Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

Abstract

לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילציה זליזה של שאריות לינזין על היסטונים וחלבונים אחרים לווסת דינמיקה כרומטין וביטוי גנים. KATs, כגון CBP/p300, נמצאים תחת חקירה אינטנסיבית כיוקדים טיפוליים בשל תפקידם הקריטי בגידולים של סוגי סרטן מגוונים. הפיתוח של מעכבי מולקולה קטנה רומן מיקוד התפקוד אצטילטרנספראז histone (HAT) של KATs הוא מאתגר ודורש תסרוקות חזקות שיכולות לאמת את הספציפיות והעוצמה של מעכבים פוטנציאליים.

מאמר זה מתאר צינור של שלוש שיטות המספקות אימות קפדני במבחנה עבור מעכבי HAT חדשניים (HATi). שיטות אלה כוללות צינור הבדיקה כובע אסיי, כרומטין Hyperacetylation עיכוב (ChHAI) אסיא, ו PCR כמותי חיסוני כרומטין (ChIP-qPCR). ב-HAT ASSay, ה-HATs הרקומביננטיים מצופים בהסטונים בתגובה למבחנה, ומאפשרים אצטילציה של שאריות לינזין ספציפיות על זנבות האבן. תגובה זו יכולה להיות חסומה על ידי HATi ואת הרמות היחסיות של אצטילציה היסטון ספציפית לאתר ניתן למדוד באמצעות immunoblotting. מעכבים שזוהו ב-HAT Assay צריכים להיות מאושרים בסביבה הסלולרית.

אסיי ChHAI משתמש immunoblotting למסך עבור הרומן HATi כי להקטין את hyperacetylation חזק של היסטונים המושרה על ידי מעכב deacetylase histone (HDACi). התוספת של HDACi הוא מועיל כי רמות בסיס של אצטילציה histone יכול להיות קשה לזהות באמצעות immunoblotting.

ה-HAT ו-ChHAI מודדים שינויים גלובליים באצטילציה של היסטון, אך אינם מספקים מידע אודות אצטילציה באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, ChIP-qPCR משמש כדי לחקור את ההשפעות של HATi על רמות אצטילציה histone באלמנטים רגולטוריים גנים. זה מושג באמצעות פירוק חיסוני סלקטיבי של תסביכות היסטון-DNA וניתוח של ה-DNA המטוהר באמצעות qPCR. יחד, שלוש האמורות הללו מאפשרות אימות זהיר של הספציפיות, העוצמה והמנגנון של הפעולה של הרומן HATi.

Introduction

לייסין אצטילtransferases (KATs) לדלל את האצטילציה של שאריות לייסין על חלבונים histone ולאהיסטון 1,,2,,3,,4. מחקרים אחרונים מגלים כי KATs ותפקוד אצטילטרנספראז שלהם יכול לקדם צמיחה גידול מוצק4,5,6,7,8,9. לדוגמה, חלבון מחייב CREB (CBP)/p300 הם שני KATs פרלוגים המסדירים מסלולי איתות רביםבסרטן 2,3. CBP/p300 יש פונקציה אצטילטרנספראז היסטון מאופיינת היטב (HAT) ללקט את Histone 3 ליסין 27 אצטילציה (H3K27ac)2,,4,,5,,10,,11, סמן חשוב עבור משפרי פעיל, אזורי קידום ותעתוקגנים פעיל 12,,13,,14. CBP/p300 לשמש כמפעילים שותף קריטי עבור נתיבי איתות פרו-צמיחה בגידולים מוצקים על ידי הפעלת שעתוק של אונקוגנים באמצעות אצטילציה של היסטון ותמלולגורמים אחרים 4,,9,,15,16,,17,18. בשל תפקידם בהתקדמות הגידול, CBP/p300 ו KATs אחרים נמצאים תחת חקירה לפיתוח מעכבי רומן החוסמים את הפונקציה האונקוגניתשלהם 4,,5,6,,7,8,,9,,18,,19,,20. A-485 ו GNE-049 מייצגים שני ניסיונות מוצלחים לפתח מעכבים חזקים וספציפיים עבור CBP/p3004,9. מעכבים נוספים נמצאים כעת תחת חקירה עבור CBP/p300 ו KATs אחרים.

האיכות של מעכבי KAT שתוארו קודם לכן (KATi) נקרא בשאלה, עם מעכבים רבים להשוויץ השפעות היעד ואפיון גרוע21. לכן, אפיון קפדני ואימות של מועמדים לסמים חדשניים חיוני לפיתוח של בדיקות כימיות באיכות גבוהה. להלן שלושה פרוטוקולים הנוהרים צינור לסינון ומאמתים בקפדנות את העוצמה והספנות של הרומן KATi, עם דגש ספציפי על עיכוב פונקציית HAT (HATi) של KATs. CBP/p300 והמעכבים שלהם משמשים כדוגמאות, אך פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים עבור KATs אחרים בעלי פונקציית HAT7.

הפרוטוקול הראשון הוא אצטילטרנספראז היסטון במבחנה (HAT) תסיסה המשתמשת p300 רקומביננטי מטוהרים והישטונים בתגובה מבוקרת צינור. תוואי זה הוא פשוט לביצוע, הוא חסכוני, ניתן להשתמש בו כדי לסנן תרכובות בהגדרת תפוקה נמוכה, ואינו דורש חומרים רדיואקטיביים. בפרוטוקול זה, p300 קתליציה רקומביננטי אצטילציה ליאזין על זנבות histone במהלך תקופת דגירה קצרה ואת רמות האצטילציה histone נמדדים באמצעות נהלי אימונובולוט סטנדרטיים. התגובה האנזימטית יכולה להתבצע בנוכחות או בהיעדר מעכבי CBP/p300 כדי לסנן עבור תרכובות להפחית אצטילציה histone. בנוסף, ניתן להשתמש ב-HAT כדי לוודא אם תרכובות חדשניות הן סלקטיביות עבור CBP/p300 על-ידי הערכת פעילותן מול KAT מטוהרים אחרים, כגון PCAF. Assay כובע הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת מעכבי רומן בשל הפשטות שלה, עלות נמוכה, ואת היכולת לקבוע את העוצמה / לקטיביות של מעכב. אכן, פרוטוקול זה משמש לעתים קרובות בספרות כמסכים במבחנה5,10. עם זאת, מעכבים שזוהו ב- HAT assay לא תמיד יעילים בתרבות התא כי תגובת מבחנה היא הרבה יותר פשוטה מאשר מערכת תא חי. לכן, זה חיוני כדי לאפיין מעכבים נוספים בניסויים תרבות התא22,23.

הפרוטוקול השני בצינור הוא עיכוב Hyperacetylation כרומטין (ChHAI) אסה. זה תא מבוסס assay מנצל מעכבי deacetylase histone (HDACi) ככלי היסטונים hyperacetylate בכרומטין לפני דגירה שיתופית עם HATi24. אצטילציה היסטון בסיס יכול להיות נמוך בתרבות התא, מה שהופך את זה קשה בדיקה באמצעות immunoblotting ללא תוספת של HDACi כדי להגדיל את האצטילציה. מטרת ההסדה ChHAI היא לזהות את הרומן HATi שיכול להקטין את העלייה באצטילציה היסטון הנגרמת על ידי עיכוב HDAC. היתרונות של אסיי זה כוללים את העלות הנמוכה שלה, קלות יחסית לבצע, ואת השימוש בתאים בתרבות, אשר מספק רלוונטיות פיזיולוגית יותר מאשר צינור הבדיקה HAT assay. בדומה ל- HAT assay, פרוטוקול זה משתמש ב- immunoblotting סטנדרטי לאיסוף נתונים.

