Summary
Les inhibiteurs de l’hétone acétyltransférases (HATs, également connu sous le nom d’acétyltransférases de lysine), tels que CBP/p300, sont des traitements potentiels pour traiter le cancer. Cependant, des méthodes rigoureuses pour valider ces inhibiteurs sont nécessaires. Trois méthodes in vitro pour la validation incluent des essais de HAT avec des acétyltransférases recombinantes, l’immunoblotting pour l’acétylation d’histone dans la culture cellulaire, et ChIP-qPCR.
Abstract
Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les histones et d’autres protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et l’expression des gènes. KaTs, tels que CBP/p300, font l’objet d’une étude intense en tant que cibles thérapeutiques en raison de leur rôle critique dans la tumeur de divers cancers. Le développement de nouveaux inhibiteurs de petites molécules ciblant la fonction d’acétyltransférase histone (HAT) des KAT est difficile et nécessite des essais robustes qui peuvent valider la spécificité et la puissance des inhibiteurs potentiels.
Cet article décrit un pipeline de trois méthodes qui fournissent une validation in vitro rigoureuse pour les nouveaux inhibiteurs de la HAT (HATi). Ces méthodes incluent un test hat de tube d’essai, l’essai d’inhibition d’hyperacétylation de chromatine (ChHAI), et le PCR immunoprécipitation-quantitative de chromatine (ChIP-qPCR). Dans l’essai hat, les HAT recombinants sont incubés avec des histones dans une réaction de tube à essai, permettant l’acétylation des résidus spécifiques de lysine sur les queues d’histone. Cette réaction peut être bloquée par un HATi et les niveaux relatifs d’acétylation d’histone spécifique au site peuvent être mesurés par immunoblotting. Les inhibiteurs identifiés dans l’essai de la HAT doivent être confirmés dans l’environnement cellulaire.
L’essai de ChHAI utilise l’immunoblotting pour dépister le nouveau HATi qui atténue l’hyperacétylation robuste des histones induite par un inhibiteur de la déacétylase d’histone (HDACi). L’ajout d’un HDACi est utile parce que les niveaux basaux de l’acétylation histone peut être difficile à détecter par immunoblotting.
Les tests HAT et ChHAI mesurent les changements globaux dans l’acétylation de l’histone, mais ne fournissent pas d’informations concernant l’acétylation dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, ChIP-qPCR est utilisé pour étudier les effets de HATi sur les niveaux d’acétylation de l’histone aux éléments de régulation des gènes. Ceci est accompli par l’immunoprécipitation sélective des complexes histone-ADN et l’analyse de l’ADN purifié par qPCR. Ensemble, ces trois essais permettent la validation minutieuse de la spécificité, de la puissance et du mécanisme d’action du nouveau HATi.
Introduction
Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les protéines histone et non-histone1,2,3,4. Des recherches récentes révèlent que les KAT et leur fonction d’acétyltransférase peuvent favoriser la croissance de tumeur solide4,5,6,7,8,9. Par exemple, les protéines liant le CREB (CBP)/p300 sont deux KAT paralogues qui régulent de nombreuses voies de signalisation dans le cancer2,3. CBP/p300 ont une fonction d’acétyltransférase d’histone bien caractérisée (HAT) et catalysent Histone 3 Lysine 27 acétylation (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marqueur important pour les exhausteurs actifs, les régions de promoteur et la transcription active de gène12,13,14. CBP/p300 servent de co-activateurs critiques pour les voies de signalisation pro-croissance dans les tumeurs solides en activant la transcription des oncogènes par acétylation des histones et d’autres facteurs de transcription4,9,15,16,17,18. En raison de leur rôle dans la progression de tumeur, CBP/p300 et d’autres KATs sont à l’étude pour le développement de nouveaux inhibiteurs qui bloquent leur fonction oncogène4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 et GNE-049 représentent deux tentatives réussies de développer des inhibiteurs puissants et spécifiques pour CBP/p3004,9. D’autres inhibiteurs font actuellement l’objet d’une enquête pour le CBP/p300 et d’autres TCA.
La qualité des inhibiteurs kat précédemment décrits (KATi) est remise en question, avec de nombreux inhibiteurs montrant les effets cibles et une mauvaise caractérisation21. Par conséquent, une caractérisation rigoureuse et la validation de nouveaux médicaments candidats sont essentielles au développement de sondes chimiques de haute qualité. Voici trois protocoles qui forment un pipeline pour le dépistage et la validation rigoureuse de la puissance et de la spécificité du nouveau KATi, avec un accent spécifique sur l’inhibition de la fonction HAT (HATi) des KAT. CBP/p300 et leurs inhibiteurs sont utilisés comme exemples, mais ces protocoles peuvent être adaptés pour d’autres KAT qui ont une fonction HAT7.
Le premier protocole est un test in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) qui utilise le p300 recombinant purifié et les histones dans une réaction contrôlée de tube à essai. Ce test est simple à effectuer, est rentable, peut être utilisé pour filtrer les composés dans un réglage à faible débit, et ne nécessite pas de matières radioactives. Dans ce protocole, le p300 recombinant catalyse l’acétylation de lysine sur les queues d’histone pendant une brève période d’incubation et les niveaux d’acétylation d’histone sont mesurés à l’aide de procédures standard d’immunoblotting. La réaction enzymatique peut être effectuée en présence ou en l’absence d’inhibiteurs CBP/p300 pour dépister les composés qui réduisent l’acétylation de l’histone. En outre, l’essai hat peut être utilisé pour vérifier si les nouveaux composés sont sélectifs pour le CBP/p300 en évaluant leur activité par rapport à d’autres KAT purifiés, tels que le PCAF. L’essai HAT est un excellent point de départ pour étudier de nouveaux inhibiteurs en raison de sa simplicité, faible coût, et la capacité de déterminer la puissance / sélectivité d’un inhibiteur. En effet, ce protocole est souvent utilisé dans la littérature comme un écran in vitro5,10. Cependant, les inhibiteurs identifiés dans l’essai hat ne sont pas toujours efficaces dans la culture cellulaire parce qu’une réaction de tube à essai est beaucoup plus simple qu’un système de cellules vivantes. Par conséquent, il est essentiel de caractériser davantage les inhibiteurs dans les expériences de culture cellulaire22,23.
Le deuxième protocole dans le pipeline est le test d’inhibition de l’hyperacétylation de la chrométine (ChHAI). Ce test à base de cellules utilise des inhibiteurs de la dacetylase histone (HDACi) comme un outil pour hyperacétiller les histones dans la chromatine avant co-incubation avec un HATi24. L’acétylation d’histone basal peut être faible dans la culture cellulaire, ce qui rend difficile de sonder pour par l’immunoblotting sans l’ajout d’un HDACi pour augmenter l’acétylation. Le but de l’essai de ChHAI est d’identifier le roman HATi qui peut atténuer l’augmentation de l’acétylation d’histone provoquée par l’inhibition de HDAC. Les avantages de cet essai incluent son faible coût, la facilité relative à effectuer, et l’utilisation des cellules dans la culture, qui fournit plus de pertinence physiologique que le test de hat de tube à essai. Semblable à l’essai HAT, ce protocole utilise l’immunoblotting standard pour la collecte de données.
