Summary
组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为碱基乙酰转移酶）的抑制剂，如CBP/p300，是治疗癌症的潜在疗法。然而，需要严格的方法来验证这些抑制剂。三种体外验证方法包括使用重组乙酰转移酶进行帽子检测、细胞培养中组蛋白乙酰化的免疫印迹和ChIP-qPCR。
Abstract
莱辛乙酰转移酶（KATs）催化蛋白酶和其他蛋白质上的乳氨酸残留物的乙酰化，以调节染色质动力学和基因表达。KAT，如CBP/p300，由于它们在多种癌症的肿瘤发生中起着关键作用，正在作为治疗对象进行紧张的研究。针对KATS的组蛋白乙酰转移酶（HAT）功能开发新型小分子抑制剂是具有挑战性的，需要可靠的测定，以验证潜在抑制剂的特异性和效力。
本文概述了三种方法的管道，为新型 HAT 抑制剂 （HATi） 提供严格的体外验证。这些方法包括试管 HAT 测定、染色质超乙酰化抑制（ChHAI）测定和染色质免疫沉淀-定量 PCR （ChIP-qPCR）。在 HAT 检测中，重组的 HATs 在试管反应中用组蛋白孵育，允许组蛋白尾部的特定莱辛残留物乙酰化。这种反应可以通过HATi阻断，可以通过免疫印迹测量位点特异性组蛋白乙酰化的相对水平。在 HAT 检测中识别的抑制剂需要在细胞环境中得到确认。
ChHAI 测定使用免疫印迹来筛选新型 HATi，该哈蒂能够衰减由组蛋白脱乙酰酶抑制剂 （HDACi） 诱导的组蛋白的强健超乙酰化。添加HDACi是有帮助的，因为组蛋白乙酰化的基础水平可能很难通过免疫印迹检测。
HAT 和 ChHAI 测定测量组蛋白乙酰化的全球变化，但没有提供有关特定基因组区域乙酰化的信息。因此，ChIP-qPCR用于研究HATi对基因调控元素组蛋白乙酰化水平的影响。这是通过选择性免疫沉淀组蛋白-DNA复合物和通过qPCR分析纯化DNA实现的。这三种分析方法合在一起，可以仔细验证新HATi的特异性、效力和作用机制。
Introduction
莱辛乙酰转移酶（KATs）催化了组蛋白和非组,蛋白1、2、3、4上的乳,2氨酸残留物的3乙酰化。最近的研究表明，KATS及其乙酰转移酶功能可以促进实体肿瘤的生长4，5，6，7，8，9。,5,6,7,8,9例如，CREB结合蛋白（CBP）/p300是两个准体KAT，调节癌症2，3中的许多信号通路。CBP/p300具有良好的表观乙酰转移酶（HAT）功能和催化组蛋白3莱辛27乙酰化（H3K27ac）2，4，5，10，11，一个重要的标记活性增强剂，启动子区域和活性基因转录2,4,5,10,111212，13，14。,13,14CBP/p300通过组蛋白和其他转录因子,,,4、9、15、16、17、18激活肿瘤的转录,174，9作为实体肿瘤中促进生长信号通路的关键联合活性剂。1516由于CBP/p300在肿瘤进展中的作用，CBP/p300和其他KAT正在研究开发新的抑制剂，阻止其肿瘤功能44，5，6，7，8，9，18，19，20。,5,6,7,8,9,18,19,20A-485和GNE-049代表了两个成功的尝试，以开发有效的和特定的抑制剂CBP/p30044，99。目前正在对CBP/p300和其他KAT的其他抑制剂进行调查。
前面描述的KAT抑制剂（KATi）的质量受到质疑，许多抑制剂表现出靶向效应和不良表征21。因此，对新药候选药物进行严格的鉴定和验证对于开发高质量的化学探针至关重要。此处概述的三种协议构成了筛选和严格验证新型 KATi 的效力和特异性的管道，具体侧重于抑制 KAT 的 HAT 功能 （HATi）。CBP/p300 及其抑制剂用作示例，但这些协议可适用于具有 HAT 功能7的其他 KAT。
第一个协议是体外组蛋白转移酶（HAT）测定，利用纯化重组p300和组蛋白在受控试管反应。这种测定操作简单，性价比高，可用于在低通量环境中筛选化合物，不需要放射性物质。在该协议中，重组p300催化组蛋白尾部的乳氨酸乙酰化在短暂的潜伏期，组蛋白乙酰化水平使用标准的免疫印迹程序测量。酶反应可以在CBP/p300抑制剂存在或不存在的情况下进行，以筛选减少组蛋白乙酰化的化合物。此外，HAT测定可用于通过评估新化合物与其他纯化KAT（如PCAF）的活性，来验证新化合物是否对CBP/p300具有选择性。HAT 测定是研究新型抑制剂的极好起点，因为它简单、成本低，并且能够确定抑制剂的功效/选择性。事实上，这个协议经常在文献中用作体外屏幕5,5，10。然而，在帽子检测中识别的抑制剂并不总是有效的细胞培养，因为试管反应比活细胞系统简单得多。因此，在细胞培养实验22、23中进一步描述抑制剂是十分必要的。
管道中的第二个协议是染色质超乙酰抑制（ChHAI）测定。这种基于细胞的测定利用组蛋白去乙酰酶抑制剂（HDACi）作为工具，在与HATi 24共同孵化之前，在染色质中超乙酰化组蛋白。基础组蛋白乙酰化在细胞培养中可能很低，因此如果不添加HDACi来增加乙酰化，就很难通过免疫印迹进行探查。ChHAI测定的目的是确定新的HATi，可以抑制HDAC抑制引起的组蛋白乙酰化的增加。这种测定的优点包括成本低，相对易于执行，以及细胞在培养中的使用，这提供了比试管帽子检测更多的生理相关性。与 HAT 检测类似，此协议使用标准免疫印迹进行数据收集。
HAT 和 ChHAI 检测提供了有关新化合物抑制全球组蛋白乙酰化效力的数据，但没有提供这些化合物如何影响特定基因组区域的修饰的见解。因此，最终的协议，染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）是一个细胞培养实验，研究DNA-蛋白质相互作用在基因组的特定区域。在ChIP协议中，染色质是交联的，以保持DNA蛋白相互作用。然后从细胞中提取染色质，DNA-蛋白质复合物对感兴趣的蛋白质进行选择性免疫沉淀（例如，使用H3K27ac特异性抗体）。然后使用 qPCR 对 DNA 进行纯化和分析。例如，ChIP-qPCR 可用于确定一种新的 HATi 是否对单个肿瘤的组蛋白乙酰化进行调节，例如 Cyclin D125。虽然ChIP-qPCR是该领域常用的技术，但很难优化4、10、26。,264,该协议提供了避免执行 ChIP-qPCR 过程时可能发生的潜在陷阱的提示，包括应对数据执行的质量控制检查。
当一起使用时，这三种协议允许对新型HATi进行严格的表征和验证。此外，这些方法提供了许多优点，因为它们易于执行，相对便宜，并提供全球和区域组蛋白乙酰化的数据。
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Protocol
1. 体外帽子测定
- 缓冲准备
注：有关缓冲区配方，请参阅表 1。- 准备5x测定缓冲液和6x硫酸钠（SDS），并在-20°C下储存。 1 mL 等分中的等分 Sds。
- 准备 10 倍 SDS 凝胶运行缓冲液和 10 倍 TBST，并在室温下储存。
- 准备 1x 传输缓冲液，并在 4 °C 下存放。
注意：检查本协议中使用的所有化学品的安全数据手册。SDS、DTT 和蓝个兄弟酚是有毒的，不应摄入、吸入或暴露在皮肤或眼睛中。有关正确处理程序，请参阅安全数据手册。请使用化学烟罩处理危险化学品。
- 帽子反应
注：Anacardic酸是一种已知的p300抑制剂3，用作演示 HAT 测定如何识别新型 p300 抑制剂的示例。有关步骤1.2.1的示意图，请参阅补充协议 （ 示意图 1 ）。- 在 0.2 mL PCR 管中制备以下酶反应：2 μL 的 5x 测定缓冲液， 1 μL 的纯化 p300 （0.19 μg/μL），1 μL 的亚硫酸 （HATi） 或 DMSO 控制在 1x 测定缓冲液中稀释，2 μL 的自动处理 ddH2O. 在室温下预孵育该混合物 10 分钟。然后加入3 μL的100μM乙酰-CoA和1μL的纯化H3.1（0.2μg/μL）到反应中。
- 在PCR热循环器中，在30°C下孵育完整反应混合物1小时。
- 与 6x SDS 样品缓冲液的 1：10 比率添加 2-二甲醇。
- 从 PCR 热循环器中去除样品，并将 2 μL 的 6x SDS（加入 2-mercaptoethanol）添加到反应混合物中。
注意：2-二甲醇是有毒的，应在化学烟气罩内使用。有关正确处理，请参阅安全数据手册。 - 在 95 °C 下加热样品，在热块上加热 5 分钟，在冰上冷却。将样品储存在-20或-80°C，或进行凝胶电泳和免疫印迹，详见下文。
- 凝胶电泳和免疫印迹
注：如果不熟悉凝胶电泳和免疫印迹，请参阅本标准程序27，了解如何执行步骤 1.3.1-1.3.17 的其他详细信息。其他信息可在此找到28，,29，,30， 31,31，32，33。- 移液 10 μL 样品（从步骤 1.2.5.）进入 4-20% 梯度聚丙烯酰胺凝胶的孔中。移液器5μL的蛋白质梯进入其中一口作为分子量参考。使用凝胶罐以 120 V 运行凝胶 90 分钟。
- 使用转移罐以 100 V 将凝胶以 100 V 将其转移到聚乙烯二氟化物 （PVDF） 膜上 70 分钟。
- 从传输装置上取下膜，并将其放在塑料容器中。将 1x TBST（含 5% 牛奶）加入容器，在室温下轻轻摇动 1 小时，从而堵塞膜。
- 从步骤 1.3.3 中卸下 1x TBST。在4°C下用选定的点特异性乙酰抗体（例如，H3K18ac或H3K27ac原抗体在含有5%牛奶的1x TBST中稀释1：5，000稀释时）孵育膜过夜。
- 去除原抗体溶液。在室温下用1x TBST（无牛奶）清洗膜2x，每次洗涤15分钟轻轻摇晃。
- 在 1x TBST（含 5% 牛奶）中稀释二次抗体，并在室温下通过轻轻摇动孵育膜 1 小时。
- 去除二级抗体溶液。在室温下用1x TBST（无牛奶）清洗膜2x，每次洗涤15分钟轻轻摇晃。
- 从膜中排出 1x TBST。将HRP基板过氧化物溶液和HRP基板发光醇溶液以1：1的比例（每种1 mL）和移液器2 mL混合到膜表面。
- 在室温下用膜孵育溶液5分钟。
- 将多余的化学发光基板从膜中排入纸巾，将膜用塑料包装放在 X 射线盒支架内。
- 移动到专用于 X 射线胶片处理的暗室。将膜放在膜顶部并关闭盒式磁带 30 s，将膜暴露在 X 射线膜上。
注：膜和膜的接触时间必须以实验方法确定。强信号需要短曝光（秒），弱信号可能需要更长的曝光时间。 - 从盒式磁带上取下 X 射线胶片，并通过 X 射线胶片处理器进行处理。有关如何处理 X 射线膜的详细说明，请参阅制造商手册。
- 从塑料包装上取下膜，用 ddH2O 在室温下用轻轻摇动洗涤 5 分钟。
- 在室温下用0.2 M NaOH孵育膜5分钟，轻轻摇动。
- 在室温下用 ddH2O 清洗膜 5 分钟，轻轻摇动。
- 将 1x TBST（含 5% 牛奶）加入容器，在室温下轻轻摇动 1 小时，从而堵塞膜。
- 加入下一个原抗体稀释（例如，如果使用的第一个抗体是H3K18ac，则探针H3K27ac），并在4°C下过夜。 重复步骤 1.3.4-1.3.17，直到所有抗体探针完成。
2. 查伊测定
- 体外药物治疗及乙酰基基组胃分析
注： A-485 是一种有力且具有良好特征的 p300 HATi2,4 .由于该抑制剂在细胞培养中的功效和特异性，将在剩余的测定中使用。MS-275 （恩蒂诺斯塔特）24 是一种 HDACi，显著增加组蛋白乙酰化水平，用于促进乙酰化探针与标准免疫印迹的更容易检测。看到 补充议定书 (示意图 2）用于步骤 2.1 中使用的药物稀释的示意图。- 种子100，000 MCF-7细胞在12个井板，并允许细胞生长到80-90%汇合在1mL的细胞培养培养。标记井进行以下实验设计：井1：DMSO控制（参考点）;井2：A-485（3μM）;井3：A-485（10μM）;井 4： MS-275 （3 μM）;井 5： MS-275 （3 μM） = A-485 （3 μM）;井 6： MS-275 （3 μM） = A-485 （10 μM）。
注：对于培养MCF-7细胞，使用完整的DMEM介质，并允许细胞在37°C下生长，5%的CO2。有关 完整的 DMEM 配方 ，请参阅表 1。 - 播种后24小时，移液器4mL的完整DMEM介质到无菌的15mL锥形管。MS-275的移液器 2 μL（DMSO 中的 6 mM）至 4 mL 的介质，最终浓度为 3 μM MS-275。
- 在单独的无菌 15 mL 锥形管中，将 2 μL 的 DMSO 到 4 mL 介质。
注意：请检查安全数据表是否正确处理 DMSO。某些手套类型没有额定处理 DMSO。 - 将细胞培养培养素从孔4-6和移液器1 mL的3μM MS-275中（步骤2.1.2）吸入每个孔。丢弃未使用的稀释 MS-275。
- 将细胞培养基从孔1-3和移液器1 mL稀释的DMSO（步骤2.1.3）吸进每个井。丢弃未使用的稀释 DMSO。
- 将细胞返回到培养箱并孵育4小时，以允许在暴露于MS-275（井4-6）的细胞中积累乙酰基酮。
注：MS-275是HDACi，会导致组蛋白超乙酰化24。这种4小时预孵育是必要的，使MS-275诱导超乙酰化之前添加的 A-485，这减少了组蛋白乙酰化2，44。 - 使用MS-275孵育4小时后，通过移液在单独的无菌1.5 mL管中制备以下稀释：1.0μL的DMSO至1 mL的DMEM介质;0.5 μL 的 DMSO 和 0.5 μL 的 A-485 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 DMSO 和 0.5 μL 的 A-485 （20 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 DMSO 和 0.5 μL 的 MS-275 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 A-485 （6 mM） 和 0.5 μL 的 MS-275 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 A-485 （20 mM） 和 0.5 μL 的 MS-275 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质。
- 将细胞培养培养从井1-6和移液器1mL稀释1到井1，稀释2到井2，稀释3到井3，稀释4到井4，稀释5到井5，稀释6到井6。
注：一般规则是平衡实验组之间的DMSO（溶剂）含量，不要超过细胞培养中的0.1%DMSO含量，以避免细胞毒性和增殖变化。 - 将细胞返回培养箱并培养20小时。
- 20小时后，从井1-6中吸出细胞培养培养。
- 通过将 1 mL 的 PBS 移液到井 1-6 洗涤细胞。吸气 PBS 。
- 将 100 μL 的 1x 无源解液缓冲液（参见 表 1）添加到井 1-6 中。将细胞培养板（样品储存在无源解液缓冲液中）在+80°C下过夜，用于细胞的冷冻和解冻。
注意：在制作缓冲液之前，请检查所有化学品的安全数据表。CDTA 可引起严重的眼部损伤和刺激。 - 在室温下解冻样品，轻轻摇动10分钟。将样品转移到单独的 1.5 mL 管中，并立即放在冰上。
- 测量每个样品的蛋白质浓度。蛋白质浓度可以通过几个成熟的协议34确定。
- 使用1x无源解液缓冲液，必要时在样品1-6（同等体积）之间平衡蛋白质浓度以稀释。
- 以 1：10 比 6 倍 SDS 样品缓冲液添加 2-美甲乙醇。
- 将 6x SDS 样品缓冲液与 2-墨二甲醇添加到样品 1-6 中，最终浓度为 1x SDS 样品缓冲液。
- 在 95 °C 下加热样品，在热块上加热 5 分钟，在冰上冷却。样品可储存在-20°C或-80°C，直到步骤2.1.19。
- 在4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶中，将含有30μg蛋白质的体积移液，用于样品1-6到孔中。根据协议1中描述的协议执行免疫印迹程序。
- 种子100，000 MCF-7细胞在12个井板，并允许细胞生长到80-90%汇合在1mL的细胞培养培养。标记井进行以下实验设计：井1：DMSO控制（参考点）;井2：A-485（3μM）;井3：A-485（10μM）;井 4： MS-275 （3 μM）;井 5： MS-275 （3 μM） = A-485 （3 μM）;井 6： MS-275 （3 μM） = A-485 （10 μM）。
3. ChIP-qPCR
注：以下协议以p300的抑制剂为例。
- 缓冲准备