ASSay HAT ו ChHAI לספק נתונים על העוצמה של תרכובות חדשניות לעיכוב אצטילציה histone העולמי, אבל אינם מספקים תובנה כיצד תרכובות אלה משפיעות על שינויים באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, הפרוטוקול הסופי, כרומטין Immunoprecipitation-כמוות פולימראז תגובת שרשרת (ChIP-qPCR) הוא ניסוי תרבות התא החוקר אינטראקציות DNA-חלבון באזורים ספציפיים של הגנום. בפרוטוקול ChIP, כרומטין הוא crosslinked כדי לשמר אינטראקציות חלבון DNA. הכרומטין מופק לאחר מכן מתאי ותסביך חלבון ה-DNA עובר פירוק חיסוני סלקטיבי עבור חלבון של עניין (למשל, באמצעות נוגדן ספציפי עבור H3K27ac). לאחר מכן ה-DNA מטוהר וניתח באמצעות qPCR. לדוגמה, ChIP-qPCR יכול לשמש כדי לקבוע אם רומן HATi downregulates אצטילציה histone באונקוגנים בודדים, כגון Cyclin D125. בעוד ChIP-qPCR היא טכניקה נפוצה בשימוש בתחום, זה יכול להיות קשה לייעל4,10,26. פרוטוקול זה מספק עצות למניעת מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הליך ChIP-qPCR וכולל בדיקות בקרת איכות שיש לבצע בנתונים.

כאשר נעשה שימוש יחד, שלושת הפרוטוקולים הללו מאפשרים אפיון קפדני ואימות של הרומן HATi. בנוסף, שיטות אלה מציעות יתרונות רבים כי הם קלים לביצוע, זול יחסית ולספק נתונים על אצטילציה histone גלובלית, כמו גם אזורית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. במבחנה כובע תסה

  1. הכנת מאגר
    הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מתכוני מאגר.
    1. הכן מאגר הבחנה של 5x ו-6 דודיום דודציל סולפט (SDS) ואחסן ב-20°C. אליקוט SDS ב 1 מ"ל aliquots.
    2. הכן מאגר ריצה של ג'ל SDS 10x ו-TBST של 10x ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
    3. הכן מאגר העברה אחד ואחסן ב- 4 °C.
      התראה: בדוק את גליון נתוני הבטיחות עבור כל הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה. SDS, DTT, ו כחול ברומונול רעילים ים אין לבלוע, לשאוף, או חשוף לעור או לעיניים. נא עיין בגיליון נתוני בטיחות לקבלת הליכי טיפול נאותים. אנא השתמש בכסה מנוע אדים כימי לטיפול בכימיקלים מסוכנים.
  2. תגובת HAT
    הערה: חומצה אנאקרדית הוא מעכב p300 ידוע 3 והוא משמשכדוגמה כדי להדגים כיצד assay HAT יכול לזהות מעכבי p300 רומן. ראה פרוטוקול משלים (סכמטי 1) לקבלת תרשים של שלב 1.2.1.
    1. להכין את התגובה האנזימטית הבאה בצינור PCR 0.2 מ"ל: 2 μL של מאגר 5x assay, 1 μL של p300 מטוהר (0.19 μg/ μL), 1 μL של חומצה אנאקרדית (HATi) או DMSO שליטה מדוללת 1x מאגר תסה ו 2 μL של ddH autoclaved2O. טרום דגירה תערובת זו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להוסיף 3 μL של 100 μM אצטיל-CoA ו 1 μL של H3.1 מטוהר (0.2 μg/ μL) לתגובה.
    2. דגירה תערובת התגובה המלאה ב 30 ° C עבור 1 שעה במחזור תרמי PCR.
    3. הוסף 2-mercaptoethanol ביחס 1:10 למאגר מדגם SDS 6x.
    4. הסר דגימות מהמחזור התרמי PCR ולהוסיף 2 μL של 6x SDS (עם 2-mercaptoethanol הוסיף) לתערובת התגובה.
      התראה: 2-mercaptoethanol הוא רעיל ויש להשתמש בו בתוך מכסה מנוע אדים כימי. נא עיין בגיליון נתוני בטיחות לקבלת טיפול נכון.
    5. מחממים דגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על בלוק חום ומצננים על קרח. אחסן את הדגימות ב-20 או -80°C או בצע אלקטרופורזה של ג'ל וחיסונים כמפורט להלן.
  3. אלקטרופורזה ג'ל וחיסונים
    הערה: אם אינו מכיר אלקטרופורזה ג'ל וimmunoblotting,עיין בהליך סטנדרטי זה 27 לקבלת פרטים נוספים על אופן ביצוע שלבים 1.3.1-1.3.17. מידע נוסף ניתן למצואכאן 28,29,30,31,32,33.
    1. פיפטה 10 μL של דגימות (מ שלב 1.2.5.) לתוך הבארים של 4-20% ג'ל polyacrylamide הדרגתי. פיפט 5 μL של סולם חלבון לתוך אחת בארות כהתייחסות משקל מולקולרי. הפעל את הג'ל ב 120 V במשך 90 דקות באמצעות מיכל ג'ל.
    2. מעבירים את הג'ל לממברנה פוליוינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב-100 V למשך 70 דקות באמצעות מיכל העברה.
    3. מוציאים את הממברנה מאפליקציית ההעברה ומנינים אותה במיכל פלסטיק. חסמו את הממברנה על-ידי הוספת TBST אחד (המכיל 5% חלב) למכל ולנער בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את ה- TBST 1 מתוך שלב 1.3.3. דגירה את הממברנה בן לילה עם נוגדנים אצטיל ספציפיים לאתר נבחרים (למשל, H3K18ac או H3K27ac נוגדנים ראשיים ב 1:5,000 דילול ב 1x TBST המכיל 5% חלב) ב 4 ° C עם טלטול עדין.
    5. הסר את פתרון הנוגדנים הראשי. יש לשטוף את הממברנה 2x עם TBST אחד (ללא חלב) בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין במשך 15 דקות כל שטיפה.
    6. לדלל את הנוגדן המשני בשעה 1:20,000 ב 1x TBST (המכיל 5% חלב) ותדגר את הממברנה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
    7. הסר את פתרון הנוגדנים המשני. יש לשטוף את הממברנה 2x עם TBST אחד (ללא חלב) בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין במשך 15 דקות כל שטיפה.
    8. לנקז את 1x TBST מהממברנה. ערבב תמיסת מי חמצן של כרוב HRP ופתרון לומינול של כרוב HRP ביחס של 1:1 (1 מ"ל מכל אחד) ופיפטה 2 מ"ל של הפתרון המשולב למשטח הממברנה.
    9. דגירה את הפתרון עם קרום במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. מנקזים עודפי שמלומינסנטים מהממברנה על גבי מגבת נייר וממקם את הממברנה בניילון נצמד בתוך מחזיק קלטת רנטגן.
    11. עברו לחדר חשוך המוקדש לעיבוד סרט רנטגן. לחשוף את הממברנה לסרט רנטגן על ידי הצבת הסרט על גבי הממברנה וסגירת הקלטת עבור 30 שניות.
      הערה: יש לקבוע את זמן המגע בין הסרט לבין הממברנה באופן ניסיוני. אותות חזקים יזדקקו לחשיפות קצרות (שניות) ואותות חלשים יותר עשויים להזדקק לחשיפה ארוכה יותר.
    12. הסר את סרט הרנטגן מהקלטת ועיבד את הסרט על-ידי הפעלתו במעבד צילום רנטגן. עיין במדריכים של היצרן לקבלת הוראות ספציפיות כיצד לעבד את סרט הרנטגן.
    13. מוציאים את הממברנה מעוטף הניילון ושוטפים אותה עם ddH 2 Oלמשך5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
    14. דגירה את הממברנה עם 0.2 M NaOH במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
    15. לשטוף את הממברנה עם ddH 2 Oבמשך5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
    16. חסמו את הממברנה על-ידי הוספת TBST אחד (המכיל 5% חלב) למכל ולנער בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    17. הוסף את דילול הנוגדנים הראשי הבא (לדוגמה, בדיקה עבור H3K27ac אם הנוגדן הראשון בשימוש היה H3K18ac) ולנער לילה ב 4 ° C. חזור על שלבים 1.3.4-1.3.17 עד השלמת כל בדיקות הנוגדנים.

2. תסה ChHAI

  1. במבחנה טיפולים תרופתיים וניתוח של היסטון אצטילט
    הערה: A-485 הוא p300 HATi חזק ומאופיין היטב2,4 . מעכב זה יהיה מנוצל בssays הנותרים בשל יעילותו וספגם בתרבות התא. MS-275 (נטינוסטט)24 הוא HDACi אשר מגדיל באופן ניכר את רמות האצטילציה histone והוא משמש כדי להקל על זיהוי קל יותר של בדיקות אצטילציה עם immunoblotting סטנדרטי. לראות פרוטוקול משלים (סכמטי 2), עבור סכמטי של דילול התרופה בשימוש בשלב 2.1.
    1. זרע 100,000 תאי MCF-7 בצלחת 12 באר ולאפשר לתאים לגדול 80-90% confluency ב 1 מ"ל של תא תרבות בינונית. סמן את הבארים עבור העיצוב הניסיוני הבא: טוב 1: בקרת DMSO (נקודת התייחסות); טוב 2: A-485 (3 μM); טוב 3: A-485 (10 μM); ובכן 4: MS-275 (3 μM); גם 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); גם 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      הערה: עבור culturing תאי MCF-7, השתמש במדיה DMEM מלאה ואפשר לתאים לגדול ב- 37 °C עם 5% CO2. ראה טבלה 1 לקבלת מתכון DMEM מלא.
    2. בשעה 24 שעות לאחר זריעה, פיפטה 4 מ"ל של מדיה DMEM מלאה לצינור סטרילי 15 מ"ל חמור. פיפטה 2 μL של MS-275 (6 mM ב DMSO) כדי 4 מ"ל של בינוני עבור ריכוז סופי של 3 μM MS-275.
    3. פיפטה 2 μL של DMSO כדי 4 מ"ל של בינוני בצינור סטרילי נפרד 15 מ"ל חסה.
      התראה: נא בדוק את גליון נתוני הבטיחות לקבלת טיפול נכון ב- DMSO. סוגי כפפות מסוימים אינם מדורגים לטיפול ב- DMSO.
    4. לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 4-6 ו פיפטה 1 מ"ל של 3 μM MS-275 במדיום (שלב 2.1.2) לכל באר. בטל MS-275 מדולל שלא נו.ח.
    5. לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 1-3 ו פיפטה 1 מ"ל של DMSO מדולל (שלב 2.1.3) לכל באר. בטל DMSO מדולל שלא נו.סי.
    6. להחזיר את התאים אינקובטור דגירה במשך 4 שעות כדי לאפשר הצטברות של היסטונים אצטילאט בתאים חשופים MS-275 (בארות 4-6).
      הערה: MS-275 הוא HDACi ו יגרום היפראצטילציה histone24. זה 4 שעות לפני הדגירה יש צורך לאפשר MS-275 לגרום היפראצטיילציה לפני התוספת של A-485, אשר מפחית אצטילציה histone2,,4.
    7. לאחר 4 שעות של דגירה עם MS-275, להכין את דילולות הבאות בצינורות סטריליים נפרדים 1.5 מ"ל על ידי pipetting: 1.0 μL של DMSO כדי 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של DMSO ו 0.5 μL A-485 (6 mM) עד 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של DMSO ו 0.5 μL של A-485 (20 mM) כדי 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של DMSO ו- 0.5 μL של MS-275 (6 mM) עד 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של A-485 (6 mM) ו 0.5 μL של MS-275 (6 mM) עד 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של A-485 (20 mM) ו 0.5 μL של MS-275 (6 mM) כדי 1 מ"ל של מדיה DMEM.
    8. לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 1-6 ופיפטה 1 מ"ל של דילול 1 לבאר 1, דילול 2 לבאר 2, דילול 3 לבאר 3, דילול 4 לבאר 4, דילול 5 לבאר 5, ו דילול 6 לבאר 6.
      הערה: כלל כללי הוא לאזן תוכן DMSO (ממס) בין קבוצות ניסיוניות ולא לחרוג 0.1% תוכן DMSO בתרבות התא כדי למנוע רעילות תאית ושינויים בהתפשטות.
    9. מחזירים את התאים לאקובטור ולתרבות למשך 20 שעות.
    10. לאחר 20 שעות, לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 1-6.
    11. לשטוף את התאים על ידי pipetting 1 מ"ל של PBS לבארות 1-6. לשאוף את PBS.
    12. הוסף 100 μL של מאגר 1x lysis פסיבי (ראה טבלה 1)לבארות 1-6. לאחסן את לוח התרבות התא (עם דגימות במאגר lysis פסיבי) ב -80 °C לילה להקפאת וליזה של תאים.
      התראה: נא בדוק את גליון נתוני הבטיחות עבור כל הכימיקלים לפני יצירת מאגרים. CDTA יכול לגרום נזק רציני לעיניים וגירוי.
    13. להפשיר דגימות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין במשך 10 דקות. מעבירים דגימות לצינורות 1.5 מ"ל נפרדים ומעבירים מיד על הקרח.
    14. למדוד ריכוז חלבון של כל מדגם. ריכוז חלבון ניתן לקבוע באמצעות מספר פרוטוקולים מבוססיםהיטב 34.
    15. ריכוז חלבון שווה בין דגימות 1-6 (בנפח שווה) באמצעות מאגר 1x פסיבי לדילול, במידת הצורך.
    16. הוסף 2-mercaptoethanol ביחס 1:10 למאגר מדגם SDS 6x.
    17. הוסף מאגר מדגם SDS 6x עם 2-mercaptoethanol לדגימות 1-6 לריכוז הסופי של מאגר מדגם SDS 1x.
    18. מחממים דגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על בלוק חום ומצננים על קרח. ניתן לאחסן דגימות ב- -20°C או -80 °C עד לשלב 2.1.19.
    19. פיפט נפח המכיל 30 μg של חלבון עבור דגימות 1-6 לבארות בג'ל פוליקרילמיד הדרגתי 4-20%. בצע הליך אימונובולטינג לפי פרוטוקול המתואר בפרוטוקול 1.