Les tests HAT et ChHAI fournissent des données sur la puissance de nouveaux composés pour inhiber l’acétylation de l’histone globale, mais ne fournissent pas de perspicacité dans la façon dont ces composés affectent les modifications dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, le protocole final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) est une expérience de culture cellulaire qui étudie les interactions ADN-protéines à des régions spécifiques du génome. Dans le protocole ChIP, la chromatine est croisée pour préserver les interactions ADN-protéines. La chromatine est ensuite extraite des cellules et le complexe ADN-protéine subit une immunoprécipitation sélective pour la protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’un anticorps spécifique au H3K27ac). L’ADN est ensuite purifié et analysé à l’aide de qPCR. Par exemple, ChIP-qPCR peut être utilisé pour déterminer si un roman HATi downregulates histone acétylation à des oncogènes individuels, tels que Cyclin D125. Bien que ChIP-qPCR soit une technique courante utilisée sur le terrain, il peut être difficile d’optimiser4,,10,26. Ce protocole fournit des conseils pour éviter les pièges potentiels qui peuvent se produire lors de l’exécution de la procédure ChIP-qPCR et comprend des contrôles de qualité qui doivent être effectués sur les données.
Lorsqu’ils sont utilisés ensemble, ces trois protocoles permettent la caractérisation rigoureuse et la validation du nouveau HATi. En outre, ces méthodes offrent de nombreux avantages parce qu’elles sont faciles à exécuter, relativement bon marché et fournissent des données sur l’acétylation mondiale ainsi que régionale d’histone.
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Protocol
1. Essai in vitro de HAT
- Préparation tampon
REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes tampon.- Préparer le tampon d’essai 5x et le sulfate de Dodecyl de sodium (SDS) et conserver à -20 °C. Aliquot SDS en 1 mL aliquots.
- Préparer 10x gel SDS tampon de fonctionnement et 10x TBST et stocker à température ambiante.
- Préparer le tampon de transfert 1x et conserver à 4 °C.
ATTENTION : Vérifiez la fiche de données de sécurité pour tous les produits chimiques utilisés dans ce protocole. La SDS, la TNT et le bleu bromophénol sont toxiques et ne doivent pas être ingérés, inhalés ou exposés à la peau ou aux yeux. Veuillez consulter la fiche de données de sécurité pour les procédures de manipulation appropriées. S’il vous plaît utiliser un capot de fumée chimique pour la manipulation de produits chimiques dangereux.
- Réaction de HAT
REMARQUE : L’acide anacardique est un inhibiteur p300connu 3 et est utilisé comme exemple pour démontrer comment l’essai de la HAT peut identifier de nouveaux inhibiteurs du p300. Voir Protocole supplémentaire ( Schéma1) pour un schéma de l’étape 1.2.1.- Préparer la réaction enzymatique suivante dans un tube PCR de 0,2 mL : 2 μL de tampon d’analyse 5x, 1 μL de p300 purifié (0,19 μg/μL), 1 μL d’acide anacardique (HATi) ou de contrôle DMSO dilué dans un tampon d’essai 1x et 2 μL de ddH autoclaved2O. Préacuber ce mélange pendant 10 min à température ambiante. Ajouter ensuite 3 μL de 100 μM d’acétyl-coA et 1 μL de H3.1 purifié (0,2 μg/μL) à la réaction.
- Incuber le mélange de réaction complet à 30 °C pendant 1 h dans un cycleur thermique PCR.
- Ajouter 2-mercaptoéthanol à un rapport de 1:10 à la mémoire tampon échantillon SDS 6x.
- Retirer les échantillons du cycleur thermique PCR et ajouter 2 μL de SDS 6x (avec 2-mercaptoéthanol ajouté) au mélange de réaction.
ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé à l’intérieur d’un capot de fumée chimique. Veuillez consulter la fiche de données de sécurité pour une bonne manipulation. - Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 5 min sur un bloc de chaleur et refroidir sur la glace. Stockez les échantillons à -20 ou -80 °C ou effectuez l’électrophorèse de gel et l’immunoblotting comme indiqué ci-dessous.
- Électrophorèse de gel et immunoblotting
REMARQUE : Si vous n’êtes pas familier avec l’électrophorèse du gel et l’immunoblotting, consultez cette procédure standard27 pour plus de détails sur la façon d’effectuer les étapes 1.3.1-1.3.17. Des informations supplémentaires peuvent être trouvées ici28,29,30,31,32,33.- Pipette 10 μL d’échantillons (de l’étape 1.2.5.) dans les puits d’un gel polyacrylamide gradient de 4-20%. Pipette 5 μL d’échelle protéique dans l’un des puits comme référence de poids moléculaire. Exécutez le gel à 120 V pendant 90 min à l’aide d’un réservoir de gel.
- Transférer le gel dans une membrane de difluorure polyvinylidene (PVDF) à 100 V pendant 70 min à l’aide d’un réservoir de transfert.
- Retirez la membrane de l’appareil de transfert et placez-la dans un contenant en plastique. Bloquez la membrane en ajoutant 1x TBST (contenant 5 % de lait) au récipient et secouez doucement pendant 1 h à température ambiante.
- Retirez le TBST 1x de l’étape 1.3.3. Incuber la membrane pendant la nuit avec des anticorps acétyls spécifiques au site sélectionnés (p. ex., H3K18ac ou H3K27ac anticorps primaires à une dilution de 1:5 000 dans 1x TBST contenant 5% de lait) à 4 °C avec secousse douce.
- Retirez la solution d’anticorps primaire. Laver la membrane 2x avec 1x TBST (pas de lait) à température ambiante avec une secousse douce pendant 15 min chaque lavage.
- Diluer l’anticorps secondaire à 1:20 000 dans 1x TBST (contenant 5% de lait) et incuber la membrane pendant 1 h à température ambiante avec des secousses douces.
- Retirez la solution d’anticorps secondaires. Laver la membrane 2x avec 1x TBST (pas de lait) à température ambiante avec une secousse douce pendant 15 min chaque lavage.
- Égoutter le 1x TBST de la membrane. Mélanger la solution de peroxyde de substrat HRP et la solution de luminol de substrat de HRP dans un rapport de 1:1 (1 mL de chacun) et de la pipette 2 mL de la solution combinée à la surface de la membrane.
- Incuber la solution avec la membrane pendant 5 min à température ambiante.
- Égoutter l’excès de substrat chemiluminescent de la membrane sur une serviette en papier et placer la membrane dans une pellicule plastique à l’intérieur d’un porte-cassette à rayons X.
- Déplacez-vous dans une pièce sombre dédiée au traitement des films à rayons X. Exposer la membrane à un film à rayons X en plaçant le film sur la membrane et en fermant la cassette pendant 30 s.
REMARQUE : L’heure du contact entre le film et la membrane doit être déterminée expérimentalement. Les signaux forts auront besoin d’expositions courtes (secondes) et les signaux plus faibles peuvent avoir besoin d’expositions plus longues. - Retirez le film à rayons X de la cassette et traitez le film en le faisant passer par un processeur de film à rayons X. Consultez les manuels du fabricant pour obtenir des instructions spécifiques sur la façon de traiter le film à rayons X.
- Retirez la membrane de la pellicule plastique et lavez-la avec2O ddH pendant 5 min à température ambiante avec une secousse douce.
- Incuber la membrane avec 0,2 M De NaOH pendant 5 min à température ambiante avec une secousse douce.
- Laver la membrane avec ddH2O pendant 5 min à température ambiante avec une secousse douce.
- Bloquez la membrane en ajoutant 1x TBST (contenant 5 % de lait) au récipient et secouez doucement pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter la prochaine dilution primaire des anticorps (p. ex., sonder le H3K27ac si le premier anticorps utilisé était H3K18ac) et secouer pendant la nuit à 4 °C. Répétez les étapes 1.3.4-1.3.17 jusqu’à ce que toutes les sondes d’anticorps soient terminées.
2. Essai de ChHAI
- Traitements médicamenteux in vitro et analyse des histones acétylées
NOTE: A-485 est un puissant et bien caractérisé p300 HATi2,4 . Cet inhibiteur sera utilisé dans les essais restants en raison de son efficacité et de sa spécificité dans la culture cellulaire. MS-275 (Entinostat)24 est un HDACi qui augmente nettement les niveaux d’acétylation d’histone et est utilisé pour faciliter la détection des sondes d’acétylation avec l’immunoblotting standard. Voir Protocole supplémentaire (Schéma 2) pour un schéma des dilutions de médicaments utilisés à l’étape 2.1.- Semer 100 000 cellules MCF-7 dans une plaque de 12 puits et permettre aux cellules de croître jusqu’à 80-90% de confluence dans 1 mL de culture cellulaire moyenne. Marquer les puits pour la conception expérimentale suivante : puits 1 : contrôle DMSO (point de référence); puits 2: A-485 (3 μM); puits 3: A-485 (10 μM); bien 4: MS-275 (3 μM); puits 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); bien 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
REMARQUE : Pour cultiver des cellules MCF-7, utilisez un support DMEM complet et permettez aux cellules de croître à 37 °C avec 5 % de CO2. Voir le tableau 1 pour la recette complète de DMEM. - À 24 h après l’ensemencement, pipette 4 ml de support complet DMEM à un tube conique stérile de 15 mL. Pipette 2 μL de MS-275 (6 mM en DMSO) à 4 mL de milieu pour une concentration finale de 3 μM MS-275.
- Pipette 2 μL de DMSO à 4 ml de milieu dans un tube conique stérile séparé de 15 mL.
ATTENTION : Veuillez vérifier la fiche de données de sécurité pour la bonne gestion de DMSO. Certains types de gants ne sont pas évalués pour la manipulation de DMSO. - Aspirate le milieu de culture cellulaire des puits 4-6 et pipette 1 mL de 3 μM MS-275 en milieu (étape 2.1.2) à chaque puits. Jeter le MS-275 dilué inutilisé.
- Apirate le milieu de culture cellulaire des puits 1-3 et pipette 1 mL de DMSO dilué (étape 2.1.3) à chaque puits. Jeter DMSO dilué inutilisé.
- Remettre les cellules à l’incubateur et incuber pendant 4 h pour permettre l’accumulation d’histones acétylés dans les cellules exposées au MS-275 (puits 4-6).
NOTE: MS-275 est un HDACi et causera l’hyperacétylation histone24. Cette pré-incubation de 4 h est nécessaire pour permettre au MS-275 d’induire une hyperacétération avant l’ajout de L’A-485, ce qui réduit l’acétylation histone2,4. - Après 4 h d’incubation avec MS-275, préparer les dilutions suivantes dans des tubes stériles séparés de 1,5 mL par pipetage : 1,0 μL de DMSO à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL de DMSO et 0,5 μL A-485 (6 mM) à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL de DMSO et 0,5 μL d’A-485 (20 mM) à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL de DMSO et 0,5 μL de MS-275 (6 mM) à 1 mL de support DMEM; 0,5 μL d’A-485 (6 mM) et 0,5 μL de MS-275 (6 mM) à 1 mL de supportS DMEM; 0,5 μL d’A-485 (20 mM) et 0,5 μL de MS-275 (6 mM) à 1 mL de support DMEM.
- Apirate le milieu de culture cellulaire des puits 1-6 et pipette 1 mL de dilution 1 à puits 1, dilution 2 à bien 2, dilution 3 à puits 3, dilution 4 à bien 4, dilution 5 à puits 5, et dilution 6 à puits 6.
REMARQUE : Une règle générale consiste à équilibrer la teneur en DMSO (solvant) entre les groupes expérimentaux et à ne pas dépasser la teneur en DMSO de 0,1 % dans la culture cellulaire afin d’éviter la toxicité cellulaire et les changements de prolifération. - Retournez les cellules à l’incubateur et à la culture pendant 20 h.
- Après 20 h, aspirate le milieu de culture cellulaire des puits 1-6.
- Laver les cellules en canalisant 1 mL de PBS aux puits 1-6. L’aspirate du PBS.
- Ajouter 100 μL de tampon de lyse passive de 1x (voir tableau 1) aux puits 1-6. Stockez la plaque de culture cellulaire (avec des échantillons dans un tampon de lyse passive) à −80 °C pendant la nuit pour le gel-dégel et la lyse des cellules.
ATTENTION : Veuillez vérifier la fiche de données de sécurité pour tous les produits chimiques avant de fabriquer des tampons. CdTA peut causer de graves lésions oculaires et une irritation. - Décongeler les échantillons à température ambiante en secouant doucement pendant 10 min. Transférer les échantillons dans des tubes séparés de 1,5 mL et les placer immédiatement sur la glace.
- Mesurer la concentration de protéines de chaque échantillon. La concentration de protéines peut être déterminée à l’aide de plusieurs protocoles bien établis34.
- Équilibrer la concentration de protéines entre les échantillons 1-6 (dans un volume égal) à l’aide d’un tampon de lyse passive 1x pour diluer, au besoin.
- Ajouter 2-mercaptoéthanol à un rapport de 1:10 à 6x tampon échantillon SDS.
- Ajouter un tampon d’échantillon SDS 6x avec 2 mercaptoéthanol aux échantillons 1-6 à une concentration finale de tampon échantillon SDS 1x.
- Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 5 min sur un bloc de chaleur et refroidir sur la glace. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C ou -80 °C jusqu’à l’étape 2.1.19.
- Pipette un volume contenant 30 μg de protéines pour les échantillons 1-6 aux puits dans un gel polyacrylamide gradient de 4-20%. Effectuer la procédure d’immunoblotting selon le protocole décrit dans le protocole 1.
- Semer 100 000 cellules MCF-7 dans une plaque de 12 puits et permettre aux cellules de croître jusqu’à 80-90% de confluence dans 1 mL de culture cellulaire moyenne. Marquer les puits pour la conception expérimentale suivante : puits 1 : contrôle DMSO (point de référence); puits 2: A-485 (3 μM); puits 3: A-485 (10 μM); bien 4: MS-275 (3 μM); puits 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); bien 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
3. ChIP-qPCR
NOTE : Le protocole ci-dessous est décrit pour les inhibiteurs de p300 comme exemple.
- Préparation tampon
REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes tampon. Les étapes générales du protocole ChIP (p. ex. recettes tampons, temps de lavage et temps de centrifugation) ci-dessous sont modifiées et adaptées des recommandations du fabricant d’un kit disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)et de la documentation35,36.- Préparer le tampon de dilution chIP, tampon de gonflement des noyaux, tampon de lavage à faible sel, tampon de lavage de sel élevé, tampon de lavage de LiCl et tampon TE. Conserver à 4 °C.
- Préparer le tampon de lyse SDS, le tampon de glycine 10x et le tampon d’ellion chIP. Conserver à température ambiante.
ATTENTION : Veuillez vérifier la fiche de données de sécurité pour tous les produits chimiques avant de fabriquer des tampons pour assurer une bonne manipulation.
- Traitement médicamenteux
REMARQUE : Voir Protocole supplémentaire (Schéma 3) pour un schéma des dilutions de médicaments utilisés à l’étape 3.2.- Seed MCF-7 cells in two 15 cm culture lacks and grow cells to 90% confluence in 12 mL of the complete DMEM medium. Marquez les plats pour la conception expérimentale suivante : Plat 1 : contrôle DMSO (point de référence); Plat 2: A-485 (3 μM).
REMARQUE : Pour cultiver des cellules MCF-7, utilisez des supports DMEM complets et développez à 37 °C avec 5 % de CO2. Voir le tableau 1 pour la recette complète de DMEM. - Dans un tube conique stérile de 15 mL, pipette 12 ml de support DMEM et pipette 6 μL de DMSO. Bien mélanger.
- Dans un tube conique stérile séparé de 15 mL, la pipette 12 ml de support DMEM et la pipette 6 μL d’A-485 (6 mM en DMSO) pour obtenir une concentration finale de 3 μM A-485. Bien mélanger.
- Apirate les médias des plats 1 et 2.
- Ajouter les 12 mL de DMSO dilué dans DMEM (étape 3.2.2.) au plat 1.
- Ajouter les 12 mL de 3 μM A-485 dans DMEM (étape 3.2.3.) au plat 2.
- Remettre les plats de culture cellulaire à l’incubateur et incuber pendant 24 h.
- Seed MCF-7 cells in two 15 cm culture lacks and grow cells to 90% confluence in 12 mL of the complete DMEM medium. Marquez les plats pour la conception expérimentale suivante : Plat 1 : contrôle DMSO (point de référence); Plat 2: A-485 (3 μM).
- Fixation cellulaire
- Pipette 330 μL (27,5 μL par mL) de 37 % de formaldéhyde au milieu complet et agiter doucement la plaque pour mélanger.
ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Veuillez consulter la fiche de données de sécurité pour les procédures de manipulation appropriées. - Incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Pipette 2 mL de glycine 10x à l’assiette et tourbillonner pour mélanger.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Après l’incubation, déposer les plats sur la glace et décongeler un aliquot de cocktail inhibiteur de la protéase.
- Préparer les solutions suivantes pour les échantillons DMSO et A-485 à l’aide des tampons préparés à l’étape 3.1.
- 2 mL de PBS avec une dilution de 1:1,000 du cocktail inhibiteur de la protéase
- 1 mL de tampon de gonflement des noyaux avec une dilution de 1:1,000 du cocktail inhibiteur de la protéase
- 0,5 mL de tampon de lyse SDS avec une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de la protéase
- Apirate les médias de la vaisselle de culture cellulaire et laver les cellules deux fois avec 15 mL de PBS froid.
- Pipette 2 mL de PBS avec le cocktail inhibiteur de la protéase (étape 3.3.6.1) aux plats de culture cellulaire. Soulevez les cellules dans la solution à l’aide d’un grattoir cellulaire.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge. Recueillir les cellules restantes avec pbs supplémentaires si nécessaire.
- Tubes de rotation à 800 x g à 4 °C pendant 5 min pour granuler les cellules.
- Remplacer le supernatant et la pipette 1 mL de tampon de gonflement des noyaux avec le cocktail inhibiteur de la protéase (étape 3.3.6.2) jusqu’au granulé. Resuspendez le granulé et incuber sur la glace pendant 10 min.
- Centrifugez les tubes à 2 700 x g à 4 °C pendant 5 min à granulés.
- Remplacer le supernatant et la pipette 0,5 mL du tampon de lyse SDS avec le cocktail inhibiteur de la protéase (étape 3.3.6.3) jusqu’au granulé. Resuspendez le granulé et incuber sur la glace pendant 10 min.
- Conserver les échantillons de chromatine à -80 °C jusqu’à l’étape 3.4.1 ou passer immédiatement à l’étape 3.4.
- Pipette 330 μL (27,5 μL par mL) de 37 % de formaldéhyde au milieu complet et agiter doucement la plaque pour mélanger.
- Sonication de l’ADN
- Transférer 130 μL de chromatine de l’échantillon DMSO (étape 3.3.14) à deux tubes de sonication de l’ADN à l’aide d’une pipette (130 μL chacun).
- Transférer 130 μL de chromatine de l’échantillon A-485 (étape 3.3.14) à deux tubes de sonication de l’ADN à l’aide d’une pipette (130 μL chacun).
- Sonicate l’ADN à environ 150-200 fragments de paire de base en utilisant les paramètres sonicator suivants: Peak Incident Power (W) de 175, Facteur de service de 10%, 200 cycles par rafale et 430 s temps de traitement.
REMARQUE : Les paramètres de sonication peuvent différer entre les modèles et les paramètres peuvent devoir être ajustés pour obtenir la taille appropriée des fragments pour différentes lignées cellulaires. - Gardez les échantillons sur la glace après la sonication.
- Transférer la chromatine sonique à un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et d’une centrifugeuse à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min à des débris de granulés.
- Pipette le supernatant (contient de la chromatine sonique) à un nouveau tube et jeter les débris. La chromatine sonique peut être stockée à -80 °C.
- Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
REMARQUE : Voir Protocole supplémentaire (Schéma 3) pour un schéma des groupes ip à l’étape 3.5.- Mesurer la teneur en protéines de la chromatine sonique pour les échantillons DMSO et A-485 de l’étape 3.4.6. La teneur en protéines peut être mesurée à l’aide de protocoles bien établis34.
REMARQUE : Par souci de simplicité, ce protocole suppose que la teneur en protéines est égale et que 100 μL de chromatine sonique seront utilisés. Dans le cas contraire, la teneur en protéines devra être équilibrée entre tous les échantillons dans un volume égal. - Pipette 100 μL de chromatine sonique DMSO à deux tubes de 1,5 mL (100 μL chacun). Pipette 400 μL de tampon de dilution ChIP (contenant une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de la protéase) à chaque tube pour porter le volume total à 500 μL. Retirez 5 μL de la solution d’un des tubes et rangez-le à -20 °C sous forme d’entrée DMSO.
- Pipette 100 μL de chromatine sonique A-485 à deux tubes de 1,5 mL (100 μL chacun). Pipette 400 μL de tampon de dilution chIP (contenant une dilution de 1:1000 du cocktail inhibiteur de la protéase) à chaque tube pour porter le volume total à 500 μL. Retirer 5 μL de la solution d’un des tubes et conserver à -20 °C sous forme d’entrée A-485.
- À l’aide d’une pipette, ajouter l’anticorps d’immunoprécipitation (IP) (p. ex. contrôle igg non spécifique ou anticorps spécifique h3K27ac) aux tubes correspondants pour les échantillons DMSO et A-485 : IP #1 chromatine DMSO avec anticorps IgG (5-10 μg); IP #2 chromatine DMSO avec anticorps H3K27ac (5-10 μg); IP #3 la chromatine A-485 avec anticorps IgG (5-10 μg); IP #4 la chromatine A-485 avec l’anticorps H3K27ac (5-10 μg).
- Ajouter 20 μL de protéineS A perles magnétiques à chaque tube. Assurez-vous que les perles sont bien resuspendées.
- Faire pivoter les échantillons pendant la nuit à 4 °C.
- Pelleter la protéine Perles magnétiques À l’aide d’un séparateur magnétique et enlever le supernatant. Ne pas déranger les perles.
- Laver les perles avec 500 μL à 1 mL du tampon de lavage à faible teneur en sel et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un spin vers le bas rapide, pellet les perles à l’aide d’un séparateur magnétique, et enlever le supernatant.
- Laver les perles avec 500 μL à 1 mL du tampon de lavage à haute teneur en sel et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un spin vers le bas rapide, pellet les perles à l’aide d’un séparateur magnétique, et enlever le supernatant.
- Laver les perles avec 500 μL à 1 mL du tampon de lavage LiCl et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un spin vers le bas rapide, pellet les perles à l’aide d’un séparateur magnétique, et enlever le supernatant.
- Laver les perles avec 500 μL à 1 mL de tampon TE et tourner pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un rapide spin vers le bas. Conservez les perles dans la mémoire tampon TE jusqu’à l’étape 3.5.14.
- Retirer les échantillons d’entrée (des étapes 3.5.2 et 3.5.3) du congélateur et les conserver sur la glace.
- Décongeler un aliquot de Proteinase K.
- Pelleter les perles à l’aide d’un séparateur magnétique et retirer le tampon TE des perles (à partir de l’étape 3.5.11).
- Ajoutez 100 tampon d’olution chIP de μL + 1 μL de Proteinase K à chaque échantillon, y compris les échantillons d’entrée. Incuber des échantillons avec des secousses à 62 °C pendant 2 h à l’aide d’un thermocycleur.
- Après 2 h, chauffer les échantillons jusqu’à 95 °C pendant 10 min à l’aide d’un thermocycleur.
- Refroidir les échantillons à température ambiante.
- Perles magnétiques de granulés utilisant un séparateur magnétique et supernatant de transfert (contient l’ADN d’intérêt) à un nouveau tube de 1.5 mL.
- Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage PCR standard.
- L’ADN purifié peut être stocké à -20 °C et peut être utilisé comme modèles dans les protocoles qPCR standard. Suivez les protocoles du fabricant pour l’exécution de qPCR.
- Mesurer la teneur en protéines de la chromatine sonique pour les échantillons DMSO et A-485 de l’étape 3.4.6. La teneur en protéines peut être mesurée à l’aide de protocoles bien établis34.
- Analyse des données ChIP-qPCR
REMARQUE : Deux méthodes courantes pour analyser les résultats de ChIP-qPCR sont l’enrichissement de pli sur l’anticorps IgG et la méthode d’entrée de 1%. Un excellent modèle pour les deux méthodes d’analyse est fourni par une source commerciale peut être utilisé pour calculer rapidement l’enrichissement de pliage pour chaque anticorps IP / cible d’intérêt37.- Pour calculer l’enrichissement du pliage et % d’entrée, copiez et collez les valeurs ΔCt à partir des données qPCR obtenues pour chaque anticorps (IgG non spécifique, anticorps IP H3K27ac et 1% d’entrée) dans la région correspondante du modèle d’analyse et le cumul de l’apport en enrichissement et rendement sera automatiquement rempli.
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Representative Results
L’essai in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) peut être employé pour sonder pour des composés qui inhibent l’activité de p300 HAT vers un substrat d’histone. La figure 1A fournit un schéma expérimental pour l’essai HAT. L’acide anacardique, un HATi3,38connu, a été utilisé dans ce test dans une gamme de concentration de 12,5 à 100 μM. À 100 μM, l’acide anacardique descend par la p300 catalysé l’acétylation de l’histone à Histone 3, Lysines 9 et 18 par rapport au traitement DMSO de contrôle(figure 1B, voie 5 contre voie 1). Une plage de concentration a été utilisée dans ce test parce que des doses plus faibles de médicaments peuvent ne pas nuire grandement à l’activité du P300 HAT(figure 1B, voies 2-4 par rapport à la voie 1). Dans la voie 6, aucun Acétyl-CoA n’a été ajouté à la réaction et sert de contrôle négatif pour la catalyse p300 et pour les niveaux basaux d’acétylation d’histone sur le recombinant H3.1 (figure 1B). Les niveaux de protéines p300 et H3.1 ont été utilisés comme contrôles de chargement (figure 1B). Ces résultats immunoblot ont été quantifiés à l’aide d’ImageJ39 (Figure 1C). Les changements de pliage ont été calculés en comparant l’intensité de bande de chaque échantillon à l’intensité de bande du contrôle DMSO pour chaque sonde d’acétylation. La quantification de l’acide anacardique à 100 μM montre une réduction puissante du H3K18ac et du H3K9ac par rapport au contrôle DMSO, confirmant les résultats visuels de la figure 1B.
Dans le test d’inhibition de l’hyperacétylation de la chromatine (ChHAI), HDACi est utilisé comme outil pour hyperacétiller les histones dans la chromatine avant la co-incubation avec un HATi24, comme l’inhibiteur p300 A-4852,4. Le but de cet essai est de déterminer l’efficacité de HATi pour atténuer l’hyperacétalité d’histone induite par HDACi. La figure 2A fournit un schéma expérimental pour l’essai de ChHAI. Dans ce test, le traitement des cellules MCF-7 avec HDACi MS-275 fortement upregulé l’acétylation sur Histone 3, sur plusieurs résidus de lysine (figure 2B, voie 4 contre voie 1). Les niveaux basaux de H3K18ac et H3K27ac étaient faibles, ce qui montre les avantages de l’ajout d’un HDACi dans le test de ChHAI (figure 2B, voies 1-3). L’ajout de L’A-485 avec MS-275 atténue l’acétylation accrue de l’histone à H3K18 et H3K27, mais pas H3K9(figure 2B, voies 4-6). Fait important, H3K9ac n’est pas réglementé par p300 dans la culture cellulaire2, montrant la spécificité de A-485 dans cette expérience. Ces résultats immunoblot ont été quantifiés à la figure 2C. Les changements de pliage ont été calculés en comparant l’intensité de la bande de chaque échantillon à l’intensité de la bande de MS-275 seul (Lane 4) pour chaque sonde d’acétylation. Les voies 1 à 3 n’ont pas été quantifiées parce que les niveaux basal H3K18ac et H3K27ac n’ont pas été détectés.
La réaction en chaîne de polymérase quantitative de la chrominase (ChIP-qPCR) est une expérience de culture cellulaire qui étudie les interactions ADN-protéine dans des régions spécifiques du génome. Il peut être utilisé pour étudier les effets de HATi aux éléments de régulation des gènes qui contrôlent l’expression oncogène25. La figure 3A fournit un schéma expérimental pour le protocole ChIP-qPCR. Les cellules MCF-7 traitées avec 3 μM A-485 pendant 24 heures ont été soumises au ChIP-qPCR par immunoprécipitation de complexes histone-ADN enrichis en H3K27ac (figure 3). L’ADN purifié a été analysé pour la séquence de promoteur de Cyclin D1. Les amorces ChIP-qPCR sont conçues contre une séquence d’ADN spécifique dans le génome et sont utilisées pour détecter la quantité relative d’ADN précipité. La quantité d’ADN précipité reflète l’abondance de la protéine d’intérêt à la région génomique à l’étude. En effet, dans l’échantillon DMSO, l’ADN précipité par l’anticorps témoin IgG produit une valeur Ct plus élevée que l’anticorps H3K27ac dans la réaction qPCR pour le promoteur de Cyclin D1 (Figure 3B). Ceci indique que le contrôle non spécifique d’IgG a précipité moins de complexes d’ADN-protéine que l’anticorps spécifique de H3K27ac au promoteur de Cyclin D1. Cela se traduit par un enrichissement de 632,73 fois de H3K27ac par rapport au contrôle IgG non spécifique (figure 3B).
Cet enrichissement de pli fournit la preuve que l’anticorps spécifique H3K27ac avec succès hétones acétylées immunoprécipitées et que H3K27ac est enrichi au promoteur de Cyclin D1. Après validation de la qualité de l’anticorps H3K27ac, une comparaison peut être faite entre les groupes traités DMSO et A-485. Comme le montre la figure 3C, A-485 réduit l’enrichissement du H3K27ac au promoteur Cyclin D1 par rapport au contrôle DMSO à l’aide de la méthode %Input (résultat représentatif de n=2). Fait important, A-485 est connu pour réduire considérablement H3K27ac dans la culture cellulaire2,4.
ChIP-qPCR premières %Les valeurs d’entrée peuvent être très variables entre les répliques biologiques indépendantes, malgré la tendance expérimentale reproductible. Par conséquent, il peut être utile de présenter les données comme un pourcentage normalisé de contrôle DMSO pour montrer le rapport reproductible entre le contrôle et le traitement médicamenteux10. Par exemple, dans la figure 3D, A-485 réduit considérablement l’occupation du H3K27ac au promoteur Cyclin D1 (n=2). L’analyse statistique était basée sur le t-test de l’étudiant (*P < 0,05).
Figure 1 : L’acide anacardique inhibe l’activité enzymatique p300 dans un test HAT. (A) Diagramme schématique de l’essai HAT, illustrant la réaction enzymatique. (B) L’acide anacardique a inhibé efficacement l’activité enzymatique p300 et l’acétylation d’histone en panne à H3K18 et H3K9 à 100 μM (voie 5) par rapport au traitement de contrôle DMSO (voie 1). Lane 6 manque d’acétyl-CoA dans la réaction et a servi de contrôle négatif pour l’acétylation histone. (C) Les résultats de l’immunoblot (B) ont été quantifiés. Les changements de pliage ont été calculés en comparant l’intensité de bande de chaque échantillon à l’intensité de bande du contrôle DMSO pour chaque sonde d’acétylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : l’inhibiteur p300 A-485 atténue efficacement l’hyperacétylation d’histone dans l’essai de ChHAI. (A) Diagramme schématique de l’essai de ChHAI. (B) Dans les cellules MCF-7, inhibiteur du HDAC MS-275 à l’acétylation de l’histone à H3K18, K27 et K9 (voie 4) par rapport au contrôle DMSO (voie 1). L’ajout d’A-485, un inhibiteur connu de la HAT p300, avec le MS-275 a atténué l’augmentation de l’acétylation de l’histone à H3K18 et K27, mais pas H3K9 (voies 5-6 contre la voie 4). (C) Les résultats de l’immunoblot (B) ont été quantifiés. Les changements de pliage ont été calculés en comparant l’intensité de la bande de chaque échantillon à l’intensité de la bande de MS-275 seul (Lane 4) pour chaque sonde d’acétylation. Les voies 1 à 3 n’ont pas été quantifiées parce que les niveaux basal H3K18ac et H3K27ac n’ont pas été détectés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : l’inhibiteur du p300 A-485 diminue les niveaux de H3K27ac au promoteur de Cyclin D1 mesurés par ChIP-qPCR. (A) Diagramme schématique du protocole ChIP-qPCR. (B) Valeurs QPCR Ct représentatives pour le promoteur Cyclin D1 pour les immunoprécipitations IgG et H3K27ac. Le contrôle IgG avait une valeur Ct plus élevée, indiquant que l’anticorps H3K27ac s’est enrichi avec succès pour H3K27ac sur l’anticorps IgG non spécifique. (C) Traitement A-485 (3 μM) pour 24 h de 24 h de H3K27ac à l’organisme de régulation Cyclin D1 par rapport au traitement de contrôle DMSO dans les cellules MCF-7 (résultat représentatif de n=2). (D) Le %Input de deux expériences ChIP indépendantes a été normalisé au contrôle DMSO en pourcentage du contrôle DMSO. Le traitement avec A-485 dans les cellules MCF-7 diminue significativement l’occupation de H3K27ac au promoteur de Cyclin D1. L’analyse statistique était basée sur le t-test de l’étudiant (*P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon | Recette | |
| Tampon de glycine 10X | 18,74 g de glycine avec PBS jusqu’à dissolution et ajouter le PBS à 200 ml. | |
| Tampon 10X en cours d’exécution | 250 mM Tris, 1,9 M de glycine, 1% SDS Dissoudre 30,0 g de tris, 144,0 g de glycine et 10,0 g de SDS dans 1000 ml de H2O. Le pH de la mémoire tampon doit être de 8,3 et aucun ajustement du pH n’est nécessaire. Stockez le tampon en cours d’exécution à température ambiante et diluez à 1X avant utilisation. |
|
| 10X TBST | 2,42 g de tris de base, 8g de NaCl, 2 ml de 50% Tween 20, ajouter ddH2O à 1 litre | |
| 1X TBST avec 5% de lait | 5g de lait en poudre par environ 100 ml de 1X TBST | |
| Tampon 5X d’analyse : | 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100 | |
| Tampon de lyse passive 5X | faire un stock aqueux contenant 125 mM Tris, pH 7,8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 et 50% (vol/vol) glycérol en ddH2O. | |
| 6X Sulfate de Dodecyl de sodium (SDS) | 0.375 M Tris pH 6.8, 6 ml de glycérol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (TNT), 6 mg de bleu bromophénol, ajouter de l’eau à 10 ml. | |
| Tampon de dilution ChIP | 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl | |
| Tampon d’ellion chip | 1% SDS (w/v) et 0,1 M NaHCO3 en ddH2O autoclaved | |
| DMEM complet pour les cellules MCF-7 : | Le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un sérum de veau bovin à 10 % (BCS), une pénicilline (10 unités/ml) et une streptomycine (10 mg/ml) | |
| Tampon de lavage de sel élevé | 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl. | |
| Tampon de lavage LiCl | 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% désoxycholate de sodium, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0. | |
| Tampon de lavage à faible teneur en sel | 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl. | |
| Tampon de gonflement des noyaux | 5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40 | |
| Tampon de lyse SDS | 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 | |
| Mémoire tampon TE | 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. | |
| Tampon de transfert | 25 mM Tris, 190 mM de glycine, 20% de méthanol et vérifier le pH et ajuster au pH 8.3 si nécessaire. | |
Tableau 1 : Recettes des tampons et solutions utilisées.
Fichiers supplémentaires : Schémas expérimentaux supplémentaires pour les protocoles 1-3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Lysine acétyltransférases (KATs) acetylate plusieurs résidus de lysine sur les queues d’histone et les facteurs de transcription pour réguler la transcriptiongénique 2,3. Les travaux des deux dernières décennies ont révélé que les KAT, tels que CBP/p300, PCAF et GCN5, interagissent avec les facteurs de transcription oncogène et aident à stimuler la croissance tumorale dans plusieurs types de tumeurs solides4,5,9,15,16,17,18. En raison de leur rôle émergent dans la promotion de la croissance tumorale, kats sont étudiés comme de nouvelles cibles dans le traitement du cancer. Les nouveaux inhibiteurs de KAT (KATi) doivent être soigneusement et rigoureusement testés pour la puissance, la sélectivité et la sécurité avant de passer à l’utilisation dans la clinique. Des preuves récentes ont montré que les composés KATi précédemment décrits présentent des effets cibles et ont été mal caractérisés avant d’être largement utilisés dans la littérature scientifique comme sondes chimiques21. Par conséquent, des méthodes rigoureuses sont nécessaires pour la caractérisation KATi. Décrits ici sont trois protocoles qui peuvent être utilisés ensemble pour caractériser et valider de nouveaux inhibiteurs ciblant la fonction d’acétyltransférase histone (HAT) des KATs : un test hat in vitro, l’essai de ChHAI, et ChIP-qPCR. Ces protocoles utilisent CBP/p300 et leurs inhibiteurs comme exemples, mais ces méthodes peuvent facilement être adaptées pour une application future dans l’enquête sur d’autres KAT.
L’essai HAT est simple et un moyen rentable de filtrer les composés pour la puissance dans l’inhibition de la fonction HAT dans un tube à essai. Les HATs purifiés (recombinants4,,10 ou immunoprécipités40)peuvent être testés dans ce test, mais le CBP/p300 recombinant est utilisé comme exemple dans ce protocole. CBP/p300 ont un domaine HAT enzymatique qui transfère un groupe d’acétyl de l’acétyl-CoA à un résidu de lysine sur un substrat cible3. Les cibles d’histone CBP/p300 les plus caractérisées sont Histone 3 Lysine 18 et 27 (H3K18 et H3K27, respectivement)2,3,10,11. Dans l’essai HAT, le domaine p300 HAT purifié est incubé avec acétyl-coA et histone 3.1 comme substrat. Pendant la période d’incubation, le p300 catalysera l’acétylation sur plusieurs résidus H3.1, dont H3K18 et H3K27. L’abondance relative de l’acétylation sur ces résidus peut être mesurée par immunoblotting. Cette réaction de tube à essai peut être employée pour dépister de nouveaux composés qui se lient à p300 et inhibent son activité de HAT (HATi). Par exemple, l’acide anacardique, un HATi38connu, puissamment downregule l’acétylation de l’histone à la fois H3K18 et H3K9 par rapport au contrôle DMSO (Figure 1B, voie 5 contre voie 1). Il est d’une importance cruciale d’ajouter l’acétyl-CoA aux réactions expérimentales(figure 1B, voies 1-5) ou catalyse p300 de l’acétylation de l’histone ne se produira pas (Figure 1B, Lane 6). L’absence d’acétyl-CoA peut également être utilisée comme un contrôle négatif pour la catalyse p300 et pour les niveaux basaux de l’acétylation d’histone sur le recombinant H3.1.
Lors de l’exécution de l’essai HAT, il est important de s’assurer que chaque réaction reçoit la même quantité de p300, H3.1 et Acétyl-CoA. Les niveaux H3.1 et p300 dans l’immunoblot servent de commandes de chargement pour le gel. Pour ce test, des anticorps d’acétyle histone spécifiques au site ou un anticorps pan-acétyl peuvent être utilisés pour l’immunoblotting. Lors de l’optimisation pour améliorer la qualité de l’immunoblot, il est crucial d’utiliser des anticorps validés pour l’immunoblotage et de suivre d’abord les recommandations du fabricant pour la dilution des anticorps. Les dilutions d’anticorps utilisées dans la section Protocole sont à référence et les dilutions peuvent être modifiées en fonction des résultats des expériences initiales (p. ex., si le signal est trop fort, l’anticorps peut être dilué davantage). En raison de sa simplicité, l’essai HAT est une excellente expérience de départ pour le dépistage de nouveaux inhibiteurs. Toutefois, l’essai hat a des inconvénients. Une préoccupation majeure avec l’essai hat est que les composés qui sont efficaces dans un tube à essai peut s’avérer inefficace dans un système vivant. Il s’agit d’un problème parce que l’efficacité composée dans la culture cellulaire peut être modifiée par des problèmes de perméabilité cellulaire, le métabolisme cellulaire, et la stabilité des composés. En outre, les KAT, en particulier CBP/p300, ont de nombreuses interactions protéines-protéines qui régulent leur activité KAT dans la culture cellulaire3,41,42. Par conséquent, il est essentiel de caractériser davantage les inhibiteurs identifiés dans l’essai HAT dans les expériences de culture cellulaire20,23.
L’essai d’inhibition de l’hyperacétylation de la chromatine (ChHAI) est le deuxième protocole dans le pipeline et est utile pour valider les effets de nouveaux inhibiteurs dans la culture cellulaire. Ce test utilise des inhibiteurs du HDAC (HDACi)24 pour induire une hyperacétylation de l’histone dans les cellules parce que l’acétylation basale peut être trop faible pour être détectée sur un immunoblot. Les lignées cellulaires de choix sont pré-incubées avec un HDACi pour permettre l’accumulation de chromatine acétylée avant l’ajout d’un HATi. Après co-incubation du HDACi et du HATi, les cellules sont lysées et soumises à des procédures d’immunoblotting standard pour des sites spécifiques d’acétylation d’histone. Le but de cet essai est de déterminer l’efficacité du roman HATi pour atténuer l’hyperacétalité de l’histone induite par HDACi. Les cellules exposées au HDACi devraient avoir des niveaux significativement plus élevés d’acétylation d’histone que les cellules exposées au solvant DMSO(figure 2B, voie 4 contre voie 1). On s’attend à ce que l’ajout du HATi avec le HDACi réduise le signal d’immunoblot par rapport au traitement HDACi seul(figure 2B, voies 5-6 par rapport à la voie 4). Les niveaux basaux d’acétylationd’histone (figure 2B, voies 1-3) sont difficiles à détecter et soulignent l’importance d’ajouter un HDACi dans ce protocole. MS-275 (Entinostat) est utilisé comme exemple, mais d’autres HDACi peuvent être utilisés24,43. MS-275 a des concentrations inhibitrices déclarées variables par rapport aux HDAC de classe I et inhibe généralement HDAC1 et HDAC3 avec des concentrations nanomolaires à faibles micromolaires, respectivement43,44. Un large éventail de concentrations de MS-275 est utilisé dans la littérature45,46,47, mais un traitement de 3 μM fournit une augmentation robuste et reproductible de l’acétylation de l’histone dans les cellules MCF-7. Par conséquent, il peut être bénéfique d’effectuer un écran initial avec un large éventail de concentrations HDACi et HATi pour déterminer la concentration optimale pour l’essai ChHAI lors de l’utilisation d’une ligne cellulaire différente.
À l’instar de l’essai HAT, le protocole immunoblot peut devoir être optimisé pour obtenir des résultats de qualité grâce à l’utilisation d’anticorps appropriés, à des dilutions optimales d’anticorps et à une charge d’échantillon soigneusement contrôlée. La charge d’échantillon soigneusement contrôlée est essentielle au succès de ce protocole et peut être obtenue en équilibrant la teneur en protéines de tous les échantillons et en canalisationant un volume égal d’échantillons dans les puits du gel immunoblot. Un anticorps pan-acétyl peut être utilisé pour sonder dans ce protocole. Cependant, il devrait être complété par des anticorps acétyls spécifiques au site parce que les KAT ont une spécificité pour certains résidus de lysine histone et HATi n’affecte pas tous les sites d’acétylation histone dans la culture cellulaire1,2,4,5,10,11. Les inhibiteurs qui sont puissants à réduire l’acétylation d’histone dans les essais de HAT et de ChHAI sont des candidats forts pour l’évaluation plus poussée. Fait important, les tests HAT et ChHAI ont la limite de fournir uniquement des données sur les changements globaux dans l’acétylation histone. Cette limitation crée la nécessité de caractériser les effets du nouveau HATi dans des régions spécifiques du génome.
La réaction en chaîne de polymérase quantitative de la chrométine (ChIP-qPCR) est le protocole final dans le pipeline et évalue les interactions ADN-protéine dans des régions spécifiques du génome. Dans ce test, les régions génomiques enrichies en H3K27ac sont purifiées par l’immunoprécipitation (IP) et analysées à l’aide d’amorces d’ADN dans qPCR. Cette technique fournit un aperçu mécaniste de la façon dont HATi affecte les modifications histones chez les promoteurs de gènes et les exhausteurs. ChIP-qPCR est une technique robuste et moins coûteuse que le séquençage du génome entier (p. ex., ChIP-seq), mais il peut être difficile d’optimiser en raison de nombreuses étapes qui affectent le résultat. L’étape la plus difficile à optimiser correctement est l’étape 3.5, l’immunoprécipitation. Cette étape est difficile à optimiser car si l’ADN purifié à l’étape 3.5.20 est fortement dilué, il peut provoquer de mauvais résultats dans la réaction qPCR (par exemple, pas d’amplification de la séquence du gène cible et des valeurs ΔCt très élevées). Le succès de l’étape de la propriété intellectuelle dépend de plusieurs facteurs, tels que l’abondance de la cible protéique d’intérêt et la qualité de l’anticorps IP. Il est crucial de valider la qualité de l’anticorps IP H3K27ac par rapport au contrôle IgG pour vérifier le succès de l’étape IP. Par exemple, à la figure 3B, l’anticorps spécifique H3K27ac affiche un enrichissement 632,73 fois par rapport au contrôle IgG non spécifique. Cela indique que l’anticorps H3K27ac est de haute qualité et que H3K27ac est enrichi au promoteur Cyclin D1. Après validation de l’anticorps IP, une comparaison peut être faite entre les groupes traités par le DMSO et l’A-485. Comme le montre la figure 3C, A-485 réduit l’enrichissement du H3K27ac au promoteur Cyclin D1 par rapport au contrôle DMSO à l’aide de la méthode %Input (résultat représentatif de n=2). Si l’anticorps IP s’avère de faible qualité et ne montre pas l’enrichissement du pli dans les expériences initiales, essayez d’augmenter le nombre de cellules à l’étape 3.2.1. Un nombre plus élevé de cellules peut aider à compenser la mauvaise qualité des anticorps en augmentant la teneur totale en protéines du lysate et permettra d’ajouter plus de protéines à la réaction ip.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts ou de divulgations à faire.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par des subventions de James et Esther King Biomedical Research Program (6JK03 et 20K07), et Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 et 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, et UF Health Cancer Center. De plus, nous tenons à remercier le Dr Zachary Osking et le Dr Andrea Lin pour leur soutien au cours du processus de publication.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
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