注：有关缓冲区配方，请参阅表 1。下面的 ChIP 协议的一般步骤（例如缓冲配方、洗涤时间和离心时间）根据制造商对商用套件的建议（参见材料表）和文献 35、36进行了修改和调整。- 准备ChIP稀释缓冲液、核膨胀缓冲液、低盐洗液缓冲液、高盐洗液缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和TE缓冲液。储存在4°C。
- 准备 SDS 解液缓冲液、10 倍甘氨酸缓冲液和 ChIP 洗脱缓冲液。在室温下储存。
注意：在制作缓冲液之前，请检查所有化学品的安全数据表，以确保正确处理。
- 药物治疗
注：有关步骤3.2中使用的药物稀释的示意图，请参阅补充协议（示意图3）。- 种子MCF-7细胞在两个15厘米培养皿和生长细胞到90%汇合在12mL的完整DMEM介质。标记菜盘进行以下实验设计：菜1：DMSO控制（参考点）;菜 2： A-485 （3 μM）。
注：对于培养MCF-7细胞，使用完整的DMEM介质，并在37°C下生长，5%的CO2。有关 完整的 DMEM 配方 ，请参阅表 1。 - 在无菌 15 mL 锥形管中，移液器 12 mL 的 DMEM 介质和移液器 6 μL 的 DMSO。混合得很好。
- 在单独的无菌 15 mL 锥形管中，移液器 12 mL 的 DMEM 介质和移液器 6 μL 的 A-485（DMSO 中的 6 mM）获得最终浓度为 3 μM A-485。混合得很好。
- 从 Dish 1 和 2 中吸出媒体。
- 在 DMEM 中添加 12 mL 稀释的 DMSO（步骤 3.2.2.）添加到 Dish 1 中。
- 在 DMEM 中添加 3 μM A-485 的 12 mL（步骤 3.2.3.）添加到 Dish 2 中。
- 将细胞培养皿返回孵化器并孵育24小时。
- 种子MCF-7细胞在两个15厘米培养皿和生长细胞到90%汇合在12mL的完整DMEM介质。标记菜盘进行以下实验设计：菜1：DMSO控制（参考点）;菜 2： A-485 （3 μM）。
- 细胞固定
- 将37%甲醛移液 330 μL（每 mL 27.5 μL）到完整介质，轻轻旋转板进行混合。
注意：甲醛是有毒的。有关正确处理程序，请参阅安全数据手册。 - 在室温下孵育10分钟。
- 移液 2 mL 的 10 倍甘氨酸到板和漩涡混合。
- 在室温下孵育5分钟。
- 孵育后，将菜肴放在冰上，并解冻一杯蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
- 使用步骤 3.1 中准备的缓冲区，为 DMSO 和 A-485 样本准备以下解决方案。
- 2 mL 的 PBS 与 1：1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒
- 1 mL 的核膨胀缓冲液，1：1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒
- 0.5 mL SDS Lysis 缓冲液，1：1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒
- 从细胞培养皿中吸出介质，用 15 mL 的冷 PBS 洗两次细胞。
- 用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（步骤3.3.6.1）对细胞培养皿进行2 mL的移液。使用细胞刮刀将细胞提起溶液。
- 将细胞悬浮液转移到微离心管。如有必要，使用额外的 PBS 收集剩余单元格。
- 在 4 °C 下以 800 x g 旋转管 5 分钟，以对细胞进行颗粒。
- 用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（步骤3.3.6.2）将上流剂和移液器1 mL的核膨胀缓冲液吸到颗粒中。重新暂停颗粒，在冰上孵育10分钟。
- 在 4 °C 下以 2，700 x g 将管离心 5 分钟，以颗粒核。
- 用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（步骤3.3.6.3）吸进上流液和移液器0.5 mL的SDS解菌缓冲液。重新暂停颗粒，在冰上孵育10分钟。
- 将染色质样品储存在-80°C，直到步骤3.4.1，或立即继续执行步骤3.4。
- 将37%甲醛移液 330 μL（每 mL 27.5 μL）到完整介质，轻轻旋转板进行混合。
- DNA 声波
- 使用移液器将 130 μL 的染色质从 DMSO 样品（步骤 3.3.14）转移到两个 DNA 声波管（每个 130 μL）。
- 使用移液器将 130 μL 的染色质从 A-485 样品（步骤 3.3.14）转移到两个 DNA 声波管（每个 130 μL）。
- 使用以下声波器设置将DNA声波化为大约150-200个碱基对片段：峰值事件功率（W）为175，占空比为10%，每突发200个周期和430个治疗时间。
注：不同型号的声波设置可能不同，可能需要调整设置，以实现适合不同细胞系的片段大小。 - 声波后将样品放在冰上。
- 使用移液器将声波染色质转移到 1.5 mL 管中，并在 4 °C 下以 10，000 x g 的离心机进行 10 分钟，以颗粒碎屑。
- 将上流液（含有声波染色质）移到新管中，然后丢弃碎屑。声波染色质可储存在-80°C。
- 染色质免疫沉淀（ChIP）
注：有关步骤3.5 中IP 组原理图，请参阅补充协议 （ 架构图 3 ）。- 测量步骤 3.4.6 中 DMSO 和 A-485 样品的声波染色质的蛋白质含量。蛋白质含量可以用成熟的协议34进行测量。
注：为简单起见，该协议将假定蛋白质含量相等，并将使用100μL的声波染色质。否则，蛋白质含量需要以相等的体积在所有样品之间平衡。 - 将 DMSO 声波染色质移液 100 μL 到两个 1.5 mL 管（每个 100 μL）。滴管 400 μL 的 ChIP 稀释缓冲液（包含 1：1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到每个管，使总体积高达 500 μL。
- 将 A-485 声波染色质移液 100 μL 到两个 1.5 mL 管（每个 100 μL）。将400μL的ChIP稀释缓冲液（含1：1000稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到每个管中，使总体积达到500μL。
- 使用移液器，将免疫沉淀（IP）抗体（例如非特异性IgG控制或H3K27ac特异性抗体）添加到DMSO和A-485样品的相应管中：IP #1 DMSO染色质与IgG抗体（5-10μg）;IP #2 H3K27ac抗体（5-10 μg）的DMSO染色质;IP #3 A-485染色质与IgG抗体（5-10μg）;IP #4 A-485 染色质，具有 H3K27ac 抗体（5-10 μg）。
- 在每个管中加入20μL的蛋白质 A 磁珠。确保珠子重新暂停。
- 在4°C下将样品旋转一夜。
- 使用磁性分离器将蛋白质分解为磁性珠，然后取出上清液。不要打扰珠子。
- 用 500 μL 至 1 mL 的低盐洗涤缓冲液清洗珠子，并在 4 °C 下旋转 5 分钟。 快速旋转，使用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。
- 用 500 μL 至 1 mL 的高盐洗液缓冲液清洗珠子，在 4 °C 下旋转 5 分钟。 快速旋转，使用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。
- 用 500 μL 至 1 mL 的 LiCl 洗涤缓冲液清洗珠子，并在 4 °C 下旋转 5 分钟。 快速旋转，使用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。
- 用 500 μL 至 1 mL 的 TE 缓冲液清洗珠子，并在 4 °C 下旋转 5 分钟。 执行快速旋转。将磁珠放在 TE 缓冲器中，直到步骤 3.5.14。
- 从冰柜中取出输入样品（从步骤 3.5.2 和 3.5.3）中，并保持在冰上。
- 解冻蛋白酶K的等分。
- 使用磁性分离器将珠子取出，然后从磁珠上取出TE缓冲液（从步骤3.5.11中）。
- 在每个样品中加入100μL ChIP洗脱缓冲液=1μL蛋白酶K，包括输入样品。使用热循环器在62°C下摇动样品2小时。
- 2小时后，使用热循环器将样品加热至95°C10分钟。
- 将样品冷却至室温。
- 使用磁性分离器将上一个（包含感兴趣的DNA）转移到新的1.5 mL管中。
- 使用标准的 PCR 清理套件净化 DNA。
- 纯化DNA可储存在-20°C，可作为标准qPCR协议的模板。按照制造商协议运行 qPCR。
- 测量步骤 3.4.6 中 DMSO 和 A-485 样品的声波染色质的蛋白质含量。蛋白质含量可以用成熟的协议34进行测量。
- ChIP-qPCR 数据分析
注：分析ChIP-qPCR结果的两种常用方法是在IgG抗体和1%输入法上折叠富集。商业源为两种分析方法提供了出色的模板，可用于快速计算每个IP抗体/目标37的折叠富集。- 要计算折叠富集和百分比输入，请复制并将每个抗体（非特异性IgG、IP H3K27ac抗体和1%输入）获得的qPCR数据中的+Ct值粘贴到分析模板中的相应区域中，折叠富集和产量百分比输入将自动填充。
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Representative Results
体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）测定可用于探寻抑制p300 HAT活性的化合物对组蛋白基质。图 1A提供了 HAT 测定的实验原理图。Anacardic酸，一种已知的HATi3，38，在12.5-100μM的浓度范围内被用于此测定。3,在100μM时，甲酸下调节p300催化组蛋白乙酰化在组酮3，Lysines 9和18对控制DMSO处理（图1B，车道5对车道1）。这种测定利用了浓度范围，因为较低的药物剂量可能不会大大抑制p300 HAT活性（图1B，车道2-4与车道1）。在巷6中，没有乙酰-CoA被添加到反应中，并作为p300催化和重组时组蛋白乙酰化基底水平的负对照（图1B）。p300 和 H3.1 蛋白质水平用作负载控制（图 1B）。这些免疫布洛特结果使用 ImageJ39 进行量化（图 1C） 。通过将每个样品的带强度与每个乙酰化探头的 DMSO 控制带强度进行比较来计算折叠变化。与DMSO控制相比，100μM的亚卡酸定量显示H3K18ac和H3K9ac的显著减少，证实了图1B中的视觉结果。
在染色质超乙酰抑制（ChHAI）测定中，HDACi被用作与HATi24共同孵育之前在染色质中超乙酰化组蛋白的工具，如p300抑制剂A-4852，4。,4此测定的目的是确定HATi对减轻HDACi诱导的组蛋白泛乙酰化的疗效。图2A为ChHAI测定提供了实验示意图。在此测定中，对具有HDACi MS-275的MCF-7细胞在组酮3上对几种莱辛残留物进行强调节乙酰化（图2B，车道4与车道1）。H3K18ac和H3K27ac的基底水平较低，显示了在ChHAI测定中添加HDACi的好处（图2B，车道1-3）。添加与MS-275的A-485在H3K18和H3K27时衰减增加的组蛋白乙酰化，但不是H3K9（图2B，车道4-6）。重要的是，H3K9ac在细胞培养2中不受p300的调控，在实验中显示了S-485的特异性。这些免疫布洛特结果在图2C中量化。通过将每个样品的带强度与每个乙酰化探头的 MS-275 单独（Lane 4）的带强度进行比较来计算折叠变化。由于未检测到 H3K18ac 和 H3K27ac 基底水平，未对车道 1-3 进行量化。
染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）是一种细胞培养实验，研究基因组特定区域的DNA-蛋白质相互作用。它可用于研究HATi在基因调控元素中控制基因表达25的影响。 图3A 提供了ChIP-qPCR协议的实验原理图。MCF-7细胞用3μM A-485治疗24小时，通过免疫沉淀在H3K27ac中丰富的组蛋白-DNA复合物（图3）对纯化DNA进行了CyclinD1启动子序列分析。ChIP-qPCR 底子是针对基因组中的特定DNA序列设计的，用于检测沉淀DNA的相对量。沉淀DNA的量反映了所研究的基因组区域感兴趣的蛋白质的丰度。事实上，在DMSO样品中，IgG控制抗体沉淀的DNA产生比CyclinD1启动子qPCR反应中的H3K27ac抗体更高的Ct值（图3B）。这表明非特异性IgG对照沉淀的DNA-蛋白复合物比CyclinD1启动子的H3K27ac特异性抗体少。这转化为H3K27ac比非特异性IgG控制（图3B）的632.73倍富集。
这种褶皱浓缩提供了证据，表明H3K27ac特异性抗体成功地免疫沉淀乙酰化组蛋白，H3K27ac在Cyclin D1启动子中富集。验证H3K27ac抗体质量后，可以比较DMSO和 A-485治疗组。如图3C 所示，A-485 使用 %Input 方法（n=2 的代表性结果）减少Cyclin D1启动器的H3K27ac浓缩量，而不是DMSO控制。重要的是，A-485已知可以显著降低细胞培养2，4中的H3K27ac。2,4
ChIP-qPCR 原始 %输入值在独立生物复制之间可以高度可变，尽管实验趋势是可重复的。因此，将数据作为DMSO控制的规范化百分比来显示控制和药物治疗10之间的可重复比率可能很有用。例如，在图 3D中，A-485 显著降低对 Cyclin D1 启动子 （n=2） 的 H3K27ac 占用率的调节。统计分析基于学生的 t 测试 （*P < 0.05）。
图1：在帽子检测中，阿纳卡酸抑制p300酶活性。（A） HAT测定的示意图，描绘了酶反应。（B） 与DMSO控制处理（车道1）相比，在H3K18和H3K9下，Anacardic酸能有效抑制p300酶活性，并降低组蛋白乙酰化。巷6在反应中缺乏乙酰-CoA，作为组蛋白乙酰化的负对照。（C） 免疫布洛特结果 （B） 被量化。通过将每个样品的带强度与每个乙酰化探头的 DMSO 控制带强度进行比较来计算折叠变化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：p300抑制剂 A-485 有效衰减ChHAI测定中组蛋白超乙酰。（A） CHHAI 测定的示意图。（B） 在MCF-7细胞中，HDAC抑制剂MS-275在H3K18、K27和K9（车道4）与DMSO控制（车道1）中有效调节组蛋白乙酰化。添加A-485，一种已知的p300 HAT抑制剂，MS-275在H3K18和K27时抑制了组蛋白乙酰化的增加，但不是H3K9（车道5-6与车道4）。（C） 免疫布洛特结果 （B） 被量化。通过将每个样品的带强度与每个乙酰化探头的 MS-275 单独（Lane 4）的带强度进行比较来计算折叠变化。由于未检测到 H3K18ac 和 H3K27ac 基底水平，未对车道 1-3 进行量化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：p300抑制剂 A-485 降低Cyclin D1启动子的H3K27ac水平，按ChIP-qPCR测量。（A） ChIP-qPCR 协议的示意图。（B） IgG 和 H3K27ac 免疫沉淀的 Cyclin D1 启动子的代表性 qPCR Ct 值。IgG 对照具有较高的 Ct 值，表明 H3K27ac 抗体在非特异性 IgG 抗体上成功富集 H3K27ac。（C） 与MCF-7细胞的DMSO控制治疗（n=2的代表性结果）相比，在Cyclin D1启动子下对24小时下调节的H3K27ac进行A-485（3μM）治疗。（D） 两个独立 ChIP 实验的 %输入被规范化为 DMSO 控件的百分比。MCF-7细胞中的 A-485 治疗显著降低了Cyclin D1启动子的H3K27ac占用率。统计分析基于学生的 t 测试 （*P < 0.05）。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 缓冲区 | 食谱 | |
| 10 倍甘氨酸缓冲液 | 18.74 g 的甘氨酸与 PBS 溶解，并添加 PBS 到 200 ml。 | |
| 10 倍运行缓冲区 | 250 mM 三轮车，1.9 M 甘氨酸，1% SDS 在 1000 ml H2O 中溶解 30.0 g 的 Tris 碱基、144.0 g 的甘氨酸和 10.0 g 的 SDS。缓冲液的 pH 值应为 8.3，无需 pH 调整。将运行缓冲液存放在室温下，使用前稀释至1倍。 |
|
| 10 倍 TBST | 2.42 g 的 Tris 基座， 8 克 NaCl， 2 ml 50% Tween 20， 添加 ddH2O 到 1 升 | |
| 1X TBST，5% 牛奶 | 5g 奶粉每约 100 毫升 1X TBST | |
| 5X 测定缓冲液： | 500 mM HEPES， pH 7.5， 0.4 % 特里顿 X-100 | |
| 5X 无源解解缓冲液 | 制造含有 125 mM Tris、pH 7.8、10 mM 1，2-CDTA、10 mM DTT、5 mg/ml BSA、5%（伏/伏）Triton X-100和50%（伏/卷）甘油的水性库存。 | |
| 6X 硫酸二甲酸钠 （SDS） | 0.375 M Tris pH 6.8， 6 ml 甘油， 1.2 g SDS， 0.93 g 1，4-二甲醇 （DTT）， 6 毫克布罗莫酚蓝色， 加入水到 10 毫升. | |
| ChIP 稀释缓冲液 | 0.01% SDS， 1.1% 特里顿 X-100， 1.2 mM EDTA， 167 mM Tris-HCl pH 8.0， 167 mM NaCl | |
| ChIP 洗脱缓冲器 | 1% SDS （w/v） 和 0.1 M NaHCO3 在自动 <3>02O | |
| MCF-7 细胞的完整 DMEM： | Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM） 辅以 10% 牛小牛血清 （BCS）、青霉素 （10 单位/毫升） 和链霉素 （10 毫克/毫升） | |
| 高盐洗涤缓冲液 | 0.1% SDS， 1% 特里顿 X-100， 2 mM EDTA， 200 mM Tris-HCl pH 8.0， 500 mM NaCl. | |
| LiCl 洗涤缓冲液 | 0.25 M LiCl， 1% NP-40， 1% 脱氧二甘酸钠， 1 mM EDTA， 100 mM Tris-HCl pH 8.0. | |
| 低盐洗涤缓冲液 | 0.1% SDS， 1% 特里顿 X-100， 2 mM EDTA， 200 mM Tris-HCl pH 8.0， 150 mM NaCl. | |
| 核膨胀缓冲液 | 5 mM 管道 pH 8.0， 85 mM KCl， 0.5% NP-40 | |
| SDS 解解缓冲液 | 1% SDS， 10 mM EDTA， 50 mM 三轮车-HCl pH 8.0 | |
| TE 缓冲区 | 10 mM 三轮车-HCl pH 8.0，1 mM EDTA。 | |
| 传输缓冲区 | 25 mM Tris，190 mM 甘氨酸，20% 甲醇，并检查 pH 值，必要时调整为 pH 8.3。 | |
表1：使用的缓冲区和溶液的配方。
补充文件：协议1-3的补充实验示意图。请点击这里下载此文件。
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Discussion
莱辛乙酰转移酶（KATs）乙酰酸酯在组蛋白尾部和转录因子上有几个莱辛残留物，以调节基因转录2，3。2过去二十年的工作显示，KAT，如CBP/p300，PCAF和GCN5，与致癌转录因子相互作用，并有助于推动肿瘤生长在几个实体肿瘤类型4，5，9，15，16，17，18。,5,9,15,16,17,18由于KAT在促进肿瘤生长方面的新作用，它们作为癌症治疗的新目标被研究。新型 KAT 抑制剂 （KATi） 在进入诊所使用之前，需要仔细和严格地测试效力、选择性和安全性。最近的证据表明，以前描述的KATi化合物表现出目标效应，在被广泛用于科学文献作为化学探针21之前，其特征很差。因此，KATI 表征需要严格的方法。此处描述的三种协议可以一起用于描述和验证针对 KATs 的组蛋白乙酰转移酶 （HAT） 功能的新抑制剂：体外 HAT 测定、ChHAI 测定和 ChIP-qPCR。这些协议使用CBP/p300及其抑制剂作为示例，但这些方法可以很容易地适用于将来用于研究其他KAT。
HAT 检测简单且具有成本效益的方法，可筛选化合物，以抑制试管中的 HAT 功能。纯化HATs（重组4,4、10或免疫沉淀40）可以在此检测中进行测试，但在此协议中，重组CBP/p300作为示例。CBP/p300具有酶性帽子域，可将乙酰组从乙酰-CoA转移到目标基板3上的莱辛残留物。最特点的CBP/p300组蛋白靶是组酮3莱辛18和27（H3K18和H3K27，分别）2，3，10，11。2,3,10,11在 HAT 测定中，纯化 p300 HAT 域以乙酰-CoA和 Astone 3.1 作为基质进行孵育。在孵育期间，p300将催化若干H3.1残留物的乙酰化，包括H3K18和H3K27。这些残留物的乙酰化的相对丰度可以通过免疫印迹来测量。这种试管反应可用于筛选与p300结合并抑制其帽子活性（HATi）的新化合物。例如，与DMSO控制相比，已知HATi38的甲酸有效降低H3K18和H3K9的组蛋白乙酰化（图1B，车道5与车道1）。将乙酰-CoA添加到实验反应（图1B，车道1-5）或p300组蛋白乙酰化催化中至关重要（图1B，车道6）。乙酰-CoA的缺失也可以用作p300催化和重组时组蛋白乙酰化基底水平的负对。
在进行 HAT 检测时，必须确保每种反应获得相同数量的 p300、H3.1 和乙酰-CoA。免疫布洛特中的H3.1和p300水平作为凝胶的负荷控制。对于此测定，特定组蛋白乙酰抗体或泛乙酰抗体可用于免疫印迹。在优化以提高免疫布洛放质量时，使用经过验证的抗体进行免疫印迹，并初步遵循制造商的抗体稀释建议至关重要。协议部分中使用的抗体稀释用于参考，稀释可以根据初始实验的结果进行改变（例如，如果信号太强，抗体可以进一步稀释）。由于其简单性，HAT测定是筛选新型抑制剂的一个很好的开始实验。然而，HAT测定确实有缺点。HAT 检测的一个主要担忧是，在试管中有效的化合物在活体系统中可能证明是无效的。这是一个问题，因为细胞培养中的复合功效可以通过细胞渗透性问题、细胞代谢和化合物稳定性来改变。此外，KAT，特别是CBP/p300，有许多蛋白质-蛋白质相互作用，调节其KAT活性在细胞培养3,3，41，42。,42因此，在细胞培养实验20、23中，对帽子测定中确定的抑制剂进行进一步定性至关重要。
色谱超乙酰抑制（ChHAI）测定是管道中的第二个方案，有助于验证新型抑制剂在细胞培养中的作用。此测定利用HDAC抑制剂（HDACi）2424在细胞中诱导组蛋白超乙酰化，因为基础乙酰化可能太低，无法在免疫细胞上检测。选择的细胞系用HDACi预孵育，允许在添加HATi之前积累乙酰染色质。在共同孵育HDACi和HATi后，细胞被碱化，并接受特定组蛋白乙酰化位点的标准免疫印迹程序。此测定的目的是确定新型HATi对减轻HDACi诱导的组蛋白泛乙酰化的疗效。暴露于HDACi的细胞应比暴露于DMSO溶剂的细胞具有高得多的组蛋白乙酰化水平（图2B，车道4与车道1）。与HDACi治疗相比，HATi与HDACi一起添加的HTI有望减少免疫布洛特信号（图2B，车道5-6与车道4）。组蛋白乙酰化的基础水平（图2B，车道1-3）是难以检测的，并突出了在此协议中添加HDACi的重要性。MS-275（Entinostat）用作示例，但其他 HDACi 可使用 24，43。MS-275与一类HDACs相比具有可变的抑制性浓度，通常抑制HDAC1和HDAC3，纳米摩尔浓度低，分别为43、44,44。文献45、46、47,中使用多种MS-275浓度，但3μM治疗可在MCF-7细胞中提供可重复的组蛋白乙酰化。46,47因此，在使用不同的细胞系时，执行具有广泛HDACi和HATi浓度的初始筛查，以确定ChHAI测定的最佳浓度可能是有益的。
与 HAT 测定类似，可能需要优化免疫布洛特协议，以便通过使用适当的抗体、最佳抗体稀释和严格控制的样品加载获得质量结果。严格控制样品负荷对于本协议的成功至关重要，可以通过平衡所有样品的蛋白质含量，并通过将等量样品移入免疫布洛特凝胶的孔中实现。泛乙酰抗体可用于此协议中的探测。然而，它应该补充与位点特异性乙酰抗体，因为KAT具有某些组蛋白Lysine残留物的特异性和HATi不影响细胞培养,,物1，2，4，5，10，112的所有组蛋白乙,酰化位点。4,5110在 HAT 和 ChHAI 检测中，在减少组蛋白乙酰化方面有有效抑制剂是进一步评估的有力候选因素。重要的是，HAT和ChHAI的测定有只提供组蛋白乙酰化全球变化数据的限制。这种限制使需要描述新HATi在基因组特定区域的影响。
染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）是管道中的最终方案，用于评估基因组特定区域的DNA蛋白相互作用。在该测定中，富含H3K27ac的基因组区域通过免疫沉淀（IP）进行纯化，并使用qPCR中的DNA底能分析。这项技术提供了机械洞察HATi如何影响组蛋白修饰在基因启动剂和增强剂。ChIP-qPCR 是一项强大的技术，比全基因组测序（例如 ChIP-seq）成本更低，但由于影响结果的许多步骤，可能难以优化。最难正确优化的步骤是步骤 3.5，即免疫沉淀。此步骤很难优化，因为如果步骤 3.5.20 中的纯化 DNA 高度稀释，则可能导致 qPCR 反应结果不佳（例如，目标基因序列没有扩增和非常高的 μCt 值）。IP 步骤的成功取决于几个因素，例如感兴趣的蛋白质靶点的丰富度和 IP 抗体的质量。验证 IP H3K27ac 抗体与 IgG 控制的质量以验证 IP 步骤是否成功至关重要。例如，在图 3B中，H3K27ac特异性抗体比非特异性IgG控制显示632.73倍富集。这表明H3K27ac抗体是高质量的，H3K27ac在CyclinD1启动子中具有丰富的内容。验证IP抗体后，可以比较DMSO和 A-485治疗组。如图 3C 所示，A-485 使用 %Input 方法（n=2 的代表性结果）减少Cyclin D1启动器的H3K27ac浓缩量，而不是DMSO控制。如果IP抗体被证明质量低，在初始实验中未显示折叠富集，请尝试在步骤3.2.1中增加细胞数。细胞数的增加可以通过增加酸盐的总蛋白质含量来帮助补偿抗体质量差，并允许更多的蛋白质加入IP反应。
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Disclosures
作者没有利益冲突或披露。
Acknowledgments
这项工作得到了詹姆斯和埃丝特·金生物医学研究计划（6JK03和20K07）以及Bankhead-Coley癌症研究计划（4BF02和6BC03）、佛罗里达州卫生部、佛罗里达州乳腺癌基金会和UF健康癌症中心的赠款的支持。此外，我们要感谢扎卡里·奥斯金博士和安德里亚·林博士在出版过程中给予的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
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