3. ChIP-qPCR

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתואר עבור מעכבי p300 כדוגמה.

  1. הכנת מאגר
    הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מתכוני מאגר. השלבים הכלליים של פרוטוקול ChIP (למשל מתכוני מאגר, זמני שטיפה ושנות צנטריפוגציה) להלן משתנים ומותאמות מהמלצות היצרן של ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים)ומהספרות 35,36.
    1. הכן מאגר דילול ChIP, מאגר נפיחות גרעין, מאגר שטיפת מלח נמוך, מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפה LiCl ומאגר TE. לאחסן ב-4°C.
    2. הכן מאגר פירוק SDS, מאגר גלצין 10x ומאגר חומת ChIP. לאחסן בטמפרטורת החדר.
      התראה: נא בדוק את גליון נתוני הבטיחות עבור כל הכימיקלים לפני יצירת מאגרים כדי להבטיח טיפול נכון.
  2. טיפול תרופתי
    הערה: ראה פרוטוקול משלים (סכמטי 3) לקבלת תרשים של דילול התרופה המשמש בשלב 3.2.
    1. זרעי תאי MCF-7 בשתי מנות תרבות של 15 ס"מ ותאי הגדלים תאים ל-90% קונפלואנציות ב-12 מ"ל של מדיום DMEM השלם. סמן את הכלים עבור העיצוב הניסיוני הבא: Dish 1: בקרת DMSO (נקודת התייחסות); מנה 2: A-485 (3 μM).
      הערה: עבור תאי MCF-7, השתמש במדיה DMEM מלאה ולגדול ב- 37 °C עם 5% CO2. ראה טבלה 1 לקבלת מתכון DMEM מלא.
    2. בצינור סטרילי 15 מ"ל חמור, פיפטה 12 מ"ל של מדיה DMEM ופיפטה 6 μL של DMSO. מערבבים היטב.
    3. בצינור 15 מ"ל נפרד, פיפטה 12 מ"ל של מדיה DMEM ופיפטה 6 μL של A-485 (6 mM ב DMSO) כדי לקבל ריכוז סופי של 3 μM A-485. מערבבים היטב.
    4. שאף את התקשורת מצלחת 1 ו-2.
    5. הוסף את 12 מ"ל DMSO מדולל ב- DMEM (שלב 3.2.2.) לצלחת 1.
    6. הוסף את 12 מ"ל של 3 μM A-485 ב- DMEM (שלב 3.2.3.) לצלחת 2.
    7. מחזירים את מנות תא האינקובטור ותו לא במשך 24 שעות.
  3. קיבעון תאים
    1. פיפט 330 μL (27.5 μL לכל מ"ל) של 37% פורמלדהיד למדיה המלאה ומערבבים בעדינות את הצלחת לערבב.
      זהירות: פורמלדהיד רעיל. נא עיין בגיליון נתוני בטיחות לקבלת הליכי טיפול נאותים.
    2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. פיפט 2 מ"ל של גלצין 10x לצלחת ומערבול לערבב.
    4. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר הדגירה, מניחים כלים על קרח ומפשירים את הקוקטייל של מעכב פרוטאז.
    6. הכן את הפתרונות הבאים הן עבור דוגמאות DMSO והן עבור A-485 באמצעות המאגרים שהוכנו בשלב 3.1.
      1. 2 מ"ל של PBS עם דילול 1:1,000 של קוקטייל מעכב פרוטאז
      2. 1 מ"ל של גרעין נפיחות מאגר עם 1:1,000 דילול של קוקטייל מעכב פרוטאז
      3. 0.5 מ"ל של מאגר lysis SDS עם דילול 1:1,000 של קוקטייל מעכב פרוטאז
    7. לשאוף את התקשורת מכלי תרבות התא ולשטוף את התאים פעמיים עם 15 מ"ל של PBS קר.
    8. פיפט 2 מ"ל של PBS עם קוקטייל מעכב פרוטאז (שלב 3.3.6.1) לכלי תרבות התא. הרם את התאים לפתרון באמצעות מגרד תאים.
    9. העבר את מתלה התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה. אסוף תאים נותרים עם PBS נוספים במידת הצורך.
    10. צינורות ספין ב 800 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי גלולות התאים.
    11. לשאוף את supernatant ופיפטה 1 מ"ל של גרעין נפיחות מאגר עם קוקטייל מעכב פרוטאז (שלב 3.3.6.2) אל הכדור. תוסתו מחדש את הכדור ותדגירה על קרח במשך 10 דקות.
    12. צנטריפוגה הצינורות ב 2,700 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי גרעין גלולה.
    13. שאיפה supernatant ופיפטה 0.5 מ"ל של מאגר lysis SDS עם קוקטייל מעכב פרוטאז (שלב 3.3.6.3) אל הכדור. תוסתו מחדש את הכדור ותדגירה על קרח במשך 10 דקות.
    14. אחסן את דגימות הכרומטין ב- -80 °C עד לשלב 3.4.1 או המשך מיד לשלב 3.4.
  4. sonication DNA
    1. להעביר 130 μL של כרומטין מדגימת DMSO (שלב 3.3.14) לשני צינורות sonication DNA באמצעות פיפטה (130 μL כל אחד).
    2. להעביר 130 μL של כרומטין מדגימת A-485 (שלב 3.3.14) לשני צינורות sonication DNA באמצעות פיפטה (130 μL כל אחד).
    3. Sonicate את ה-DNA בערך 150-200 שברי זוג בסיס באמצעות הגדרות sonicator הבאות: שיא אירוע כוח (W) של 175, מקדם חובה של 10%, 200 מחזורים לכל פרץ ו 430 s זמן טיפול.
      הערה: הגדרות Sonication עשויות להיות שונות בין מודלים והגדרות ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי להשיג גודל שבר מתאים עבור קווי תא שונים.
    4. שמור דגימות על קרח לאחר sonication.
    5. להעביר את הכרומטין sonicated לצינור 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה וצנטריפוגה ב 10,000 x g ב 4 ° C במשך 10 דקות כדי פסולת כדורית.
    6. פיפט הסופרנטנט (מכיל כרומטין sonicated) לצינור חדש ולזרוק את ההריסות. כרומטין Sonicated ניתן לאחסן ב -80 °C.
  5. פירוק כרומטין (ChIP)
    הערה: ראה פרוטוקול משלים (סכמטי 3) לקבלת תרשים של קבוצות IP בשלב 3.5.
    1. למדוד את תכולת החלבון של כרומטין sonicated עבור DMSO ו- A-485 דגימות מ שלב 3.4.6. ניתן למדוד תכולת חלבון באמצעות פרוטוקולים מבוססיםהיטב 34.
      הערה: עבור פשטות, פרוטוקול זה יניח תוכן חלבון שווה 100 μL של כרומטין sonicated ישמש. אחרת, תוכן חלבון יצטרך להיות שווה בין כל הדגימות בנפח שווה.
    2. פיפטה 100 μL של DMSO sonicated כרומטין לשני צינורות 1.5 מ"ל (100 μL כל אחד). פיפטה 400 μL של מאגר דילול ChIP (המכיל 1:1,000 דילול של קוקטייל מעכב פרוטאז) לכל צינור כדי להביא נפח כולל עד 500 μL. להסיר 5 μL של הפתרון מאחד הצינורות ולאחסן ב -20 °C כמו קלט DMSO.
    3. פיפטה 100 μL של A-485 sonicated כרומטין לשני צינורות 1.5 מ"ל (100 μL כל אחד). פיפטה 400 μL של מאגר דילול ChIP (המכיל דילול 1:1000 של קוקטייל מעכב פרוטאז) לכל שפופרת כדי להביא נפח כולל עד 500 μL. להסיר 5 μL של הפתרון מאחד הצינורות ולאחסן ב -20 ° C כמו קלט A-485.
    4. באמצעות פיפטה, הוסף את נוגדן immunoprecipitation (IP) (למשל בקרת IgG לא ספציפית או נוגדן ספציפי H3K27ac) לצינורות המתאימים עבור DMSO ו- A-485 דגימות: IP #1 כרומטין DMSO עם נוגדן IgG (5-10 μg); IP #2 כרומטין DMSO עם נוגדן H3K27ac (5-10 μg); IP #3 כרומטין A-485 עם נוגדן IgG (5-10 μg); IP #4 כרומטין A-485 עם נוגדן H3K27ac (5-10 μg).
    5. להוסיף 20 μL של חלבון חרוזים מגנטיים לכל צינור. ודא שהחרוזים הם גם מחדש.
    6. סובב את הדגימות למשך הלילה ב- 4 °C.
    7. גלול את החלבון חרוזים מגנטיים באמצעות מפריד מגנטי ולהסיר את supernatant. נא לא להפריע לחרוזים.
    8. שוטפים את החרוזים ב-500 μL עד 1 מ"ל של מאגר שטיפת המלח הנמוך ומסתובבים במשך 5 דקות ב-4°C. לבצע ספין מהיר למטה, גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי, ולהסיר את supernatant.
    9. שוטפים את החרוזים עם 500 μL עד 1 מ"ל של מאגר שטיפת מלח גבוה ולסובב במשך 5 דקות ב 4 ° C. לבצע ספין מהיר למטה, גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי, ולהסיר את supernatant.
    10. שוטפים את החרוזים ב-500 μL עד 1 מ"ל של מאגר השטיפה LiCl ומסתובבים במשך 5 דקות ב-4°C. לבצע ספין מהיר למטה, גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי, ולהסיר את supernatant.
    11. שוטפים את החרוזים ב-500 μL עד 1 מ"ל של מאגר TE וסובבו במשך 5 דקות ב-4°C. בצע ספין-למטה מהיר. שמור את החרוזים במאגר TE עד לשלב 3.5.14.
    12. הסר דגימות קלט (מ- 3.5.2 ו- 3.5.3) מהמקפיא והמשיך על הקרח.
    13. הפשיר את הליקוט של חלבון K.
    14. גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי והסר את מאגר TE מהחרוזים (מ- 3.5.11).
    15. הוסף 100 μL ChIP חוצץ אלגנטיות + 1 μL של Proteinase K לכל דגימה, כולל דגימות קלט. דגימות דגירה עם טלטול ב 62 ° C עבור 2 שעות באמצעות תרמוצ'יקלר.
    16. לאחר 2 שעות, דגימות חום 95 °C במשך 10 דקות באמצעות תרמוצ'יקלר.
    17. מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר.
    18. חרוזים מגנטיים כדוריים באמצעות מפריד מגנטי ולהעביר supernatant (מכיל את ה-DNA של עניין) צינור חדש 1.5 מ"ל.
    19. טהר את הדנ"א באמצעות ערכת ניקוי PCR סטנדרטית.
    20. ניתן לאחסן את ה-DNA המטוהר ב-20°C ותו לא להשתמש בו כתבנית בפרוטוקולי qPCR סטנדרטיים. פעל בהתאם לפרוטוקולי היצרן עבור הפעלת qPCR.
  6. ניתוח נתוני ChIP-qPCR
    הערה: שתי שיטות נפוצות לניתוח תוצאות ChIP-qPCR הן העשרה קיפול מעל נוגדן IgG ושיטת הקלט 1% . תבנית מצוינת עבור שתי שיטות הניתוח מסופקת על ידי מקור מסחרי יכול לשמש כדי לחשב במהירות העשרה קיפול עבור כל נוגדן IP / יעד שלעניין 37.
    1. כדי לחשב העשרה קיפול וקלט % , העתק והדבק את ערכי ThCt מנתוני qPCR שהתקבלו עבור כל נוגדן (IgG לא ספציפי, נוגדן IP H3K27ac וקלט 1% ) לאזור המתאים בתבנית הניתוח והעשרה מתקפלת ו- Yield % קלט יאוכלסו באופן אוטומטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במבחנה היסטון אצטילטרנספראז (HAT) assay יכול לשמש כדי לבדוק עבור תרכובות לעכב את פעילות p300 HAT לכיוון היסטון. איור 1A מספק תרשים ניסיוני עבור תרשים HAT. חומצה אנאקרדית, HATiידוע 3,38, היה מנוצל בהסכם זה בטווח ריכוז של 12.5-100 μM. ב 100 μM, חומצה אנאקרדית downregulates p300 אצטילציה היסטון מזער ב Histone 3, Lysines 9 ו 18 לעומת טיפול DMSOשליטה (איור 1B,נתיב 5 לעומת נתיב 1). טווח ריכוז נוצל בהסהה זו כי מינונים סמים נמוכים לא יכול לעכב מאוד את פעילות p300 HAT(איור 1B,נתיבים 2-4 לעומת נתיב 1). בנתיב 6, לא אצטיל-CoA נוספה לתגובה ומשמשת כשליטה שלילית עבור p300 קתליזה עבור רמות בסיס של אצטילציה histone על H3.1 רקומביננטי(איור 1B). רמות החלבון p300 ו- H3.1 נוצלו כפקדי טעינה (איור 1B). תוצאות אימונובוט אלה היו מכמתים באמצעות ImageJ39 (איור 1C). שינויי קיפול חושבו על-ידי השוואת עוצמת הרצועה של כל מדגם לעוצמת הלהקה של פקד DMSO עבור כל בדיקה אצטילציה. כימות עבור חומצה אנאקרדית ב 100 μM מראה הפחתה חזקה H3K18ac ו H3K9ac לעומת פקד DMSO, המאשר את התוצאות החזותיות איור 1B.

ב עכבת Hyperacetylation כרומטין (ChHAI), HDACi משמש ככלי היסטונים hyperacetylate כרומטין לפני דגירה שיתופית עם HATi24, כגון מעכב p300 A-4852,,4. מטרת אסייג זה היא לקבוע את היעילות של HATi להשבתת היפראצ'טיילציה היסטון המושרה על ידי HDACi. איור 2A מספק תרשים ניסיוני עבור תרשים ChHAI. בהסכם זה, טיפול בתאי MCF-7 עם HDACi MS-275 אצטילציה מפוקחת מאוד על Histone 3, על מספר שאריות ליצין(איור 2B, נתיב 4 לעומת נתיב 1). רמות הבזל של H3K18ac ו H3K27ac היו נמוכות, מראה את היתרונות של הוספת HDACi באסייג ChHAI(איור 2B, נתיבים 1-3). התוספת של A-485 עם MS-275 מיעה את האצטילציה ההיסטון המוגברת ב H3K18 ו H3K27, אבל לא H3K9 (איור 2B, נתיבים 4-6). חשוב לציין, H3K9ac אינו מוסדר על ידי p300 בתרבותהתא 2, מראה את הספציפיות של A-485 בניסוי זה. תוצאות אימונובלוט אלה היו מכמתות באיור 2C. שינויי Fold חושבו על ידי השוואת עוצמת הלהקה של כל מדגם לעוצמת הלהקה של MS-275 בלבד (ליין 4) עבור כל בדיקה אצטילציה. נתיבים 1-3 לא היו מכמתים כי רמות בסיס H3K18ac ו H3K27ac לא זוהו.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית של כרומטין (ChIP-qPCR) הוא ניסוי בתרבית תאים החוקר אינטראקציות של חלבון DNA באזורים מסוימים של הגנום. זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של HATi על אלמנטים רגולטוריים גנים לשלוט ביטוי oncogene25. איור 3A מספק תרשים ניסיוני עבור פרוטוקול ChIP-qPCR. תאי MCF-7 שטופלו ב-3 μM A-485 במשך 24 שעות היו נתונים ל-ChIP-qPCR באמצעות פירוק חיסוני של תסביכות היסטון-דנ"א המועשרות ב- H3K27ac (איור 3). הדנ"א המטוהר נותח לרצף היזם של קיקלין די-1. פריימרים ChIP-qPCR מתוכננים נגד רצף DNA ספציפי בגנום והם משמשים כדי לזהות את הכמות היחסית של DNA זירז. כמות ה-DNA המזרז משקף את השפע של החלבון של עניין באזור הגנומי תחת חקירה. אכן, בדגימת DMSO, ה-DNA זירז על ידי נוגדן בקרת IgG מייצר ערך Ct גבוה יותר מאשר נוגדן H3K27ac בתגובת qPCR עבור היזם Cyclin D1 (איור 3B). הדבר מצביע על כך שפקד IgG הלא ספציפי זירז פחות תסביכות חלבון DNA מאשר הנוגדן הספציפי H3K27ac ביזם Cyclin D1. זה מתורגם 632.73 העשרה פי 63 של H3K27ac על פקד IgG לא ספציפי(איור 3B).

העשרה קיפול זה מספק ראיות כי הנוגדן הספציפי H3K27ac בהצלחה immunoprecipitated אצטיונים אצטילטים כי H3K27ac מועשר ב יחצ"ן Cyclin D1. לאחר אימות איכות הנוגדן H3K27ac, ניתן לעשות השוואה בין קבוצות DMSO ו- A-485 שטופלו. כפי שמתואר באות 3C, A-485 מפחית את העשרת H3K27ac אצל מקדם Cyclin D1 לעומת פקד DMSO באמצעות שיטת %Input (תוצאה מייצגת של n = 2). חשוב לציין, A-485 ידוע להפחית באופן משמעותי H3K27ac בתרבותהתא 2,4.

ערכי הקלט הגולמיים של ChIP-qPCR יכולים להיות משתנים מאוד בין משכפלים ביולוגיים עצמאיים, למרות שהמגמה הניסיונית ניתן לשחזור. לכן, זה עשוי להיות שימושי להציג את הנתונים כזח נורמלי של בקרת DMSO כדי להראות את היחס לשחזור בין שליטה וטיפולתרופתי 10. לדוגמה, בדמות תלת-מית,A-485 מנמיך באופן משמעותי את תפוסת H3K27ac אצל היזם Cyclin D1 (n=2). ניתוח סטטיסטי התבסס על מבחן t של התלמיד (*P < 0.05).

Figure 1
איור 1: חומצה אנאקרדית מעכבת פעילות אנזימטית p300 ב- ASSay HAT. (א)תרשים סכמטי של תסחם הכובע, המתאר את התגובה האנזימטית. (ב)חומצה אנאקרדית מעכבת בעוצמה p300 פעילות אנזימטית ואצטילציה histone מפוקח ב H3K18 ו H3K9 ב 100 μM (נתיב 5) לעומת טיפול בקרת DMSO (נתיב 1). ליין 6 חסר אצטיל-CoA בתגובה שימש כשליטה שלילית עבור אצטילציה histone. (ג)תוצאות החיסון ב-(ב) היו מכמתות. שינויי קיפול חושבו על-ידי השוואת עוצמת הרצועה של כל מדגם לעוצמת הלהקה של פקד DMSO עבור כל בדיקה אצטילציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מעכב p300 A-485 מפיג בעוצמה היפראצטיילציה היסטון ב- ChHAI תסאג. (א)תרשים סכמטי של תרשים ChHAI. (ב)בתאי MCF-7, מעכב HDAC MS-275 אצטילציה histone ב H3K18, K27 ו K9 (נתיב 4) לעומת בקרת DMSO (נתיב 1). התוספת של A-485, מעכב p300 כובע ידוע, עם MS-275 היעמיס את העלייה באצטילציה histone ב H3K18 ו K27, אבל לא H3K9 (נתיבים 5-6 לעומת נתיב 4). (ג)תוצאות החיסון ב-(ב) היו מכמתות. שינויי Fold חושבו על ידי השוואת עוצמת הלהקה של כל מדגם לעוצמת הלהקה של MS-275 בלבד (ליין 4) עבור כל בדיקה אצטילציה. נתיבים 1-3 לא היו מכמתים כי רמות בסיס H3K18ac ו H3K27ac לא זוהו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מעכב p300 A-485 מקטין את רמות H3K27ac במקדם Cyclin D1 כפי שנמדד על ידי ChIP-qPCR. (A) דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול ChIP-qPCR. (ב)ערכי QPCR Ct מייצגים עבור מקדם Cyclin D1 עבור IgG ו- H3K27ac ערך חיסוני. לפקד IgG היה ערך Ct גבוה יותר, מה שמצביע על כך שניגדן H3K27ac הועשר בהצלחה עבור H3K27ac על פני נוגדן IgG הלא ספציפי. (ג) A-485 (3 μM) טיפול עבור 24 h3K27ac ב מקדם Cyclin D1 בהשוואה לטיפול בקרת DMSO בתאי MCF-7 (תוצאה מייצגת של n = 2). (D)%Input משני ניסויי ChIP עצמאיים מנורמלו לפקד DMSO כאחוז מהפקד DMSO. טיפול עם A-485 בתאי MCF-7 באופן משמעותי downregulates תפוסת H3K27ac ב יחצ"ן Cyclin D1. ניתוח סטטיסטי התבסס על מבחן t של התלמיד (*P < 0.05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

מאגר מתכון
מאגר גלצין פי 10 18.74 גרם גלצין עם PBS עד להמסה ולהוסיף PBS ל 200 מ"ל.
מאגר פועל פי 10 250 מ' טריס, 1.9 מ' גלצין, 1% SDS
המס 30.0 גר' בסיס Tris, 144.0 גרם גלצין ו- 10.0 גר' SDS ב- 1000 מ"ל של H2O. ה- pH של המאגר צריך להיות 8.3 ולא נדרשת התאמת pH. אחסן את מאגר הריצה בטמפרטורת החדר ודילל ל- 1X לפני השימוש.
10X TBST 2.42 גר' בסיס טריס, 8 גרם NaCl, 2 מ"ל של 50% Tween 20, להוסיף ddH2O לליטר אחד
1 TBST עם 5% חלב 5 גרם אבקת חלב לכ-100 מ"ל של 1X TBST
מאגר 5X תסה: 500 מ', הפגמים, pH 7.5, 0.4% טריטון X-100
מאגר ליזה פסיבי פי 5 להפוך את מלאי מים המכיל 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 מ"ג /מ"ל BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 ו 50% (vol/vol) גליצטרול ב ddH2O.
6X נתרן Dodecyl סולפט (SDS) 0.375 M Tris pH 6.8, 6 מ"ל גליטרול, 1.2 g SDS, 0.93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 מ"ג ברומונול כחול, להוסיף מים 10 מ"ל.
מאגר דילול ChIP 0.01% SDS, 1.1% טריטון X-100, 1.2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl
מאגר אלגנטיות ChIP 1% SDS (w/v) ו- 0.1 M NaHCO3 ב- ddH2O autoclaved
DMEM מלא עבור תאי MCF-7: 10% סרום עגלי עגלים (BCS), פניצילין (10 יחידות/מ"ל) וסטרפטומיצין (10 מ"ג למ"ל)
חיץ שטיפה גבוה במלח 0.1% SDS, 1% טריטון X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl.
מאגר שטיפה LiCl 0.25 מיליון לית, 1% NP-40, 1% נתרן deoxycholate, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
מאגר שטיפה נמוך במלח 0.1% SDS, 1% טריטון X-100, 2 mM EDTA, 200 mtris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl.
גרעין נפיחות מאגר 5 מ"מ צינורות pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40
מאגר ליסיס SDS 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mtris-HCl pH 8.0
מאגר TE 10 מ'מ טרי-HCl pH 8.0, 1 מ"מ EDTA.
מאגר העברה 25 mM Tris, 190 mM גלצין, 20% מתנול ולבדוק את ה-pH ולהתאים pH 8.3 במידת הצורך.

טבלה 1: מתכונים של המאגרים והפתרון המשמשים.

קבצים משלימים: שרטוטים ניסיוניים משלימים עבור פרוטוקולים 1-3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילאט כמה שאריות ליאזין על זנבות histone ותמלול גורמים לווסתשעתוק גנים 2,,3. עבודה בשני העשורים האחרונים חשפה כי KATs, כגון CBP/p300, PCAF ו GCN5, אינטראקציה עם גורמי שעתוק oncogenic ולעזור להניע גידולים במספר סוגיגידול מוצק 4,5,9,15,16,17,18. בשל תפקידם המתעורר בקידום גידול צמיחה, KATs נחקרים כיוקדות חדשניות בטיפול בסרטן. מעכבי KAT רומן (KATi) צריך להיבדק בזהירות ובדקנות לעוצמה, תספק, ובטיחות לפני המעבר לשימוש במרפאה. ראיות אחרונות הראו כי תרכובות KATi שתוארו בעבר להפגין את השפעות היעד היו מאופיינים בצורה גרועה לפני שהיה בשימוש נרחב בספרות המדעית כמו בדיקותכימיות 21. לכן, יש צורך בשיטות קפדניות לאפיון KATi. מתואר להלן שלושה פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם יחד כדי לאפיין ולאמת מעכבי רומן מיקוד הפונקציה אצטילטרנספראז histone (HAT) של KATs: תסיסה במבחנה כובע, תסיסה ChHAI, ו ChIP-qPCR. פרוטוקולים אלה משתמשים CBP/p300 ומעכבים שלהם כדוגמאות, אבל שיטות אלה ניתן להתאים בקלות עבור יישום עתידי בחקירת KATs אחרים.

תס"א הוא פשוט וחסכוני לסנן תרכובות לעוצמה בעיכוב פונקציית HAT במבחן. HATs מטוהרים (רקומביננטי4,10 או immunoprecipitated40)ניתן לבדוק בהסכם זה, אבל CBP רקומביננטי/p300 משמש כדוגמה בפרוטוקול זה. CBP/p300 יש תחום HAT אנזימטי המעביר קבוצת אצטיל מאצטיל-CoA למשקע לינזין על מטרה בשקע3. יעדי האבן המאופיינים ביותר של CBP/p300 הם Histone 3 Lysine 18 ו- 27 (H3K18 ו- H3K27, בהתאמה)2,,3,,10,,11. ב- HAT assay, תחום p300 HAT המטוהר הוא דגירה עם אצטיל-CoA ו Histone 3.1 כצע. במהלך תקופת הדגירה, p300 יהיה זליזה אצטילציה על מספר שאריות H3.1 כולל H3K18 ו H3K27. השפע היחסי של אצטילציה על שאריות אלה ניתן למדוד באמצעות immunoblotting. תגובת מבחנות זו יכולה לשמש למסך עבור תרכובות חדשניות הנקשרות ל- p300 ומעכבות את פעילות ה-HAT שלה (HATi). לדוגמה, חומצה אנאקרדית, HATi38 ידוע, downregulates חזק אצטילציה histone הן H3K18 ו H3K9 בהשוואה לפקד DMSO (איור 1B, נתיב 5 לעומת נתיב 1). חשוב מאוד להוסיף אצטיל-CoA לתגובותניסיוניות (איור 1B, נתיבים 1-5) או p300 זליזה של אצטילציה histone לאתתרחש (איור 1B,ליין 6). היעדרו של אצטיל-CoA יכול לשמש גם כשליטה שלילית עבור קטליזה p300, עבור רמות בסיס של אצטילציה histone על H3.1 רקומביננטי.

בעת ביצוע תסרוקת HAT, חשוב לוודא שכל תגובה תקבל את אותה כמות של p300, H3.1 ו- Acetyl-CoA. H3.1 ו p300 רמות ב immunoblot לשמש בקרות טעינה עבור הג'ל. עבור תוואי זה, נוגדנים אצטיל היסטון ספציפיים לאתר או נוגדן פאן-אצטיל יכול לשמש עבור immunoblotting. בעת אופטימיזציה כדי לשפר את איכות immunoblot זה חיוני להשתמש נוגדנים מאומתים עבור immunoblotting ולעקוב בתחילה אחר המלצות היצרן לדלדול נוגדנים. דילול הנוגדנים המשמשים בסעיף פרוטוקול הם לעיון ותוחלף לשנות את דילול ם בהתבסס על תוצאות הניסויים הראשוניים (לדוגמה, אם האות חזק מדי ניתן לדלל את הנוגדן עוד יותר). בשל הפשטות שלה, ASSay כובע הוא ניסוי התחלה מעולה עבור מעכבי רומן הקרנה. עם זאת, ל-HAT יש חסרונות. הדאגה העיקרית עם ASSay כובע היא כי תרכובות יעילות במבחן עשוי להוכיח יעיל במערכת חיים. זוהי בעיה כי יעילות מורכבת בתרבות התא ניתן לשנות על ידי בעיות חחלה הסלולר, חילוף חומרים תאי, ויציבות מורכבת. בנוסף, KATs, במיוחד CBP/p300, יש אינטראקציות חלבון-חלבון רבות המסדירים את פעילות KATשלהם בתרבות התא 3,,41,42. לכן, חיוני לאפיין עוד מעכבים שזוהו ב-HAT בניסויים בתרביתהתאים 20,,23.

Chromatin Hyperacetylation עיכוב (ChHAI) אסא הוא הפרוטוקול השני בצינור והוא שימושי לאימות ההשפעות של מעכבי רומן בתרבות התא. אסיי זה משתמש מעכבי HDAC (HDACi)24 כדי לגרום היפראצטילציה histone בתאים כי אצטילציה בסיס יכול להיות נמוך מדי כדי לזהות על אימונובלוט. קווי התא של בחירה הם דגירה מראש עם HDACi כדי לאפשר הצטברות של כרומטין אצטילאט לפני התוספת של HATi. לאחר הדגירה ה-HDACi וה-HATi, התאים הם פירוקים ונהלי חיסון סטנדרטיים עבור אתרי אצטילציה היסטון ספציפיים. מטרת ההתייעלות היא לקבוע את היעילות של הרומן HATi להשבתת היפראצ'טיילציה היסטון המושרה על ידי HDACi. תאים שנחשפו HDACi צריך להיות רמות גבוהות יותר באופן משמעותי של אצטילציה histone מאשר תאים שנחשפו ממס DMSO (איור 2B, נתיב 4 לעומת נתיב 1). תוספת של HATi יחד עם HDACi צפוי להפחית את אות immunoblot בהשוואה לטיפול HDACi לבד(איור 2B, נתיבים 5-6 לעומת נתיב 4). רמות בסיס של אצטילציה histone (איור 2B, נתיבים 1.3) קשה לזהות ומדגיש את החשיבות של הוספת HDACi בפרוטוקול זה. MS-275 (Entinostat) משמש כדוגמה, אך ניתן להשתמש ב- HDACiאחרים 24,43. MS-275 יש ריכוזים מעכבים מדווחים משתנה לעומת CLASS I HDACs ובדרך כלל מעכב HDAC1 ו HDAC3 עם ריכוזי ננו-טוחנים לריכוזי מיקרו-טוחן נמוכים,בהתאמה 43,44. מגוון רחב של ריכוזי MS-275משמש בספרות 45,46,47, אבל טיפול μM 3 מספק עלייה חזקה ושחזור אצטילציה histone בתאי MCF-7. לכן, זה עשוי להיות מועיל לבצע מסך ראשוני עם מגוון רחב של ריכוזי HDACi ו HATi כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור אסיי ChHAI בעת שימוש בקו תא אחר.

בדומה ל-HAT assay, ייתכן שיהיה צורך לייעל את פרוטוקול immunoblot כדי להשיג תוצאות איכותיות באמצעות נוגדנים מתאימים, דילול נוגדנים אופטימלי וטעינה מדגם מבוקרת בקפידה. טעינה מדגם מבוקר בקפידה חיונית להצלחת פרוטוקול זה, ניתן להשיג באמצעות שיוויון תכולת החלבון של כל הדגימות ובדרך pipetting נפח שווה של דגימות לתוך הבארים של ג'ל אימונובלוט. נוגדן פאן-אצטיל יכול לשמש לצורך תחרוקת בפרוטוקול זה. עם זאת, זה צריך להיות בתוספת עם נוגדנים אצטיל ספציפי לאתר כי KATs יש ספציפיות עבור שאריות ליסטין מסוימים ו HATi אינו משפיע על כל אתרי האצטילציה histoneבתרבות התא 1,,2,4,,5,,10,11., מעכבים כי הם חזקים בהפחתת אצטילציה histone הן HAT ו ChHAI הם מועמדים חזקים להערכה נוספת. חשוב לציין, ל-HAT ו-ChHAI יש את המגבלה של מתן נתונים רק על שינויים גלובליים באצטילציה של היסטון. מגבלה זו יוצרת את הצורך לאפיין את ההשפעות של הרומן HATi באזורים מסוימים של הגנום.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית של כרומטין (ChIP-qPCR) היא הפרוטוקול הסופי בצינור ומעריכה אינטראקציות של חלבון DNA באזורים מסוימים של הגנום. בהסדה זו, אזורים גנומיים מועשר H3K27ac מטוהרים באמצעות פירוק חיסוני (IP) וניתחו באמצעות פריימרים DNA ב qPCR. טכניקה זו מספקת תובנה מכנית כיצד HATi משפיעה על שינויים היסטון ב יחצנים ומשפרי גנים. ChIP-qPCR היא טכניקה חזקה והיא פחות יקרה מ רצף של הגנום כולו (למשל, ChIP-seq), אבל זה יכול להיות קשה לייעל עקב שלבים רבים המשפיעים על התוצאה. הצעד הקשה ביותר למיטוב נכון הוא שלב 3.5, פירוק מערכת החיסון. שלב זה קשה לייעל כי אם ה-DNA המטוהר בשלב 3.5.20 הוא דליל מאוד זה יכול לגרום לתוצאות גרועות בתגובת qPCR (למשל, אין ההגדלה של רצף גנים היעד וערכים גבוהים מאוד Ute). ההצלחה של שלב ה-IP תלויה במספר גורמים, כגון השפע של יעד החלבון של עניין ואיכות נוגדן IP. זה חיוני כדי לאמת את האיכות של נוגדן H3K27ac IP לעומת פקד IgG כדי לאמת את ההצלחה של שלב ה-IP. לדוגמה, באות 3B, הנוגדן הספציפי H3K27ac מציג העשרה של פי 632.73 מעל פקד IgG הלא ספציפי. הדבר מצביע על כך שנוגדן H3K27ac הוא באיכות גבוהה וש-H3K27ac מועשר ביזם Cyclin D1. לאחר אימות נוגדן IP, ניתן לעשות השוואה בין קבוצות DMSO ו- A-485 שטופלו. כפי שמתואר באות 3C, A-485 מפחית את העשרת H3K27ac אצל מקדם Cyclin D1 לעומת פקד DMSO באמצעות שיטת %Input (תוצאה מייצגת של n = 2). אם נוגדן ה-IP מוכיח להיות באיכות נמוכה ואינו מראה העשרה קיפול בניסויים ראשוניים, נסה להגדיל את מספרי התאים בשלב 3.2.1. מספרי תאים גבוהים יותר יכולים לעזור לפצות על איכות נוגדן ירודה על ידי הגדלת תכולת החלבון הכוללת של ליזייט ותאפשר הוספת חלבון נוסף לתגובת ה-IP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים או גילויים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ג'יימס ואסתר קינג תוכנית מחקר ביו רפואי (6JK03 ו 20K07), ו Bankhead-Coley סרטן תוכנית מחקר (4BF02 ו 6BC03), פלורידה מחלקת הבריאות, פלורידה סרטן השד הקרן, ו UF בריאות סרטן מרכז. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר זכריה אוסקינג וד"ר אנדריאה לין על תמיכתם במהלך תהליך הפרסום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 162 ליסטין אצטילטרנספראזים KATs CBP/p300 מעכבי אצטילטרנספראז היסטון שיטות הקרנה אצטילציה היסטון אפיגנטיקה סרטן ויסות גנים
תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter