Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

Ингибиторы ацетилтрансферазы гистона (АТ, также известный как лизин ацетилтрансферазы), такие как CBP/p300, являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения рака. Однако необходимы строгие методы проверки этих ингибиторов. Три метода in vitro для проверки включают анализы HAT с рекомбинантными ацетилтрансферазами, иммуноблоттинг для ацетилирования гистона в клеточной культуре и ChIP-qPCR.

Abstract

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина на гистонах и других белках для регулирования динамики хроматина и экспрессии генов. KATs, такие как CBP/p300, находятся под интенсивным исследованием в качестве терапевтических целей из-за их критической роли в tumorigenesis различных видов рака. Разработка новых малых молекул ингибиторы ориентации гистона ацетилтрансферазы (HAT) функция KATs является сложной задачей и требует надежных анализов, которые могут проверить специфику и потенцию потенциальных ингибиторов.

В этой статье излагается конвейер из трех методов, которые обеспечивают строгую проверку in vitro для новых ингибиторов HAT (HATi). Эти методы включают в себя пробирку HAT анализ, хроматин гиперацетилирования Ингибирование (ChHAI) анализ, и хроматин иммунопреципиентно-количественный ПЦР (ChIP-qPCR). В HAT анализ, рекомбинантные HATs инкубируются с гистонами в реакции пробирки, что позволяет ацетилирования конкретных остатков лизина на хвостах гистона. Эта реакция может быть заблокирована HATi и относительные уровни сайта конкретных ацетилирования гистон может быть измерена с помощью иммуноблоттинга. Ингибиторы, выявленные в анализе HAT, должны быть подтверждены в клеточной среде.

ChHAI анализ использует иммуноблоттинг для экрана для романа HATi, которые занижают надежные гиперацетилирования гистонов индуцированных ингибитором диацетилазы гистона (HDACi). Добавление HDACi полезно, потому что базальные уровни ацетилирования гистон может быть трудно обнаружить с помощью иммуноблоттинга.

Анализы HAT и ChHAI измеряют глобальные изменения в ацетилляции гистона, но не предоставляют информацию об ацетиляции в конкретных геномных регионах. Таким образом, ChIP-qPCR используется для исследования влияния HATi на уровни ацетилирования гистона в генных регуляторных элементах. Это достигается путем селективной иммунопреципиентации гистон-ДНК комплексов и анализа очищенной ДНК с помощью qPCR. Вместе эти три анализа позволяют тщательно продумать специфику, потенцию и механизм действия романа HATi.

Introduction

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина как на гистоне, так и на неистоновыхбелках 1,,2,,3,,4. Недавние исследования показывают, что KATs и их функции ацетилтрансферазы может способствоватьтвердому росту опухоли 4,,5,,6,,7,,8,,9. Например, CREB-связывающий белок (CBP)/p300 являются двумя паралогичными КАТ, которые регулируют многочисленные сигнальныепути при раке 2,,3. CBP/p300 имеют хорошо охарактеризованные гистон ацетилтрансферазы (HAT) функции и катализ Гистон 3 Лизин 27 ацетилляции (H3K27ac)2,4,5,10,11, важным маркером для активных усилителей, промоутер регионов и активной транскрипции генов12,13,14. CBP/p300 служить в качестве критических соактиваторов для про-рост сигнализации путей в твердых опухолей путем активации транскрипции онкогенов через ацетилирование гистонов и других факторов транскрипции4,9,15,16,17,18. В связи с их ролью в прогрессировании опухоли, CBP/p300 и другие KATs находятся под следствием для разработки новых ингибиторов, которые блокируют их онкогенную функцию4,,5,,6,,7,,8,,9,,18,,19,,20. A-485 и GNE-049 представляют собой две успешные попытки разработать мощные и специфические ингибиторы для CBP/p3004,9. В настоящее время проводятся дополнительные исследования в отношении CBP/p300 и других KATs.

Качество ранее описанных ингибиторов KAT (KATi) в настоящее время под вопросом, со многими ингибиторами демонстрируя целевые эффекты и плохой характеристикой21. Поэтому строгая характеристика и проверка новых кандидатов на наркотики имеет важное значение для разработки высококачественных химических зондов. Здесь изложены три протокола, которые образуют конвейер для скрининга и тщательной проверки потенции и специфичности новых KATi, с конкретным акцентом на ингибирование функции HAT (HATi) KATs. CBP/p300 и их ингибиторы используются в качестве примеров, но эти протоколы могут быть адаптированы для других KATs, которые имеют функцию HAT7.

Первый протокол является in vitro гистон ацетилтрансферазы (HAT) анализ, который использует очищенные рекомбинантные p300 и гистоны в контролируемой реакции пробирки. Этот анализ прост в работе, является экономически эффективным, может быть использован для проверки соединений в условиях низкой пропускной способности, и не требует радиоактивных материалов. В этом протоколе рекомбинантный p300 катализин ацетилирования лизина на хвостах гистона в течение короткого инкубационный период и уровни ацетилирования гистона измеряются с помощью стандартных иммуноблоттинговых процедур. Ферментативная реакция может быть выполнена при наличии или отсутствии ингибиторов CBP/p300 для проверки на наличие соединений, которые уменьшают ацетилирование гистона. Кроме того, анализ HAT может быть использован для проверки того, являются ли новые соединения селективными для CBP/p300, оценивая их активность по отношению к другим очищенным KATs, таким как PCAF. Анализ HAT является отличной отправной точкой для изучения новых ингибиторов из-за его простоты, низкой стоимости и способности определять потенцию/селективность ингибитора. Действительно, этот протокол часто используется в литературе в качестве экрана in vitro5,10. Тем не менее, ингибиторы, выявленные в анализе HAT, не всегда эффективны в клеточной культуре, потому что реакция пробирки намного проще, чем живая клеточная система. Поэтому необходимо дополнительно охарактеризовать ингибиторы в экспериментах клеточной культуры22,,23.

Вторым протоколом в трубопроводе является анализ ингибирования гиперацетилирования хроматина (CHHAI). Эта клетка на основе анализа использует ингибиторы диацетилазы гистона (HDACi) в качестве инструмента для гиперацетилата гистонов в хроматине до совместного инкубации с HATi24. Базальный гистон ацетилляции может быть низким в клеточной культуре, что делает его трудно зондировать с помощью иммуноблотинга без добавления HDACi для увеличения ацетилирования. Цель анализа ChHAI заключается в выявлении новых HATi, которые могут затухать увеличение ацетилирования гистон, вызванного ингибированием HDAC. Преимущества этого анализа включают его низкую стоимость, относительную легкость для выполнения, и использование клеток в культуре, которая обеспечивает более физиологическую актуальность, чем пробирка HAT анализа. Как и в hat-анализе, в этом протоколе используется стандартный иммуноблоттинг для сбора данных.

Анализы HAT и ChHAI предоставляют данные о потенции новых соединений для ингибирования глобального ацетилирования гистонов, но не дают представления о том, как эти соединения влияют на модификации в конкретных геномных регионах. Таким образом, окончательный протокол, Хроматин иммунопреципиентации количественных полимеразной цепной реакции (ChIP-qPCR) является экспериментом клеточной культуры, который исследует ДНК-белковых взаимодействий в конкретных регионах генома. В протоколе ChIP хроматин пересекается для сохранения ДНК-белковых взаимодействий. Хроматин затем извлекается из клеток, а ДНК-белковый комплекс подвергается селективной иммунопреципитации для белка интереса (например, с использованием антитела, специфичного для H3K27ac). Затем ДНК очищается и анализируется с помощью qPCR. Например, ChIP-qPCR может быть использован для определения того, если роман HATi downregulates гистон ацетилирования на отдельных онкогенов, таких как килин D125. Хотя ChIP-qPCR является общей техникой, используемой в полевых условиях, это можетбыть трудно оптимизировать 4,,10,,26. Этот протокол содержит советы по предотвращению потенциальных ловушек, которые могут возникнуть при выполнении процедуры ChIP-qPCR, и включает проверку качества, которая должна быть выполнена на данных.

При использовании вместе эти три протокола позволяют тщательной характеристики и проверки романа HATi. Кроме того, эти методы предлагают много преимуществ, поскольку они просты в работе, относительно дешевы и предоставляют данные о глобальной, а также региональной ацетилирования гистон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Анализ IN vitro HAT

  1. Буферная подготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для буферных рецептов.
    1. Подготовь 5x анализ буфера и 6x додекил сульфат натрия (SDS) и хранить при -20 градусов по Цельсию. Aliquot SDS в 1 mL aliquots.
    2. Подготовка 10x SDS гель работает буфер и 10x TBST и хранить при комнатной температуре.
    3. Подготовьтесь к 1x буферу передачи и храните при 4 градусах Цельсия.
      ВНИМАНИЕ: Проверьте лист данных о безопасности для всех химических веществ, используемых в этом протоколе. SDS, DTT, и бромофено-голубой являются токсичными и не должны быть проглатываемы, вдыхаются, или подвергаются воздействию кожи или глаз. Пожалуйста, посмотрите лист данных безопасности для надлежащих процедур обработки. Пожалуйста, используйте химический дым капот для обработки опасных химических веществ.
  2. Реакция HAT
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анакардиновая кислота является известным ингибитором p3003 и используется в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как анализ HAT может определить новые ингибиторы p300. См. Дополнительный протокол(Схема 1)для схемы шага 1.2.1.
    1. Подготовь следующую энзиматичную реакцию в ПЦР-трубке 0,2 мл: 2 МКЛ 5x буфера анализа, 1 мл очищенного p300 (0,19 мкг/ЛЬ), 1 мл анакардиновой кислоты (HATi) или контроль DMSO, разбавленный в буфере анализа 1x и 2 МКЛ автоклавного ddH2O. Предварительно инкубировать эту смесь в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте к реакции 3 МКЛ из 100 МКМ Ацетил-КоА и 1 МКЛ очищенного H3.1 (0,2 мкг/ОЛ).
    2. Инкубировать полную реакционной смеси при 30 градусов по Цельсию в течение 1 ч в ПЦР теплового цикла.
    3. Добавьте 2 меркаптоэтанол в соотношении 1:10 к буферу образца 6x SDS.
    4. Удалите образцы из теплового цикла ПЦР и добавьте 2 МКЛ 6x SDS (с добавлением 2 меркаптоэтанола) в смесь реакции.
      ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол является токсичным и должны быть использованы внутри химического дыма капот. Пожалуйста, посмотрите лист данных безопасности для надлежащей обработки.
    5. Нагрейте пробы при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут на тепловой блок и охладить на льду. Храните образцы при -20 или -80 градусов по Цельсию или выполнять гель электрофорез и иммуноблоттинг, как описано ниже.
  3. Гель электрофорез и иммуноблоттинг
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не знакомы с гель электрофорез и иммуноблоттинга, см. этустандартную процедуру 27 для получения дополнительной информации о том, как выполнять шаги 1.3.1-1.3.17. Дополнительную информациюможно найти здесь 28,,29,,30,,31,,32,,33.
    1. Pipette 10 йл образцов (от шага 1.2.5.) в скважины 4-20% градиента полиакриламинидного геля. Pipette 5 йл белковой лестницы в одну из скважин в качестве молекулярной ссылки веса. Вы запустите гель на 120 V в течение 90 минут с помощью геля танка.
    2. Передача геля в мембрану поливинилидена дифторида (PVDF) при 100 V в течение 70 минут с помощью переноса бака.
    3. Снимите мембрану с переносного аппарата и поместите ее в пластиковый контейнер. Заблокив мембрану, добавив 1x TBST (содержащий 5% молока) в контейнер и осторожно встряхните в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Удалите 1x TBST из шага 1.3.3. Инкубировать мембрану на ночь с выбранным участком конкретных ацетил антител (например, H3K18ac или H3K27ac первичных антител при 1:5,000 разбавления в 1x TBST, содержащий 5% молока) при 4 градусов по Цельсию с нежной тряской.
    5. Удалите первичный раствор антитела. Вымойте мембрану 2x с 1x TBST (без молока) при комнатной температуре с нежной тряской в течение 15 минут каждой стирки.
    6. Разбавить вторичное антитело при температуре 1:20 000 в 1x TBST (содержащий 5% молока) и инкубировать мембрану в течение 1 ч при комнатной температуре с нежной тряской.
    7. Удалите вторичный раствор антитела. Вымойте мембрану 2x с 1x TBST (без молока) при комнатной температуре с нежной тряской в течение 15 минут каждой стирки.
    8. Слейте 1x TBST из мембраны. Смешайте раствор перекиси субстрата HRP и раствор субстрата HRP в соотношении 1:1 (1 мл каждого) и пипетку 2 мл комбинированного раствора к поверхности мембраны.
    9. Инкубировать раствор мембраной в течение 5 минут при комнатной температуре.
    10. Слейте излишки химилюминесцентного субстрата из мембраны на бумажное полотенце и поместите мембрану в полиэтиленовую пленку внутри держателя рентгеновской кассеты.
    11. Перейдите в темную комнату, посвященную обработке рентгеновской пленки. Подвергните мембрану рентгеновской пленке, поместив пленку поверх мембраны и закрыв кассету на 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время контакта между пленкой и мембраной должно быть определено экспериментально. Сильные сигналы будут нуждаться в коротких экспозициях (секундах), а более слабые сигналы могут потребовать более длительного воздействия.
    12. Удалите рентгеновую пленку из кассеты и обработать пленку, запуская ее через рентгеновский процессор пленки. Смотрите руководства производителя для получения конкретных инструкций о том, как обработать рентгеновую пленку.
    13. Снимите мембрану с полиэтиленовой пленки и промыть ее ddH2O в течение 5 минут при комнатной температуре с нежной тряской.
    14. Инкубировать мембрану с 0,2 М НаОХ в течение 5 минут при комнатной температуре с нежной тряской.
    15. Вымойте мембрану ddH2O в течение 5 минут при комнатной температуре с нежной тряской.
    16. Заблокив мембрану, добавив 1x TBST (содержащий 5% молока) в контейнер и осторожно встряхните в течение 1 ч при комнатной температуре.
    17. Добавьте следующее первичное разбавление антител (например, зонд для H3K27ac, если первое используемое антитело было H3K18ac) и встряхните на ночь при 4 градусах Цельсия. Повторите шаги 1.3.4-1.3.17 до тех пор, пока не будут завершены все зонды антител.

2. Анализ ЧХАИ

  1. В пробирке медикаментозное лечение и анализ ацетилированных гистонов
    ПРИМЕЧАНИЕ: A-485 является мощным и хорошо характеризуется p300 HATi2,4 . Этот ингибитор будет использоваться в оставшихся анализах из-за его эффективности и специфичности в клеточной культуре. МС-275 (Энтиностат)24 является HDACi, что заметно повышает уровень ацетилирования гистона и используется для облегчения обнаружения ацетилляционных зондов со стандартным иммуноблоттом. Видеть Дополнительный протокол (Схема 2) для схемы разбавления препарата, используемого в шаге 2.1.
    1. Семя 100000 MCF-7 клеток в 12 хорошо пластины и позволяют клеткам расти до 80-90% слияния в 1 мл клеточной культуры среды. Отметь скважины для следующей экспериментальной конструкции: скважина 1: управление DMSO (точка отсчета); а также 2: А-485 (3 МКМ); ну 3: А-485 (10 МКМ); хорошо 4: МС-275 (3 МКМ); а также 5: МС-275 (3 МКМ) и А-485 (3 МКМ); а 6: МС-275 (3 МКМ) и А-485 (10 МКМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования клеток MCF-7 используйте полные DMEM-средства массовой информации и позволяйте клеткам расти при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Смотрите таблицу 1 для полного рецепта DMEM.
    2. При 24 ч после посева пипетка 4 мл полного DMEM-средства массовой информации к стерильной 15 мл конической трубки. Пипетка 2 МКЛ МС-275 (6 мМ в ДМСО) до 4 мл среды для окончательной концентрации 3 МКМ МС-275.
    3. Пипетт 2 МКЛ DMSO до 4 мл среды в отдельной стерильной 15 мл конической трубки.
      ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проверьте лист данных о безопасности для правильного обращения с DMSO. Некоторые типы перчаток не оцениваются для обработки DMSO.
    4. Аспирировать клеточной культуры среды из скважин 4-6 и пипетки 1 мл 3 МКМ МС-275 в среднем (шаг 2,1,2) к каждой скважине. Откажитесь от неиспользованного разбавленного МС-275.
    5. Аспирировать клеточной культуры среды от скважин 1-3 и пипетки 1 мл разбавленной DMSO (шаг 2.1.3) к каждой скважине. Откажитесь от неиспользованного разбавленного DMSO.
    6. Вернуть клетки в инкубатор и инкубировать в течение 4 ч, чтобы накопление ацетилированных гистонов в клетках, подверженных MS-275 (колодцы 4-6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: MS-275 является HDACi и вызовет гиперацетилирование гистон24. Это 4 ч предварительной инкубации необходимо, чтобы MS-275, чтобы вызвать гиперацетацию до добавления A-485, который уменьшает ацетилированиегистон 2,4.
    7. После 4 ч инкубации с МС-275, подготовить следующие разбавления в отдельных стерильных 1,5 мл труб путем трубопроводов: 1,0 мл DMSO до 1 мл DMEM средств массовой информации; 0,5 МЛ ДМСО и 0,5 МЛ А-485 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации ДМЭМ; 0,5 МЛ ДМСО и 0,5 МКЛ А-485 (20 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации DMEM; 0,5 МЛ ДМСО и 0,5 МКЛ МС-275 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации ДМЭМ; 0,5 МЛ А-485 (6 мМ) и 0,5 МЛ МС-275 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации DMEM; 0,5 МЛ А-485 (20 мМ) и 0,5 МЛ МС-275 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации DMEM.
    8. Аспирировать клеточной культуры среды из скважин 1-6 и пипетки 1 мл разбавления 1 хорошо 1, разбавления 2 хорошо 2, разбавления 3 хорошо 3, разбавления 4 хорошо 4, разбавления 5 хорошо 5, и разбавления 6 хорошо 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее правило заключается в том, чтобы сбалансировать содержание DMSO (solvent) между экспериментальными группами и не превышать 0,1% содержания DMSO в клеточной культуре, чтобы избежать клеточной токсичности и изменений в распространении.
    9. Верните клетки в инкубатор и культуру на 20 ч.
    10. После 20 ч, аспирировать клеточной культуры среды из колодцев 1-6.
    11. Вымойте клетки путем трубопроводов 1 мл PBS к скважинам 1-6. Аспирировать PBS.
    12. Добавьте 100 мл 1x пассивного буфера лиза (см. таблицу 1) к скважинам 1-6. Храните пластину клеточной культуры (с образцами в буфере пассивного лиза) при 80 градусах Цельсия на ночь для замораживания-оттепели и лиза клеток.
      ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проверьте лист данных безопасности для всех химических веществ, прежде чем делать буферы. CDTA может вызвать серьезные повреждения глаз и раздражение.
    13. Образцы оттепели при комнатной температуре с нежной тряской в течение 10 мин. Перенесите образцы в отдельные трубы 1,5 мл и сразу же поместите на лед.
    14. Измерьте концентрацию белка в каждом образце. Концентрация белка может быть определена с помощью нескольких устоявшихсяпротоколов 34.
    15. Равноцилибратная концентрация белка между образцами 1-6 (в равном объеме) с использованием 1x пассивного буфера лиза для разбавления, по мере необходимости.
    16. Добавьте 2 меркаптоэтанол в соотношении 1:10 к буферу образца 6x SDS.
    17. Добавьте буфер образца 6x SDS с 2-меркаптоэтаноном в образцы 1-6 к окончательной концентрации буфера образца 1x SDS.
    18. Нагрейте пробы при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут на тепловой блок и охладить на льду. Образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию до шага 2.1.19.
    19. Pipette том, содержащий 30 мкг белка для образцов 1-6 к скважинам в 4-20% градиент полиакриламинид гель. Выполните процедуру иммуноблоттинга в соответствии с протоколом, описанным в Протоколе 1.

3. ЧГИП-КПКР

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол ниже описан для ингибиторов p300 в качестве примера.

  1. Буферная подготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для буферных рецептов. Общие этапы протокола ChIP (например, рецепты буфера, время стирки и время центрифугации) ниже изменены и адаптированы из рекомендаций производителя коммерчески доступного комплекта (см. таблицу материалов)и излитературы 35,36.
    1. Подготовка буфера разбавления ChIP, буфера отеков ядер, буфера для мытья соли, буфера для мытья соли, буфера для мытья LiCl и буфера TE. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
    2. Подготовка буфера sDS lysis, буфера глицина 10x и буфера elution ChIP. Хранить при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проверьте лист данных безопасности для всех химических веществ, прежде чем сделать буферы для обеспечения надлежащей обработки.
  2. Лекарственное лечение
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный протокол (Схема 3) для схемы разбавления препарата, используемого в шаге 3.2.
    1. Семена MCF-7 клетки в двух 15 см культуры посуды и растут клетки до 90% слияния в 12 мл полной среды DMEM. Отметь блюда для следующего экспериментального дизайна: Блюдо 1: DMSO управления (точка отсчета); Блюдо 2: A-485 (3 МКМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования клеток MCF-7 используйте полные DMEM-средства массовой информации и расти при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Смотрите таблицу 1 для полного рецепта DMEM.
    2. В стерильной конической трубке 15 мл, пипетке 12 мл DMEM-медиа и пипетке 6 йл DMSO. Хорошо перемешать.
    3. В отдельной стерильной конической трубке 15 мл, пипетке 12 мл DMEM-медиа и пипетке 6 МКЛ А-485 (6 мМ в ДМСО), чтобы получить окончательную концентрацию 3 МКМ А-485. Хорошо перемешать.
    4. Аспирировать средства массовой информации из Блюдо 1 и 2.
    5. Добавьте 12 мл разбавленного DMSO в DMEM (шаг 3.2.2.) в Блюдо 1.
    6. Добавьте 12 мл 3 МКМ А-485 в DMEM (шаг 3.2.3.) в Блюдо 2.
    7. Верните блюда клеточной культуры в инкубатор и инкубировать в течение 24 ч.
  3. Фиксация ячейки
    1. Pipette 330 йл (27,5 мкл на мл) 37% формальдегида для полного средства массовой информации и осторожно вихрем пластины для смешивания.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен. Пожалуйста, посмотрите лист данных безопасности для надлежащих процедур обработки.
    2. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Pipette 2 мл 10x глицина к пластине и вихрем для смешивания.
    4. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
    5. После инкубации поместите блюда на лед и оттаивать алицит ингибитора протеазы коктейль.
    6. Подготовь следующие решения для образцов DMSO и A-485 с использованием буферов, подготовленных в шаге 3.1.
      1. 2 мл PBS с 1:1,000 разбавления ингибитора протеазы коктейль
      2. 1 мл буфера отеков ядер с 1:1,000 разбавления ингибитора протеазы коктейль
      3. 0,5 мл буфера лиза SDS с разбавлением ингибитора протеазы 1:1000
    7. Аспирировать средства массовой информации из клеточной культуры посуды и мыть клетки дважды с 15 мл холодного PBS.
    8. Pipette 2 мл PBS с коктейлем ингибитора протеазы (шаг 3.3.6.1) к блюдам клеточной культуры. Поднимите клетки в раствор с помощью клеточного скребка.
    9. Перенесите подвеску клетки в микроцентрифугную трубку. Соберите оставшиеся ячейки с дополнительным PBS, если это необходимо.
    10. Спиновые трубки при 800 x g при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут, чтобы гранулы клеток.
    11. Аспирировать супернатант и пипетку 1 мл буфера отеков ядер с коктейлем ингибитора протеазы (шаг 3.3.6.2) к грануле. Повторное производство гранул и инкубации на льду в течение 10 мин.
    12. Центрифуга труб при 2700 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин для гранул нуклей.
    13. Аспирировать супернатант и пипетку 0,5 мл буфера лиза SDS с коктейлем ингибитора протеазы (шаг 3.3.6.3) к грануле. Повторное производство гранул и инкубации на льду в течение 10 мин.
    14. Храните образцы хроматина при -80 градусов по Цельсию до шага 3.4.1 или немедленно приступайте к шагу 3.4.
  4. ДНК-соника
    1. Передача 130 МКЛ хроматина из образца DMSO (шаг 3.3.14) в две звуковые трубки ДНК с помощью пипетки (по 130 йл каждая).
    2. Передача 130 МКЛ хроматина из образца А-485 (шаг 3.3.14) в две звуковые трубки ДНК с помощью пипетки (по 130 мкл каждая).
    3. Sonicate ДНК примерно 150-200 фрагментов базовой пары с использованием следующих параметров sonicator: Пик Инцидент державы (W) 175, Долг фактор 10%, 200 циклов на взрыв и 430 с времени лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки Sonication могут отличаться между моделями и настройками, возможно, потребуется настроить для достижения соответствующего размера фрагмента для различных линий ячейки.
    4. Храните образцы на льду после звукового окония.
    5. Перенесите звуковой хроматин в трубку 1,5 мл с помощью пипетки и центрифуги при 10 000 х г при 4 градусах цельсия в течение 10 мин для гранулированного мусора.
    6. Пипетт супернатант (содержит звуковой хроматин) в новую трубку и выбросить мусор. Соникированный хроматин можно хранить при -80 градусов по Цельсию.
  5. Хроматин иммунопреципиентация (ChIP)
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный протокол (Схема 3) для схемы групп ИС в шаге 3.5.
    1. Измерьте содержание белка звукового хроматина для образцов DMSO и A-485 из шага 3.4.6. Содержание белка можно измерить с помощью устоявшихсяпротоколов 34.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для простоты, этот протокол будет считать содержание белка равным и 100 йл звукового хроматина будет использоваться. В противном случае, содержание белка должно быть равновесным между всеми образцами в равном объеме.
    2. Pipette 100 йл из DMSO sonicated хроматина до двух трубок 1,5 мл (по 100 мкл каждая). Pipette 400 йл буфера разбавления ChIP (содержащий 1:1,000 разбавления ингибитора протеазы коктейль) к каждой трубке, чтобы принести общий объем до 500 йл. Удалить 5 мкл раствора из одной из трубок и хранить при -20 градусов по Цельсию, как DMSO Input.
    3. Pipette 100 йл A-485 звукового хроматина до двух трубок 1,5 мл (по 100 мкл каждая). Pipette 400 МКЛ буфера разбавления ChIP (содержащий 1:1000 разбавления ингибитора протеазы коктейль) к каждой трубке, чтобы принести общий объем до 500 йл. Удалить 5 МКЛ раствора из одной из трубок и хранить при -20 градусов по Цельсию, как A-485 Вход.
    4. Используя пипетку, добавьте антитела иммунопреципиентации (IP) (например, неспецифический контроль IgG или специфические антитела H3K27ac) к соответствующим пробкам DMSO и A-485: IP #1 DMSO хроматин с антителами IgG (5-10 г); IP #2 хроматин DMSO с антителами H3K27ac (5-10 мкг); IP #3 А-485 хроматин с антителами IgG (5-10 мкг); IP #4 A-485 хроматин с антителами H3K27ac (5-10 мкг).
    5. Добавьте 20 йл белка магнитных бусинок в каждую трубку. Убедитесь, что бисер хорошо перерасход.
    6. Поверните образцы на ночь при 4 градусах Цельсия.
    7. Пеллет белка магнитных бусин с помощью магнитного сепаратора и удалить супернатант. Не беспокоить бисер.
    8. Вымойте шарики с 500 йл до 1 мл буфера для мытья соли и поверните в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора, и удалить супернатант.
    9. Вымойте бисер с 500 йл до 1 мл буфера высокой соли мыть и вращаться в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора, и удалить супернатант.
    10. Вымойте бусинки с 500 йл до 1 мл буфера мытья LiCl и повернуть в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора, и удалить супернатант.
    11. Вымойте бисер с 500 йл до 1 мл буфера TE и поверните в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз. Держите шарики в буфере TE до шага 3.5.14.
    12. Удалите образцы ввода (из шага 3.5.2 и 3.5.3) из морозильной камеры и держите на льду.
    13. Оттепель алицита протеиназы К.
    14. Пеллет бисера с помощью магнитного сепаратора и удалить te буфер из бисера (из шага 3.5.11).
    15. Добавьте в каждый образец буфер элюциона ChIP 1 МЛ Proteinase K, включая образцы Input. Инкубационые образцы со тряской при 62 градусов по Цельсию в течение 2 ч с помощью термоциклера.
    16. После 2 ч, тепла образцов до 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут с помощью термоциклера.
    17. Охладив образцы до комнатной температуры.
    18. Гранулы магнитных бусин с помощью магнитного сепаратора и передачи супернатанта (содержит ДНК, представляющие интерес) в новую трубку 1,5 мл.
    19. Очистите ДНК с помощью стандартного комплекта очистки ПЦР.
    20. Очищенная ДНК может храниться при -20 градусов по Цельсию и может использоваться в качестве шаблонов в стандартных протоколах qPCR. Следуйте протоколам производителя для запуска qPCR.
  6. Анализ данных ChIP-qPCR
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два распространенных метода для анализа результатов ChIP-qPCR являются фолд обогащения по сравнению с антителами IgG и 1% Входной метод. Отличный шаблон для обоих методов анализа предоставляется коммерческим источником может быть использован для быстрого расчета раза обогащения для каждого IP антитела / целевой интерес37.
    1. Для расчета складного обогащения и % ввода, копирования и вставки значений ККТ из данных qPCR, полученных для каждого антитела (неспецифический IgG, антитело IP H3K27ac и 1% Вход) в соответствующую область в шаблоне анализа и Fold Enrichment and Yield % Input автоматически заполняется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализ ацетилтрансферазы in vitro histone (HAT) может быть использован для зондирования соединений, которые подавляют активность p300 HAT в направлении гистонового субстрата. Рисунок 1A предоставляет экспериментальную схему для анализа HAT. Анакардиевая кислота, известный HATi3,38, был использован в этом анализе в диапазоне концентрации от 12,5-100 МКМ. При 100 МКМ анакардиевая кислота downregulates p300 катализируемых ацетилирования гистона на histone 3, лизины 9 и 18 против управления DMSOлечения (рисунок 1B, переулок 5 против полосы 1). Диапазон концентрации был использован в этом анализе, потому что более низкие дозы препарата не может сильно препятствовать p300 HAT деятельности(рисунок 1B, полосы 2-4 против полосы 1). В переулке 6, не Ацетил-КоА был добавлен к реакции и служит отрицательным контролем для p300 катализа и базальных уровней ацетилирования гистона на рекомбинантных H3.1 (Рисунок 1B). уровни белка p300 и H3.1 использовались в качестве контроля нагрузки(рисунок 1B). Эти иммунобло результаты были количественно с помощью ImageJ39 (Рисунок 1C). Сложенные изменения были рассчитаны путем сравнения интенсивности полосы каждого образца с интенсивностью полосы управления DMSO для каждого зонда ацетилирования. Количественная оценка анакардиновой кислоты на уровне 100 МКМ показывает значительное снижение H3K18ac и H3K9ac по сравнению с контролем DMSO, подтверждая визуальные результаты на рисунке 1B.

В анализе ингибирования гиперацетилирования хроматина (CHHAI) HDACi используется в качестве инструмента для гиперацетилата гистонов в хроматине перед совместной инкубацией с HATi24, такимкак ингибитор p300 A-4852,4. Цель этого анализа заключается в том, чтобы определить эффективность HATi для ослабления гиперацетилирования гистон индуцированных HDACi. Рисунок 2A представляет можно экспериментальную схему для анализа ЧХАИ. В этом анализе, лечение клеток MCF-7 с HDACi MS-275 сильно регулируется ацетилирование на histone 3, на нескольких остатках лизина(рисунок 2B, переулок 4 против полосы 1). Базальные уровни H3K18ac и H3K27ac были низкими, показывая преимущества добавления HDACi в анализе ChHAI(рисунок 2B, полосы 1-3). Добавление А-485 с МС-275 затухает увеличение ацетилирования гистона на H3K18 и H3K27, но не H3K9(рисунок 2B, полосы 4-6). Важно отметить, что H3K9ac не регулируется p300 вклеточной культуре 2, показывая специфику A-485 в этом эксперименте. Эти иммунобло результаты были количественно на рисунке 2C. Сложенные изменения были рассчитаны путем сравнения интенсивности полосы каждого образца с интенсивностью полосы MS-275 в одиночку (Лейн 4) для каждого зонда ацетилирования. Полосы 1-3 не были количественно, потому что базальные уровни H3K18ac и H3K27ac не были обнаружены.

Хроматин иммунопреципиентно-количественной полимеразной цепной реакции (ChIP-qPCR) является экспериментом клеточной культуры, который исследует ДНК-белковых взаимодействий в конкретных регионах генома. Он может быть использован для исследования влияния HATi на элементы регулирования генов, которые контролируют выражение онкогена25. На рисунке 3A представлена экспериментальная схема протокола ChIP-qPCR. Клетки MCF-7, обработанные 3 МКМ А-485 в течение 24 часов, подвергались chIP-qPCR через иммунопреципитацию гистон-ДНК комплексов, обогащенных H3K27ac(рисунок 3). Очищенная ДНК была проанализирована для последовательности промоутера Cyclin D1. Праймеры ChIP-qPCR разработаны с помощью определенной последовательности ДНК в геноме и используются для обнаружения относительного количества осажденной ДНК. Количество осажденной ДНК отражает обилие белка интереса в геномном регионе, под исследовании. Действительно, в образце DMSO, ДНК осаждается антитела контроля IgG производит более высокое значение Ct, чем антитела H3K27ac в реакции qPCR для промоутера Cyclin D1 (Рисунок 3B). Это указывает на то, что неспецифический контроль IgG осаждал меньше ДНК-белковых комплексов, чем специфические антитела H3K27ac у промоутера Cyclin D1. Это означает 632,73 раза обогащения H3K27ac над неспецифическим igG управления(рисунок 3B).

Такое обогащение складок свидетельствует о том, что специфические антитела H3K27ac успешно иммунопрециентированы ацетилированными гистонами и что H3K27ac обогащается у промоутера Cyclin D1. После проверки качества антител H3K27ac можно проясняя группы DMSO и A-485. Как показано на рисунке 3C, A-485 уменьшает обогащение H3K27ac на промоутере Cyclin D1 по сравнению с контролем DMSO с использованием метода %Input (репрезентативный результат n'2). Важно отметить, что A-485, как известно, значительно уменьшить H3K27ac в клеточнойкультуре 2,4.

Значения chIP-qPCR ввода могут быть весьма изменчивыми между независимыми биологическими репликациями, несмотря на воспроизводимую экспериментальную тенденцию. Таким образом, это может быть полезно представить данные в качестве нормализованного процента контроля DMSO, чтобы показать воспроизводимое соотношение между контролем и медикаментозноголечения 10. Например, на рисунке 3D,A-485 значительно downregulates H3K27ac занятости на Килин D1 промоутер (n-2). Статистический анализ был основан на тесте студента (0,05).

Figure 1
Рисунок 1: Анакардиевая кислота подавляет энзиматической активности p300 в анализе HAT. (A)Схематическая диаграмма анализа HAT, изображающая энзиматические реакции. (B)Анакардиевая кислота сильно ингибирует энзиматической активности p300 и вниз регулируется ацетилирование гистон на H3K18 и H3K9 на 100 МКМ (полоса 5) по сравнению с DMSO лечения контроля (полоса 1). Лейн 6 не хватает Ацетил-КоА в реакции и служил отрицательным контролем для ацетилирования гистон. (C)Иммунобло результаты в (B) были количественно. Сложенные изменения были рассчитаны путем сравнения интенсивности полосы каждого образца с интенсивностью полосы управления DMSO для каждого зонда ацетилирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: ингибитор P300 A-485 сильно затухает гиперацетилирование гистона в анализе ЧХАИ. (A)Схематическая схема анализа CHHAI. (B)В клетках MCF-7 ингибитор HDAC MS-275 сильно регулирует ацетилирование гистонов на H3K18, K27 и K9 (полоса 4) по сравнению с управлением DMSO (полоса 1). Добавление A-485, известного ингибитора P300 HAT, с MS-275 затухлительное увеличение ацетилирования гистона на H3K18 и K27, но не H3K9 (полосы 5-6 против полосы 4). (C)Иммунобло результаты в (B) были количественно. Сложенные изменения были рассчитаны путем сравнения интенсивности полосы каждого образца с интенсивностью полосы MS-275 в одиночку (Лейн 4) для каждого зонда ацетилирования. Полосы 1-3 не были количественно, потому что базальные уровни H3K18ac и H3K27ac не были обнаружены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: ингибитор P300 A-485 снижает уровень H3K27ac в промоутере Cyclin D1, измеряемый ChIP-qPCR. (A)Схематическая диаграмма протокола ChIP-qPCR. (B)Представитель qPCR Ct значения для промоутера Cyclin D1 для IgG и H3K27ac иммунопреципиентации. Контроль IgG имел более высокое значение Ct, указывая, что антитела H3K27ac успешно обогащены для H3K27ac над неспецифическим антителом IgG. (C) A-485 (3 МКМ) лечение 24 ч вниз регулируется H3K27ac на Килин D1 промоутер по сравнению с DMSO лечения контроля в клетках MCF-7 (репрезентативный результат n'2). (D)% Вход от двух независимых экспериментов ChIP были нормализовывались для контроля DMSO в процентах от контроля DMSO. Лечение А-485 в клетках MCF-7 значительно снижает заполняемость H3K27ac в промоутере Cyclin D1. Статистический анализ был основан на тесте студента (0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Буфера Рецепт
10X Глицин буфер 18,74 г глицина с PBS до растворения и добавить PBS до 200 мл.
10X Бегущий буфер 250 мМ Трис, 1,9 М глицин, 1% SDS
Растворите 30,0 г трис базы, 144,0 г глицина и 10,0 г СДС в 1000 мл H2O. РН буфера должен быть 8,3 и корректировка рН не требуется. Храните работающий буфер при комнатной температуре и разбавлять до 1X перед использованием.
10X TBST 2.42 г базы Tris, 8г NaCl, 2 мл 50% Tween 20, добавить ddH2O до 1 литра
1X TBST с 5% молоком 5 г сухого молока на приблизительно 100 мл 1X TBST
5X Ассай буфер: 500 мМ HEPES, рН 7,5, 0,4% Тритон X-100
5X Пассивный буфер лиза сделать aqueous запас, содержащий 125 мМ Трис, рН 7,8, 10 мМ 1,2-CDTA, 10 мМ ДТТ, 5 мг/мл BSA, 5% (vol/vol) Тритон X-100 и 50% (vol/vol) глицерол в ddH2O.
6x додекил сульфат натрия (SDS) 0.375 M Tris pH 6.8, 6 мл глицерол, 1.2 г SDS, 0.93 г 1,4-дитиотрейтол (DTT), 6 мг бромофенола синего цвета, добавить воду до 10 мл.
Буфер разбавления ChIP 0,01% SDS, 1,1% Тритон X-100, 1,2 мМ EDTA, 167 мм Трис-HCl рН 8,0, 167 мм NaCl
ChIP Элуция Буфер 1% SDS (w/v) и 0,1 М NaHCO3 в автоклаве ddH2O
Полный DMEM для ячеек MCF-7: Модифицированный орлиный средний (DMEM) Dulbecco дополнен 10% сывороткой теленка крупного рогатого скота (BCS), пенициллином (10 единиц/мл) и стрептомицином (10 мг/мл)
Буфер для мытья соли с высоким содержанием соли 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 200 мм Tris-HCl pH 8.0, 500 мм NaCl.
Буфер для мытья LiCl 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА, 100 мм Tris-HCl pH 8.0.
Низкий буфер для мытья соли 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 200 мм Tris-HCl pH 8.0, 150 мм НаКл.
Буфер отеков ядер 5 мММ PIPES рН 8,0, 85 мМ ККл, 0,5% НП-40
Буфер лиза SDS 1% SDS, 10 мм EDTA, 50 мм Трис-HCl рН 8,0
Te буфер 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 1 мм ЭДТА.
Буфер передачи 25 мМ3 трис, 190 мм глицин, 20% метанола и проверить рН и настроить до рН 8,3, если это необходимо.

Таблица 1: Рецепты используемых буферов и решений.

Дополнительные файлы: Дополнительные экспериментальные схемы протоколов 1-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) ацетилат несколько остатков лизина на хвостах гистона и транскрипции факторовдля регулирования транскрипции генов 2,3. Работа в последние два десятилетия показала, что KATs, такие как CBP/p300, PCAF и GCN5, взаимодействуют с онкогенными транскрипционными факторами и помогают стимулировать рост опухоли внескольких твердых типах опухолей 4,,5,,9,,15,,16,,17,,18. Из-за их новой роли в содействии росту опухоли, KATs в настоящее время изучается в качестве новых целей в лечении рака. Новые ингибиторы KAT (KATi) должны быть тщательно и тщательно протестированы на потенцию, избирательность и безопасность, прежде чем перейти к использованию в клинике. Недавние данные показали, что ранее описанные соединения KATi демонстрируют целевые эффекты и были плохо охарактеризованы, прежде чем широко использоваться в научной литературе в качестве химическихзондов 21. Поэтому для характеристики KATi необходимы строгие методы. Описаны здесь три протокола, которые могут быть использованы вместе, чтобы охарактеризовать и проверить новые ингибиторы ориентации гистон ацетилтрансферазы (HAT) функции KATs: in vitro HAT анализ, ChHAI анализ, и ChIP-qPCR. Эти протоколы используют CBP/p300 и их ингибиторы в качестве примеров, но эти методы могут быть легко адаптированы для будущего применения при расследовании других KATs.

Анализ HAT прост и экономически эффективный способ проверки соединений на потенцию в ингибировании функции HAT в пробирке. Очищенные HATs (либо рекомбинантные4,10 или иммунопрофилированные40) могут быть проверены в этом анализе, но рекомбинантный CBP/p300 используется в качестве примера в этом протоколе. CBP/p300 имеют enzymatic HAT домен, который передает ацетил группы из ацетил-КоА в остатки лизина на целевойсубстрат 3. Наиболее характерными целями CBP/p300 являются Histone 3 Lysine 18 и 27 (H3K18 и H3K27 соответственно)2,3,10,11. В hat assay очищенный домен p300 HAT инкубируется ацетил-КоА и Хистон 3.1 в качестве субстрата. В инкубационный период p300 будет катализовать ацетилирование на нескольких остатках H3.1, включая H3K18 и H3K27. Относительное обилие ацетилирования на этих остатках может быть измерено с помощью иммуноблоттинга. Эта реакция пробирки может быть использована для проверки новых соединений, которые связываются с p300 и подавляют его активность HAT (HATi). Например, анакардиевая кислота, известный HATi38, мощно downregulates гистон ацетилирования на обоих H3K18 и H3K9 по сравнению с DMSO управления(рисунок 1B, переулок 5 против полосы 1). Критически важно добавить Ацетил-КоА к экспериментальным реакциям(рисунок 1B, Lanes 1-5) или p300 катализ ацетилирования гистона не произойдет(рисунок 1B, переулок 6). Отсутствие Ацетил-КоА также может быть использовано в качестве отрицательного контроля для p300 катализа и для базальных уровней ацетилирования гистона на рекомбинантном H3.1.

При выполнении анализа HAT важно обеспечить, чтобы каждая реакция получила одинаковое количество p300, H3.1 и Acetyl-CoA. Уровни H3.1 и p300 в иммуноблоте служат контрольом нагрузки для геля. Для этого анализа, сайт конкретных гистон ацетил антитела или пан-ацетил антитела могут быть использованы для иммуноблоттинга. При оптимизации для улучшения качества иммуноблота крайне важно использовать проверенные антитела для иммуноблоттинга и сначала следовать рекомендациям производителя по разбавлению антител. Разбавления антител, используемые в разделе Протокола, являются эталонными, а разбавления могут быть изменены на основе результатов первоначальных экспериментов (например, если сигнал слишком силен, антитела могут быть дополнительно разбавлены). Благодаря своей простоте, анализ HAT является отличным стартовым экспериментом для скрининга новых ингибиторов. Тем не менее, анализ HAT имеет недостатки. Серьезная проблема с HAT анализ является то, что соединения, которые являются эффективными в пробирке может оказаться неэффективным в живой системе. Это проблема, потому что комплексная эффективность в клеточной культуре может быть изменена проблемами клеточной проницаемости, клеточного метаболизма и стабильности соединения. Кроме того, KATs, в частности CBP/p300, имеют много белково-белковых взаимодействий, которые регулируют их активность KAT вклеточной культуре 3,,41,42. Поэтому необходимо дополнительно охарактеризовать ингибиторы, выявленные в hat-анализе в экспериментах клеточнойкультуры 20,,23.

Анализ ингибирования гиперацетилирования хроматина (CHHAI) является вторым протоколом в трубопроводе и полезен для проверки воздействия новых ингибиторов в клеточной культуре. Этот анализ использует ингибиторы HDAC (HDACi)24, чтобы вызвать гиперацетилирование гистона в клетках, потому что базальная ацетилирование может быть слишком низким, чтобы обнаружить на иммунобло. Клеточные линии выбора предварительно инкубированы с HDACi, чтобы обеспечить накопление ацетилированного хроматина до добавления HATi. После совместного инкубации HDACi и HATi, клетки лизай и подвергаются стандартным процедурам иммуноблотинга для конкретных сайтов ацетилирования гистон. Цель этого анализа заключается в том, чтобы определить эффективность романа HATi для ослабления гиперацетилирования гистон индуцированных HDACi. Клетки, подвергаемые воздействию HDACi, должны иметь значительно более высокие уровни ацетилирования гистона, чем клетки, подвергаемые воздействию растворителя DMSO(рисунок 2B, полоса 4 против полосы 1). Добавление HATi вместе с HDACi, как ожидается, уменьшить сигнал иммуноблота по сравнению с лечением HDACi только(рисунок 2B, полосы 5-6 против полосы 4). Базальные уровни ацетилированиягистона (рисунок 2B, Lanes 1-3) трудно обнаружить и подчеркивает важность добавления HDACi в этом протоколе. MS-275 (Энтиностат) используется в качестве примера, но другие HDACi могут бытьиспользованы 24,43. MS-275 имеет переменные зарегистрированные ингибирующие концентрации по сравнению с КЛАССом I HDACs и обычно подавляет HDAC1 и HDAC3 с наномоляром к низким концентрациям микромолара,соответственно 43,44. Широкий диапазон концентраций МС-275 используется влитературе 45,46,,47, но 3 м лечение обеспечивает надежное и воспроизводимое увеличение ацетилирования гистон в клетках MCF-7. Таким образом, это может быть полезно для выполнения первоначального экрана с широким диапазоном концентраций HDACi и HATi, чтобы определить оптимальную концентрацию для анализа ChHAI при использовании другой клеточной линии.

Как и в случае с HAT, протокол иммуноблотов, возможно, потребуется оптимизировать для получения качественных результатов за счет использования соответствующих антител, оптимального разбавления антител и тщательно контролируемой загрузки образца. Тщательно контролируемая погрузочная нагрузка имеет важное значение для успеха этого протокола и может быть достигнута путем равного равного содержания белка во всех образцах и путем пролития равного объема образцов в скважины иммуноблотного геля. Пан-ацетил антитела могут быть использованы для зондирования в этом протоколе. Тем не менее, она должна быть дополнена сайт конкретных ацетиловых антител, потому что KATs имеют специфику для некоторых остатков лизина гистона и HATi не влияет на все места ацетилированиягистон в клеточной культуре 1,2,4,5,10,11. Ингибиторы, которые являются мощными в снижении ацетилирования гистон как в HAT и ChHAI анализы являются сильными кандидатами для дальнейшей оценки. Важно отметить, что анализы HAT и ChHAI имеют ограничение только предоставление данных о глобальных изменениях в ацетилляции гистон. Это ограничение создает необходимость охарактеризовать эффекты нового HATi в конкретных регионах генома.

Хроматин Иммунопреципиентация-количественная полимераза Цепная реакция (ChIP-qPCR) является окончательным протоколом в трубопроводе и оценивает ДНК-белковых взаимодействий в конкретных регионах генома. В этом анализе геномные регионы, обогащенные H3K27ac, очищаются с помощью иммунопреципиентации (ИС) и анализируются с помощью праймеров ДНК в qPCR. Этот метод обеспечивает механистическое понимание того, как HATi влияет на модификации гистона у генных промоутеров и усилителей. ChIP-qPCR является надежным методом и является менее дорогостоящим, чем секвенирование всего генома (например, ChIP-seq), но это может быть трудно оптимизировать из-за многих шагов, которые влияют на результат. Самый трудный шаг для правильной оптимизации – это шаг 3.5, иммунопреципиентация. Этот шаг трудно оптимизировать, потому что если очищенная ДНК в шаге 3.5.20 сильно разбавляется, это может привести к плохим результатам в реакции qPCR (например, отсутствие усиления последовательности целевого гена и очень высокие значения ККТ). Успех шага ИС зависит от нескольких факторов, таких как обилие белка целевой интерес и качество антител IP. Очень важно проверить качество антител IP H3K27ac по сравнению с контролем IgG, чтобы проверить успех шага IP. Например, на рисунке 3Bспецифические антитела H3K27ac отображают 632,73-кратное обогащение над неспецифическим контролем IgG. Это указывает на то, что антитела H3K27ac высокого качества и что H3K27ac обогащается на промоутере Cyclin D1. После проверки антитела IP, сравнение может быть сделано между DMSO и A-485 обработанных групп. Как показано на рисунке 3C, A-485 уменьшает обогащение H3K27ac на промоутере Cyclin D1 по сравнению с контролем DMSO с использованием метода %Input (репрезентативный результат n'2). Если антитела IP доказывают низкое качество и не показывают обогащение створки в первоначальных экспериментах, попробуйте увеличить количество клеток в шаге 3.2.1. Более высокие числа клеток могут помочь компенсировать низкое качество антител за счет увеличения общего содержания белка ликата и позволит добавить больше белка в реакцию ИС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия информации, чтобы сделать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана гранты от Джеймса и Эстер Кинг биомедицинских исследований программы (6JK03 и 20K07), и Бэнкхед-Коли онкологических исследований программы (4BF02 и 6BC03), Флорида Департамент здравоохранения, Флорида рака молочной железы Фонда, и UF health Cancer Center. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра Закари Осинкинга и д-ра Андреа Лин за их поддержку в процессе публикации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

Исследования рака Выпуск 162 лизин ацетилтрансферазы KATs CBP/p300 ингибиторы ацетилтрансферазы гистона методы скрининга ацетилирование гистон эпигенетика рак регуляция генов
Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter