus DMSO-kontrollen, noe som bekrefter de visuelle resultatene i figur 1B.

I Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI)-analysen brukes HDACi som et verktøy for å hyperacetylere histoner i kromatin før samtidig inkubasjon med en HATi24, for eksempel p300-hemmer A-4852,4. Formålet med denne analysen er å bestemme effekten av HATi for å dempe histonhyperacetylering indusert av HDACi. Figur 2A gir en eksperimentell skjematisk for ChHAI-analysen. I denne analysen, behandling av MCF-7 celler med HDACi MS-275 sterkt upregulert acetylering på Histone 3, på flere lysin rester (Figur 2B, lane 4 versus lane 1). Basalnivåene av H3K18ac og H3K27ac var lave, og viste fordelene ved å legge til en HDACi i ChHAI-analysen (figur 2B, baner 1-3). Tillegg av A-485 med MS-275 demper økt histone acetylering på H3K18 og H3K27, men ikke H3K9 (Figur 2B, baner 4-6). Viktigere, H3K9ac er ikke regulert av p300 i cellekultur2, som viser spesifisiteten til A-485 i dette eksperimentet. Disse immunoblot resultatene ble kvantifisert i figur 2C. Fold endringer ble beregnet ved å sammenligne bandet intensiteten av hver prøve med bandet intensiteten av MS-275 alene (Lane 4) for hver acetylering sonde. Kjørefelt 1-3 ble ikke kvantifisert fordi H3K18ac og H3K27ac basalnivåer ikke ble oppdaget.

Kromatin Immunoprecipitation-kvantitativ polymerase kjedereaksjon (ChIP-qPCR) er et cellekultureksperiment som undersøker DNA-proteininteraksjoner i bestemte områder av genomet. Den kan brukes til å undersøke effekten av HATi på genregulatoriske elementer som kontrollerer onkogenuttrykk25. Figur 3A gir en eksperimentell skjematisk for ChIP-qPCR-protokollen. MCF-7-celler behandlet med 3 μM A-485 i 24 timer ble utsatt for ChIP-qPCR gjennom immunforefall av histone-DNA-komplekser beriket i H3K27ac (figur 3). Det rensede DNA-et ble analysert for Cyclin D1-promotorsekvensen. ChIP-qPCR primere er utformet mot en bestemt DNA-sekvens i genomet og brukes til å oppdage den relative mengden utfelling av utfellings-DNA. Mengden utfelt DNA gjenspeiler overfloden av proteinet av interesse i den genomiske regionen som er under etterforskning. Faktisk, i DMSO-prøven, produserer DNA-et som er utløst av IgG-kontrollantistoffet en høyere Ct-verdi enn H3K27ac-antistoffet i qPCR-reaksjonen for Cyclin D1-promotoren (figur 3B). Dette indikerer at den ikke-spesifikke IgG-kontrollen utløste mindre DNA-proteinkomplekser enn H3K27ac-spesifikt antistoff ved Cyclin D1-promotoren. Dette betyr en 632.73 ganger berikelse av H3K27ac over den ikke-spesifikke IgG-kontrollen (figur 3B).

Denne fold berikelse gir bevis for at H3K27ac spesifikke antistoff vellykket immunprecipitated acetylated histoner og at H3K27ac er beriket på Cyclin D1 promotor. Etter validering av kvaliteten på H3K27ac antistoff, kan en sammenligning gjøres mellom DMSO og A-485 behandlede grupper. Som vist i figur 3Creduserer A-485 H3K27ac-berikelsen ved Cyclin D1-promotoren kontra DMSO-kontrollen ved hjelp av %Input-metoden (representativt resultat av n=2). Viktigere, A-485 er kjent for å redusere H3K27ac betydelig i cellekultur2,4.

ChIP-qPCR raw %Inndataverdier kan være svært variabel mellom uavhengige biologiske repliker, til tross for at den eksperimentelle trenden er reproduserbar. Derfor kan det være nyttig å presentere dataene som en normalisert prosentandel av DMSO-kontrollen for å vise reproduserbart forhold mellom kontroll og narkotikabehandling10. For eksempel, i figur 3D,A-485 betydelig nedreguleringer H3K27ac belegg på Cyclin D1 promotor (n = 2). Statistisk analyse var basert på studentens t-test (*P < 0,05).

Figure 1
Figur 1: Anakarinsyre hemmer p300 enzymatisk aktivitet i en HAT-analyse. (A)Et skjematisk diagram av HAT-analysen, som viser den enzymatiske reaksjonen. (B)Anacardinsyre hemmet kraftig p300 enzymatisk aktivitet og nedregulert histone acetylering ved H3K18 og H3K9 ved 100 μM (kjørefelt 5) versus DMSO kontrollbehandling (kjørefelt 1). Lane 6 mangler Acetyl-CoA i reaksjonen og fungerte som en negativ kontroll for histone acetylering. (C) Immunoblot-resultatene i (B) ble kvantifisert. Fold endringer ble beregnet ved å sammenligne båndintensiteten av hver prøve med båndintensiteten av DMSO-kontrollen for hver acetylering sonde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: p300-hemmer A-485 demper kraftig histonhyperacetylering i ChHAI-analysen. (A) Et skjematisk diagram over ChHAI-analysen. (B)I MCF-7-celler, HDAC-hemmer MS-275 kraftig oppregulert histone acetylering ved H3K18, K27 og K9 (lane 4) versus DMSO kontroll (lane 1). Tillegg av A-485, en kjent p300 HAT-hemmer, med MS-275 dempet økningen i histone acetylering ved H3K18 og K27, men ikke H3K9 (baner 5-6 versus kjørefelt 4). (C) Immunoblot-resultatene i (B) ble kvantifisert. Fold endringer ble beregnet ved å sammenligne bandet intensiteten av hver prøve med bandet intensiteten av MS-275 alene (Lane 4) for hver acetylering sonde. Kjørefelt 1-3 ble ikke kvantifisert fordi H3K18ac og H3K27ac basalnivåer ikke ble oppdaget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: p300-hemmer A-485 reduserer H3K27ac-nivåene ved Cyclin D1-promotoren målt ved ChIP-qPCR. (A) Et skjematisk diagram av ChIP-qPCR-protokollen. (B)Representative qPCR Ct verdier for Cyclin D1 arrangør for IgG og H3K27ac immunoprecipitations. IgG-kontrollen hadde en høyere Ct-verdi, noe som indikerer at H3K27ac-antistoffet ble beriket for H3K27ac over det ikke-spesifikke IgG-antistoffet. (C) A-485 (3 μM) behandling for 24 h nedregulert H3K27ac ved Cyclin D1-arrangøren i forhold til DMSO-kontrollbehandlingen i MCF-7-celler (representativt resultat av n= 2). (D)%Input fra to uavhengige ChIP-eksperimenter ble normalisert til DMSO-kontrollen som en prosentandel av DMSO-kontrollen. Behandling med A-485 i MCF-7 celler betydelig nedregulering H3K27ac belegg på Cyclin D1 promotor. Statistisk analyse var basert på studentens t-test (*P < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Buffer Oppskrift
10X Glycine buffer 18,74 g g glycin med PBS til oppløst og tilsett PBS til 200 ml.
10X kjører buffer 250 mM Tris, 1,9 M glycin, 1% SDS
Oppløs 30,0 g Tris-base, 144,0 g g glycin og 10,0 g SDS i 1000 ml H2O. Bufferens pH skal være 8,3 og ingen pH-justering er nødvendig. Oppbevar løpebufferen ved romtemperatur og fortynnes til 1X før bruk.
10X TBST 2,42 g Tris-base, 8 g NaCl, 2 ml 50 % Tween 20, tilsett ddH2O til 1 liter
1X TBST med 5 % melk 5g pulverisert melk per ca. 100 ml 1X TBST
5X analysebuffer: 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100
5X Passiv lysisbuffer lage en vandig lager som inneholder 125 mM Tris, pH 7,8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg / ml BSA, 5% (vol / vol) Triton X-100 og 50% (vol / vol) glyserol i ddH2O.
6X natrium dodecylsulfat (SDS) 0,375 M Tris pH 6,8, 6 ml glyserol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 mg bromofenolblå, tilsett vann til 10 ml.
ChIP fortynning buffer 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl
ChIP Elution-buffer 1 % SDS (w/v) og 0,1 M NaHCO3 i autoklavet ddH2O
Komplett DMEM for MCF-7 celler: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% storfe kalv serum (BCS), penicillin (10 enheter / ml), og streptomycin (10 mg / ml)
Høy saltvaskbuffer 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl.
LiCl vaskebuffer 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
Lav saltvaskbuffer 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl.
Kjerner hevelse buffer 5 mM RØR pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40
SDS lysis buffer 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,0
TE-buffer 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA.
Overføring buffer 25 mM Tris, 190 mM glycin, 20% metanol og kontroller pH og juster til pH 8.3 om nødvendig.

Tabell 1: Oppskrifter av buffere og løsning som brukes.

Supplerende filer: Supplerende eksperimentelle skjemaer for protokoller 1-3. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylat flere lysin rester på histone haler og transkripsjon faktorer for å regulere gentranskripsjon2,3. Arbeid i de siste to tiårene har avslørt at KATs, som CBP/p300, PCAF og GCN5, samhandler med onkogene transkripsjonsfaktorer og bidrar til å drive tumorvekst i flere solide tumortyper4,,5,,9,,15,,16,,17,,18. På grunn av deres nye rolle i å fremme tumorvekst, blir KATs undersøkt som nye mål i kreftbehandling. Novel KAT-hemmere (KATi) må testes nøye og grundig for styrke, selektivitet og sikkerhet før de flyttes til bruk i klinikken. Nyere bevis har vist at tidligere beskrevet KATi forbindelser viser av måleffekter og var dårlig preget før de ble mye brukt i den vitenskapelige litteraturen som kjemiske sonder21. Derfor er strenge metoder nødvendig for KATi karakterisering. Beskrevet her er tre protokoller som kan brukes sammen for å karakterisere og validere nye hemmere rettet mot histone acetyltransferase (HAT) funksjonen til KATs: en in vitro HAT analyse, ChHAI analyse, og ChIP-qPCR. Disse protokollene bruker CBP/p300 og deres hemmere som eksempler, men disse metodene kan enkelt tilpasses for fremtidig anvendelse i å undersøke andre KATs.

HAT-analysen er enkel og en kostnadseffektiv måte å screene forbindelser for styrke i å hemme HAT-funksjonen i et testrør. Rensede HATs (enten rekombinant4,,10 eller immunprecipitated40) kan testes i denne analysen, men rekombinant CBP/p300 brukes som et eksempel i denne protokollen. CBP/p300 har et enzymatisk HAT-domene som overfører en acetylggruppe fra Acetyl-CoA til en lysinrester på et målsubstrat3. De mest karakteriserte CBP/p300 histone målene er Histone 3 Lysine 18 og 27 (H3K18 og H3K27,henholdsvis) 2,3,10,11. I HAT-analysen inkuberes det rensede P300 HAT-domenet med Acetyl-CoA og Histone 3.1 som substrat. I inkubasjonsperioden vil p300 katalysere acetylering på flere H3.1-rester, inkludert H3K18 og H3K27. Den relative overflod av acetylering på disse rester kan måles via immunoblotting. Denne reagensrørreaksjonen kan brukes til å screene for nye forbindelser som binder seg til p300 og hemmer hataktiviteten (HATi). For eksempel, anakarsyre, en kjent HATi38, kraftig nedregerer histone acetylering på både H3K18 og H3K9 i forhold til DMSO kontroll (Figur 1B, lane 5 versus kjørefelt 1). Det er kritisk viktig å legge Acetyl-CoA til eksperimentelle reaksjoner (Figur 1B, Lanes 1-5) eller p300 katalyse av histone acetylering vil ikke forekomme (Figur 1B, Lane 6). Fraværet av Acetyl-CoA kan også brukes som en negativ kontroll for p300 katalyse og for basale nivåer av histone acetylering på rekombinant H3.1.

Når du utfører HAT-analysen, er det viktig å sikre at hver reaksjon får samme mengde p300, H3.1 og Acetyl-CoA. H3.1 og p300 nivåer i immunoblot tjene som lastekontroller for gel. For denne analysen kan stedsspesifikke histone acetylantistoffer eller et pan-acetylantistoff brukes til immunoblotting. Når du optimaliserer for å forbedre immunoblotkvaliteten, er det avgjørende å bruke validerte antistoffer for immunoblotting og å først følge produsentens anbefalinger for antistofffortynning. Antistofffortynningene som brukes i protokolldelen er til referanse, og fortynningene kan endres basert på resultatene av de første eksperimentene (f.eks. hvis signalet er for sterkt, kan antistoffet fortynnes ytterligere). På grunn av sin enkelhet er HAT-analysen et utmerket starteksperiment for screening av nye hemmere. HAT-analysen har imidlertid ulemper. En stor bekymring med HAT-analysen er at forbindelser som er effektive i et testrør kan være ineffektive i et levende system. Dette er et problem fordi sammensatt effekt i cellekultur kan endres av cellulære permeabilitet problemer, cellulær metabolisme, og sammensatt stabilitet. I tillegg har KATs, spesielt CBP/p300, mange protein-proteininteraksjoner som regulerer deres KAT-aktivitet i cellekultur3,,41,,42. Derfor er det viktig å ytterligere karakterisere hemmere identifisert i HAT-analysen i cellekultureksperimenter20,23.

Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI)-analysen er den andre protokollen i rørledningen og er nyttig for å validere effekten av nye hemmere i cellekulturen. Denne analysen benytter HDAC-hemmere (HDACi)24 for å indusere histonhyperacetylering i celler fordi basal acetylering kan være for lav til å oppdage på en immunoblot. De første cellelinjene er forhåndsinkubert med en HDACi for å tillate akkumulering av acetylatert kromatin før tilsetning av en HATi. Etter samtidig inkubasjon av HDACi og HATi, blir cellene lysed og utsatt for standard immunoblotting prosedyrer for bestemte histone acetylering nettsteder. Formålet med denne analysen er å bestemme effekten av romanen HATi for å dempe histonhyperacetylering indusert av HDACi. Celler eksponert for HDACi bør ha betydelig høyere nivåer av histone acetylering enn celler eksponert for DMSO løsemiddel (Figur 2B, kjørefelt 4 versus kjørefelt 1). Tillegg av HATi sammen med HDACi forventes å redusere immunoblot signalet i forhold til HDACi behandling alene (Figur 2B, baner 5-6 versus kjørefelt 4). Basal nivåer av histone acetylering (Figur 2B, Lanes 1-3) er vanskelig å oppdage og fremhever viktigheten av å legge til en HDACi i denne protokollen. MS-275 (Entinostat) brukes som et eksempel, men andre HDACi kan brukes24,,43. MS-275 har variable rapporterte hemmende konsentrasjoner versus klasse I HDAC Og generelt hemmer HDAC1 og HDAC3 med nanomolar til lave mikromolarkonsentrasjoner,henholdsvis 43,,44. Et bredt spekter av MS-275 konsentrasjoner brukes ilitteraturen 45,,46,,47,men en 3 μM behandling gir en robust og reproduserbar økning i histone acetylering i MCF-7 celler. Derfor kan det være nyttig å utføre en innledende skjerm med et bredt spekter av HDACi- og HATi-konsentrasjoner for å bestemme den optimale konsentrasjonen for ChHAI-analysen når du bruker en annen cellelinje.

I likhet med HAT-analysen kan det hende at immunoblotprotokollen må optimaliseres for å oppnå kvalitetsresultater ved bruk av passende antistoffer, optimale antistofffortynninger og nøye kontrollert prøvelasting. Nøye kontrollert prøvelasting er avgjørende for å lykkes med denne protokollen og kan oppnås gjennom å likevekte proteininnholdet i alle prøver og gjennom pipettering likt volum av prøver i brønnene i immunoblot gel. Et pan-acetyl antistoff kan brukes til sondering i denne protokollen. Det bør imidlertid suppleres med stedsspesifikke acetyler antistoffer fordi KATs har spesifisitet for visse histone lysin rester og HATi påvirker ikke alle histone acetylering nettsteder i cellekultur1,2,4,5,10,11. Hemmere som er potente til å redusere histone acetylering i både HAT og ChHAI-analysene er sterke kandidater for videre evaluering. Viktigere, HAT og ChHAI analysene har begrensningen av bare å gi data om globale endringer i histone acetylering. Denne begrensningen skaper behovet for å karakterisere effekten av romanen HATi på bestemte områder av genomet.

Kromatin Immunoprecipitation-kvantitativ polymerase kjedereaksjon (ChIP-qPCR) er den endelige protokollen i rørledningen og evaluerer DNA-protein interaksjoner på bestemte områder av genomet. I denne analysen renses genomiske regioner beriket i H3K27ac gjennom immunoprecipitation (IP) og analyseres ved hjelp av DNA-primere i qPCR. Denne teknikken gir mekanistisk innsikt i hvordan HATi påvirker histone modifikasjoner på genarrangører og enhancers. ChIP-qPCR er en robust teknikk og er mindre kostbar enn hel-genom sekvensering (f.eks ChIP-seq), men det kan være vanskelig å optimalisere på grunn av mange trinn som påvirker utfallet. Det vanskeligste trinnet for å optimalisere riktig er trinn 3.5, immunforebukk. Dette trinnet er vanskelig å optimalisere fordi hvis det rensede DNA i trinn 3.5.20 er svært fortynnet, kan det føre til dårlige resultater i qPCR-reaksjonen (f.eks. ingen forsterkning av målgensekvensen og svært høye ΔCt-verdier). Suksessen til IP-trinnet er avhengig av flere faktorer, for eksempel overflod av proteinmålet av interesse og kvaliteten på IP-antistoffet. Det er avgjørende å validere kvaliteten på IP H3K27ac-antistoffet kontra IgG-kontrollen for å bekrefte suksessen til IP-trinnet. I figur 3B viserfor eksempel H3K27ac-spesifikt antistoff 632,73 ganger berikelse over den ikke-spesifikke IgG-kontrollen. Dette indikerer at H3K27ac antistoffet er av høy kvalitet og at H3K27ac er beriket ved Cyclin D1-promotoren. Etter validering av IP-antistoffet kan en sammenligning gjøres mellom DMSO og A-485 behandlede grupper. Som vist i figur 3Creduserer A-485 H3K27ac-berikelsen ved Cyclin D1-promotoren kontra DMSO-kontrollen ved hjelp av %Input-metoden (representativt resultat av n=2). Hvis IP-antistoffet viser seg å være lav kvalitet og ikke viser fold berikelse i innledende eksperimenter, kan du prøve å øke celletallene i trinn 3.2.1. Høyere celletall kan bidra til å kompensere for dårlig antistoffkvalitet ved å øke det totale proteininnholdet i lysatet og vil tillate mer protein som skal legges til IP-reaksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter eller avsløringer å gjøre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra James og Esther King Biomedical Research Program (6JK03 og 20K07), og Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 og 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation og UF Health Cancer Center. I tillegg vil vi takke Dr. Zachary Osking og Dr. Andrea Lin for deres støtte under publiseringsprosessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

Kreftforskning utgave 162 lysinacetyltransferaser KATs CBP/p300 histone acetyltransferasehemmere screeningmetoder histoneseedylering epigenetikk kreft genregulering
Analyser for validering av histone acetyltransferasehemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter