Summary
Gli inibitori dei l'acetiltransferasi dell'istone (HAT, noto anche come lisina acetiltransferasi), come CBP/p300, sono potenziali terapie per il trattamento del cancro. Tuttavia, sono necessari metodi rigorosi per convalidare questi inibitori. Tre metodi in vitro per la convalida includono i saggi HAT con acetiltransferasi ricombinanti, l'immunoblotting per l'acetilazione degli istoni nella coltura cellulare e ChIP-qPCR.
Abstract
L'acetiltransferasi della lniina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di litina sugli istoni e su altre proteine per regolare la dinamica della cromatina e l'espressione genica. I T-A, come il CBP/p300, sono oggetto di un'intensa indagine in quanto obiettivi terapeutici a causa del loro ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tipi di cancro. Lo sviluppo di nuovi inibitori di piccole molecole che prendono di mira la funzione dell'acetiltransferasi istone (HAT) dei KAT è impegnativo e richiede robusti saggi in grado di convalidare la specificità e la potenza dei potenziali inibitori.
Questo articolo descrive una pipeline di tre metodi che forniscono una rigorosa convalida in vitro per i nuovi inibitori HAT (HATi). Questi metodi includono un test tube di prova HAT, chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) saggio, e Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Nel saggio HAT, i TEST ricombinanti vengono incubati con istoni in una reazione in provetta, consentendo l'acetilazione di specifici residui di litina sulle code istonese. Questa reazione può essere bloccata da un HATi e i livelli relativi di acetilazione istone specifica del sito possono essere misurati tramite immunoblotting. Gli inibitori identificati nel saggio HAT devono essere confermati nell'ambiente cellulare.
Il saggio ChHAI utilizza l'immunoblotting per lo screening per i nuovi HATi che attenuano la robusta iperacetilazione degli istoni indotti da un inibitore della deacetilase istonea (HDACi). L'aggiunta di un HDACi è utile perché i livelli basali di acetilazione istone può essere difficile da rilevare tramite immunoblotting.
I saggi HAT e ChHAI misurano i cambiamenti globali nell'acetilazione degli itoni, ma non forniscono informazioni sull'acetilazione in specifiche regioni genomiche. Pertanto, ChIP-qPCR viene utilizzato per studiare gli effetti di HATi sui livelli di acetilazione degli itoni a elementi regolatori genici. Ciò si ottiene attraverso l'immunoprecipizione selettiva dei complessi istone-DNA e l'analisi del DNA purificato attraverso il qPCR. Insieme, questi tre saggi permettono un'attenta convalida della specificità, della potenza e del meccanismo d'azione del nuovo HATi.
Introduction
L'acetiltransferasi di l'acetilsina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di lino sia sulle proteine istonesine che su proteine non istonese1,2,3,4. Recenti ricerche rivelano che i KAT e la loro funzione di acetiltransferase possono promuovere la crescita del tumoresolido 4,5,6,7,8,9. Ad esempio, la proteina legante CREB (CBP)/p300 sono due KA paralogo che regolano numerose vie di segnalazione nelcancro 2,3. CBP/p300 hanno una funzione acetiltransferasi istone ben caratterizzata (HAT) e catalizzare Histone 3 Lysine 27 acetilazione (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcatore importante per potenziatori attivi, regioni promotori e trascrizione genica attiva12,13,14. CBP/p300 servono come co-attivatori critici per le vie di segnalazione pro-crescita nei tumori solidi attivando la trascrizione degli oncogeni attraverso l'acetilazione degli istoni e altri fattori di trascrizione4,9,15,16,17,18. A causa del loro ruolo nella progressione del tumore, CBP/p300 e altri KAT sono sotto inchiesta per lo sviluppo di nuovi inibitori che bloccano la loro funzione oncogenica4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 e GNE-049 rappresentano due tentativi riusciti di sviluppare inibitori potenti e specifici per CBP/p3004,9. Ulteriori inibitori sono attualmente in fase di esame per CBP/p300 e altri KAT.
La qualità degli inibitori KAT precedentemente descritti (KATi) viene messa in discussione, con molti inibitori che mostrano effetti bersaglio e scarsa caratterizzazione21. Pertanto, una rigorosa caratterizzazione e convalida di nuovi farmaci candidati è essenziale per lo sviluppo di sonde chimiche di alta qualità. Qui delineati sono tre protocolli che formano una pipeline per lo screening e convalidano rigorosamente la potenza e la specificità del nuovo KATi, con un focus specifico sull'inibizione della funzione HAT (HATi) dei KAT. CBP/p300 e i loro inibitori sono utilizzati come esempi, ma questi protocolli possono essere adattati per altri KAT che hanno una funzione HAT7.
Il primo protocollo è un saggio di acetiltransferasi istone in vitro (HAT) che utilizza p300 ricombinante purificato e istoni in una reazione controllata in provetta. Questo saggio è semplice da eseguire, è conveniente, può essere utilizzato per lo screening dei composti in un ambiente a bassa produttività e non richiede materiali radioattivi. In questo protocollo, il ricombinante p300 catalizza l'acetilazione della lliina sulle code dell'istone durante un breve periodo di incubazione e i livelli di acetilazione dell'istone vengono misurati utilizzando procedure standard di immunoblotting. La reazione enzimatica può essere eseguita in presenza o assenza di inibitori CBP/p300 per lo screening di composti che riducono l'acetilazione istonea. Inoltre, l'analisi HAT può essere utilizzata per verificare se i nuovi composti sono selettivi per CBP/p300 valutando la loro attività rispetto ad altri KAT purificati, come PCAF. Il test HAT è un ottimo punto di partenza per studiare nuovi inibitori grazie alla sua semplicità, basso costo e alla capacità di determinare la potenza/selettività di un inibitore. Infatti, questo protocollo è spesso utilizzato nella letteratura come uno schermo in vitro5,10. Tuttavia, gli inibitori identificati nel saggio HAT non sono sempre efficaci nella coltura cellulare perché una reazione in provetta è molto più semplice di un sistema cellulare vivente. Pertanto, è essenziale caratterizzare ulteriormente gli inibitori negli esperimenti di colturacellulare 22,23.
Il secondo protocollo in cantiere è il saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI). Questo saggio basato su cellule utilizza inibitori della deacetilase istone (HDACi) come strumento per iperacetizzare gli istoni in cromatina prima della co-incubazione con un HATi24. L'acetilazione dell'istone basale può essere bassa nella coltura cellulare, rendendo difficile la ricerca tramite immunoblotting senza l'aggiunta di un HDACi per aumentare l'acetilazione. Lo scopo del saggio ChHAI è quello di identificare nuovi HATi che possono attenuare l'aumento dell'acetilazione istonea causata dall'inibizione dell'HDAC. I vantaggi di questo saggio includono il suo basso costo, relativa facilità di esecuzione, e l'uso di cellule in coltura, che fornisce più rilevanza fisiologica rispetto al test tube HAT saggio. Simile al saggio HAT, questo protocollo utilizza l'immunoblotting standard per la raccolta dei dati.
I test HAT e ChHAI forniscono dati sulla potenza dei nuovi composti per inibire l'acetilazione degli itoni globali, ma non forniscono informazioni su come questi composti influenzano le modifiche in specifiche regioni genomiche. Pertanto, il protocollo finale, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è un esperimento di coltura cellulare che studia le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. Nel protocollo ChIP, la cromatina è interconnessa per preservare le interazioni DNA-proteina. La cromatina viene quindi estratta dalle cellule e il complesso DNA-proteina subisce un'immunoprecipizione selettiva per la proteina di interesse (ad esempio, utilizzando un anticorpo specifico per H3K27ac). Il DNA viene quindi purificato e analizzato utilizzando qPCR. Ad esempio, ChIP-qPCR può essere utilizzato per determinare se un nuovo haTi downregulates histone acetylation at individual oncogenes, come Cyclin D125. Mentre ChIP-qPCR è una tecnica comune utilizzata nel campo, può essere difficile ottimizzare4,10,26. Questo protocollo fornisce suggerimenti per evitare potenziali insidie che possono verificarsi durante l'esecuzione della procedura ChIP-qPCR e include controlli di qualità che devono essere eseguiti sui dati.
Se utilizzati insieme, questi tre protocolli consentono la rigorosa caratterizzazione e convalida del nuovo HATi. Inoltre, questi metodi offrono molti vantaggi perché sono facili da eseguire, relativamente a buon mercato e forniscono dati sull'acetilazione istonea globale e regionale.
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Protocol
1. Analisi HAT in vitro
- Preparazione del buffer
NOTA: vedere la tabella 1 per le ricette del buffer.- Preparare 5x buffer di analisi e 6x Sodio Dodecyl Sulfate (SDS) e conservare a -20 gradi centigradi. Aliquot SDS in aliquots da 1 mL.
- Preparare 10x SDS gel in esecuzione buffer e 10x TBST e memorizzare a temperatura ambiente.
- Preparare il buffer di trasferimento 1x e conservarlo a 4 gradi centigradi.
CAUTION: Controllare la scheda dati di sicurezza per tutte le sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo. SDS, DTT e blu bromofenolo sono tossici e non devono essere ingeriti, inalati o esposti alla pelle o agli occhi. Consultare la scheda dati di sicurezza per le procedure di movimentazione adeguate. Si prega di utilizzare un cappuccio di fumi chimici per la manipolazione di sostanze chimiche pericolose.
- Reazione HAT
NOTA: L'acido anacardico è un noto inibitore p3003 e viene utilizzato come esempio per dimostrare come il saggio HAT possa identificare nuovi inibitori p300. Per uno schema del passaggio 1.2.1, vedere Protocollo supplementare (Schematico1 ).- Preparare la seguente reazione ezimatica in un tubo PCR da 0,2 mL: 2 L di buffer di analisi 5x, 1 L di p300 purificato (0,19 g/L), 1 L di acido anacardico (HATi) o di controllo DMSO diluito in 1x buffer di analisi e 2 L di ddHautoclaved 2O. Pre-incubare questa miscela per 10 min a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 3 L di 100 M Acetyl-CoA e 1 L di H3.1 purificato (0,2 g/L) alla reazione.
- Incubare la miscela di reazione completa a 30 gradi centigradi per 1 h in un ciclo termico PCR.
- Aggiungere 2-mercaptoethanol a un rapporto 1:10 al buffer di esempio SDS 6x.
- Rimuovere i campioni dal ciclo termico PCR e aggiungere 2 L di 6x SDS (con 2-mercaptoethanol aggiunto) al mix di reazione.
CAUTION: 2-mercaptoethanol è tossico e deve essere utilizzato all'interno di un cappuccio di fumi chimici. Si prega di consultare la scheda dati di sicurezza per una corretta gestione. - Riscaldare i campioni a 95 gradi centigradi per 5 minuti su un blocco di calore e raffreddare sul ghiaccio. Conservare i campioni a -20 o -80 gradi centigradi o eseguire l'elettroforesi gel e l'immunoblotting come descritto di seguito.
- Elettroforesi gel e immunoblotting
NOTA: Se non si ha familiarità con l'elettroforesi e l'immunoblotting del gel, vedere questa procedura standard27 per ulteriori dettagli su come eseguire i passaggi 1.3.1-1.3.17. Ulteriori informazioni sono disponibili qui28,29,30,31,32,33.- Pipetta 10 L di campioni (dal punto 1.2.5.) nei pozzetti di un gel poliacrilammide sfumato del 4-20%. Pipette 5 L di scala proteica in uno dei pozzi come riferimento di peso molecolare. Eseguire il gel a 120 V per 90 min utilizzando un serbatoio di gel.
- Trasferire il gel in una membrana di difluoride polivinilidena (PVDF) a 100 V per 70 min utilizzando un serbatoio di trasferimento.
- Rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento e posizionarla in un contenitore di plastica. Bloccare la membrana aggiungendo 1x TBST (contenente il 5% di latte) al contenitore e agitare delicatamente per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere il TBST 1x dal passaggio 1.3.3. Incubare la membrana durante la notte con anticorpi acetil specifici del sito selezionati (ad esempio, anticorpi primari H3K18ac o H3K27ac a una diluizione di 1:5.000 in 1x TBST contenenti 5% latte) a 4 gradi centigradi con agitazione delicata.
- Rimuovere la soluzione anticorpo primaria. Lavare la membrana 2x con 1x TBST (senza latte) a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 min ogni lavaggio.
- Diluire l'anticorpo secondario a 1:20.000 in 1x TBST (contenente il 5% di latte) e incubare la membrana per 1 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Rimuovere la soluzione di anticorpi secondari. Lavare la membrana 2x con 1x TBST (senza latte) a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 min ogni lavaggio.
- Scolare l'1x TBST dalla membrana. Mescolare la soluzione di perossido di substrato HRP e la soluzione di substrato HRP in un rapporto 1:1 (1 mL ciascuno) e pipetta 2 mL della soluzione combinata alla superficie della membrana.
- Incubare la soluzione con la membrana per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Scolare il substrato chemiluminescente in eccesso dalla membrana su un tovagliolo di carta e posizionare la membrana in un involucro di plastica all'interno di un supporto di cassette a raggi X.
- Spostati in una stanza buia dedicata all'elaborazione di film a raggi X. Esporre la membrana a una pellicola a raggi X posizionando la pellicola sopra la membrana e chiudendo la cassetta per 30 s.
NOTA: Il tempo di contatto tra la pellicola e la membrana deve essere determinato sperimentalmente. I segnali forti avranno bisogno di esposizioni brevi (secondi) e i segnali più deboli potrebbero richiedere esposizioni più lunghe. - Rimuovere la pellicola a raggi X dalla cassetta ed elaborare la pellicola eseguendola attraverso un processore di pellicola a raggi X. Consultare i manuali del produttore per istruzioni specifiche su come elaborare la pellicola a raggi-X.
- Togliere la membrana dall'involucro di plastica e lavarla con ddH2O per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Incubare la membrana con 0,2 M NaOH per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Lavare la membrana con ddH2O per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Bloccare la membrana aggiungendo 1x TBST (contenente il 5% di latte) al contenitore e agitare delicatamente per 1 h a temperatura ambiente.
- Aggiungere la successiva diluizione dell'anticorpo primario (ad esempio, sonda per H3K27ac se il primo anticorpo utilizzato era H3K18ac) e agitare durante la notte a 4 gradi centigradi. Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.17 fino al completamento di tutte le sonde anticorpehe.
2. Analisi ChHAI
- Trattamenti farmacologici in vitro e analisi degli istoni acetilati
NOTA: A-485 è un potente e ben caratterizzato p300 HATi2,4 . Questo inibitore sarà utilizzato nei saggi rimanenti a causa della sua efficacia e specificità nella coltura cellulare. MS-275 (Entinostat)24 è un HDACi che aumenta notevolmente i livelli di acetilazione degli istoni e viene utilizzato per facilitare il rilevamento delle sonde di acetilazione con immunoblotting standard. Vedere Protocollo supplementare (Schematico 2) per uno schema delle diluizioni di droga utilizzate al punto 2.1.- Seme 100.000 cellule MCF-7 in una piastra di 12 pozzo e consentire alle cellule di crescere a 80-90% confluenza in 1 mL di media coltura cellulare. Contrassegnare i pozzetti per il seguente progetto sperimentale: ben 1: controllo DMSO (punto di riferimento); pozzo 2: A-485 (3 M); pozzo 3: A-485 (10 M); pozzo 4: MS-275 (3 M); pozzo 5: MS-275 (3 M) - A-485 (3 M); pozzo 6: MS-275 (3 M) - A-485 (10 M).
NOTA: per la tattura delle cellule MCF-7, utilizzare supporti DMEM completi e consentire alle cellule di crescere a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Vedere la tabella 1 per la ricetta DMEM completa. - A 24 h dopo la semina, pipetta 4 mL di supporto DMEM completo ad un tubo conico sterile 15 mL. Pipetta 2 L di MS-275 (6 mM in DMSO) al 4 mL di mezzo per una concentrazione finale di 3 M MS-275.
- Pipetta da 2 a 4 mL di media in un tubo conico sterile separato da 15 mL.
CAUTION: Si prega di controllare la scheda dati di sicurezza per una corretta gestione di DMSO. Alcuni tipi di guanti non sono classificati per la gestione di DMSO. - Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 4-6 e pipetta 1 mL di 3 M MS-275 in media (passo 2.1.2) ad ogni pozzo. Eliminare l'MS-275 diluito inutilizzato.
- Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 1-3 e pipetta 1 mL di DMSO diluito (passo 2.1.3) ad ogni pozzo. Eliminare il DMSO diluito inutilizzato.
- Riportare le cellule all'incubatrice e incubare per 4 h per consentire l'accumulo di istoni acetilati nelle cellule esposte a MS-275 (pozzi 4-6).
NOTA: MS-275 è un HDACi e causerà iperacetilazione istone24. Questa pre-incubazione di 4 h è necessaria per consentire a MS-275 di indurre l'iperacetilazione prima dell'aggiunta di A-485, che riduce l'acetilazioneistonea 2,4. - Dopo 4 h di incubazione con MS-275, preparare le seguenti diluizioni in tubi sterili separati da 1,5 mL mediante pipettaggio: da 1,0 L di DMSO a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di DMSO e 0,5 L A-485 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di DMSO e 0,5 L di A-485 (20 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di DMSO e 0,5 L di MS-275 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di A-485 (6 mM) e 0,5 L di MS-275 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di A-485 (20 mM) e 0,5 L di MS-275 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM.
- Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 1-6 e pipetta 1 mL di diluizione 1 a bene 1, diluizione 2 a bene 2, diluizione 3 a bene 3, diluizione 4 a bene 4, diluizione 5 a bene 5, e diluizione 6 a bene 6.
NOTA: Una regola generale è bilanciare il contenuto di DMSO (solvente) tra gruppi sperimentali e non superare lo 0,1% del contenuto DISO nella coltura cellulare per evitare la tossicità cellulare e i cambiamenti nella proliferazione. - Riportare le cellule all'incubatore e alla coltura per 20 h.
- Dopo 20 h, aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 1-6.
- Lavare le cellule pipettando 1 mL di PBS a pozzi 1-6. Aspirare il PBS.
- Aggiungere 100 L di 1x buffer di lisi passiva (vedere la tabella 1) ai pozzi 1-6. Conservare la piastra di coltura cellulare (con campioni in buffer di lisi passiva) a 80 gradi centigradi durante la notte per il congelamento-disgelo e l'lisi delle cellule.
CAUTION: Si prega di controllare la scheda dati di sicurezza per tutte le sostanze chimiche prima di fare buffer. CDTA può causare gravi danni agli occhi e irritazione. - Scongelare i campioni a temperatura ambiente con agitazione delicata per 10 min. Trasferire i campioni in tubi separati da 1,5 mL e posizionarli immediatamente sul ghiaccio.
- Misurare la concentrazione proteica di ogni campione. La concentrazione di proteine può essere determinata utilizzando diversi protocolli benconsolidati 34.
- Equilibrare la concentrazione di proteine tra i campioni 1-6 (in un volume uguale) utilizzando 1x tampone di lisi passiva per diluire, se necessario.
- Aggiungere 2-mercaptoethanol a un rapporto 1:10 a 6x buffer di esempio SDS.
- Aggiungere 6x buffer di campione SDS con 2-mercaptoethanol ai campioni 1-6 ad una concentrazione finale di 1x buffer di campione SDS.
- Riscaldare i campioni a 95 gradi centigradi per 5 minuti su un blocco di calore e raffreddare sul ghiaccio. I campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi o a -80 gradi centigradi fino al punto 2.1.19.
- Pipetta un volume contenente 30 g di proteine per i campioni da 1 a 6 ai pozzi in un gel di poliacrilammide a gradiente del 4-20%. Eseguire la procedura di immunoblotting in base al protocollo descritto nel Protocollo 1.
- Seme 100.000 cellule MCF-7 in una piastra di 12 pozzo e consentire alle cellule di crescere a 80-90% confluenza in 1 mL di media coltura cellulare. Contrassegnare i pozzetti per il seguente progetto sperimentale: ben 1: controllo DMSO (punto di riferimento); pozzo 2: A-485 (3 M); pozzo 3: A-485 (10 M); pozzo 4: MS-275 (3 M); pozzo 5: MS-275 (3 M) - A-485 (3 M); pozzo 6: MS-275 (3 M) - A-485 (10 M).
3. ChIP-qPCR
NOTA: Il protocollo riportato di seguito è descritto come esempio per gli inibitori di p300.
- Preparazione del buffer
NOTA: vedere la tabella 1 per le ricette del buffer. Le fasi generali del protocollo ChIP (ad esempio ricette tampone, tempi di lavaggio e tempi di centrifugazione) riportate di seguito sono modificate e adattate dalle raccomandazioni del produttore di un kit disponibile in mercato (c'è la tabella dei materiali)edalla letteratura 35,36.- Preparare il buffer di diluizione ChIP, il buffer di gonfiore dei nuclei, il buffer di lavaggio a basso contenuto di sale, il buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale, il buffer di lavaggio LiCl e il buffer TE. Conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare il buffer di lysis SDS, il buffer glicina 10x e il buffer di eluizione ChIP. Conservare a temperatura ambiente.
CAUTION: Si prega di controllare la scheda dati di sicurezza per tutte le sostanze chimiche prima di fare buffer per garantire una corretta gestione.
- Trattamento farmacologico
NOTA: vedere il protocollo supplementare (Schematico 3) per uno schema delle diluizioni di droga utilizzate nel passaggio 3.2.- Semina le cellule MCF-7 in due piatti di coltura di 15 cm e coltiva le cellule al 90% di confluenza in 12 mL del mezzo DMEM completo. Contrassegnare i piatti per il seguente disegno sperimentale: Piatto 1: controllo DMSO (punto di riferimento); Piatto 2: A-485 (3 M).
NOTA: per la tattura delle cellule MCF-7, utilizzare supporti DMEM completi e crescere a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Vedere la tabella 1 per la ricetta DMEM completa. - In un tubo conico sterile da 15 mL, pipette da 12 mL di supporti DMEM e pipette 6 L di DMSO. Mescolare bene.
- In un tubo conico sterile separato da 15 mL, pipette da 12 mL di supporti DMEM e pipette 6 L di A-485 (6 mM in DMSO) per ottenere una concentrazione finale di 3 M A-485. Mescolare bene.
- Aspirare i media dai piatti 1 e 2.
- Aggiungere i 12 mL di DMSO diluiti in DMEM (passaggio 3.2.2.) al piatto 1.
- Aggiungete il 12 mL di 3 M A-485 in DMEM (passaggio 3.2.3.) al piatto 2.
- Restituire i piatti di coltura cellulare all'incubatrice e incubare per 24 h.
- Semina le cellule MCF-7 in due piatti di coltura di 15 cm e coltiva le cellule al 90% di confluenza in 12 mL del mezzo DMEM completo. Contrassegnare i piatti per il seguente disegno sperimentale: Piatto 1: controllo DMSO (punto di riferimento); Piatto 2: A-485 (3 M).
- Fissazione cellulare
- Pipetta 330 L (27,5 L per mL) di 37% di formaldeide al supporto completo e ruota delicatamente la piastra da mescolare.
CAUTION: La formaldeide è tossica. Consultare la scheda dati di sicurezza per le procedure di movimentazione adeguate. - Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Pipette 2 mL di glicina 10x alla piastra e turbina per mescolare.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, mettere i piatti sul ghiaccio e scongelare un aliquot di cocktail inibitore della proteasi.
- Preparare le seguenti soluzioni per gli esempi DMSO e A-485 utilizzando i buffer preparati nel passaggio 3.1.
- 2 mL di PBS con una diluizione di 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi
- 1 mL di tampone di gonfiore nuclei con una diluizione 1:1,000 del cocktail inibitore della proteasi
- 0,5 mL di cuscinetto di lysi SDS con una diluizione di 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi
- Aspirare i media dai piatti di coltura cellulare e lavare le cellule due volte con 15 mL di PBS freddo.
- Pipetta 2 mL di PBS con il cocktail inibitore della proteasi (punto 3.3.6.1) ai piatti di coltura cellulare. Sollevare le cellule in soluzione utilizzando un raschietto cellulare.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuge. Raccogliere le celle rimanenti con PBS aggiuntivo, se necessario.
- Ruotare i tubi a 800 x g a 4 gradi centigradi per 5 minuti per pellet le cellule.
- Aspirare il supernatant e la pipetta 1 mL di tampone di gonfiore dei nuclei con il cocktail inibitore della proteasi (punto 3.3.6.2) al pellet. Rispendere il pellet e incubare sul ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare i tubi a 2.700 x g a 4 gradi centigradi per 5 minuti a pellet nuclei.
- Aspirare il supernatant e pipette 0,5 mL di cuscinetto di lysi SDS con il cocktail inibitore della proteasi (passo 3.3.6.3) al pellet. Rispendere il pellet e incubare sul ghiaccio per 10 min.
- Conservare i campioni di cromatina a -80 gradi centigradi fino al punto 3.4.1 o procedere immediatamente al punto 3.4.
- Pipetta 330 L (27,5 L per mL) di 37% di formaldeide al supporto completo e ruota delicatamente la piastra da mescolare.
- Sonicazione del DNA
- Trasferire 130 L di cromatina dal campione DMSO (passaggio 3.3.14) a due tubi di sonicazione del DNA utilizzando una pipetta (130 L ciascuno).
- Trasferire 130 L di cromatina dal campione A-485 (punto 3.3.14) a due tubi di sonicazione del DNA utilizzando una pipetta (130 L ciascuno).
- Sonicate il DNA a circa 150-200 frammenti di coppia di base utilizzando le seguenti impostazioni sonicatori: Peak Incident Power (W) di 175, Duty Factor del 10%, 200 Cicli per Burst e 430 s tempo di trattamento.
NOTA: le impostazioni di sonicazione possono differire tra i modelli e potrebbe essere necessario regolare le impostazioni per ottenere le dimensioni appropriate del frammento per le diverse linee di cella. - Conservare i campioni sul ghiaccio dopo la sonicazione.
- Trasferire la cromatina sonicata in un tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta e una centrifuga a 10.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min a pellet detriti.
- Pipette il supernatant (contiene cromatina sonicata) a un nuovo tubo e scartare i detriti. La cromatina sonicata può essere conservata a -80 gradi centigradi.
- Immunoprecipizione della cromatina (ChIP)
NOTA: vedere il protocollo supplementare (Schematico 3) per uno schema dei gruppi IP nel passaggio 3.5.- Misurare il contenuto proteico della cromatina sonicata per i campioni DMSO e A-485 del punto 3.4.6. Il contenuto proteico può essere misurato utilizzando protocolli consolidati34.
NOTA: Per semplicità, questo protocollo presupporrà che il contenuto proteico sia uguale e che venga utilizzato 100 L di cromatina sonicata. In caso contrario, il contenuto proteico dovrà essere equilibrato tra tutti i campioni in un volume uguale. - Pipette 100 L di cromatina srotomatica srotomatica DMSO a due tubi da 1,5 mL (100 L ciascuno). Pipette 400 L del buffer di diluizione ChIP (contenente una diluizione 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi) ad ogni tubo per portare il volume totale fino a 500 L. Rimuovere 5 L della soluzione da uno dei tubi e conservare a -20 gradi centigradi come INGRESSO DMSO.
- Pipette 100 L di a-485 di cromatina sonicata a due tubi da 1,5 mL (100 l L ciascuno). Pipette 400 L di buffer di diluizione ChIP (contenente una diluizione 1:1000 del cocktail inibitore della proteasi) ad ogni tubo per portare il volume totale fino a 500 L. Rimuovere 5 L della soluzione da uno dei tubi e conservare a -20 gradi centigradi come A-485 Input.
- Utilizzando una pipetta, aggiungere l'anticorpo immunoprecipitation (IP) (ad esempio il controllo IgG non specifico o l'anticorpo specifico H3K27ac) ai tubi corrispondenti per i campioni DMSO e A-485: ip #1 cromatina DMSO con anticorpo IgG (5-10 g); IP #2 cromatina DMSO con anticorpo H3K27ac (5-10 g); IP #3 a-485 con anticorpo IgG (5-10 g); IP #4 a-485 con anticorpo H3K27ac (5-10 g).
- Aggiungere 20 L di proteina A perline magnetiche ad ogni tubo. Assicurati che le perline siano ben riesmesse.
- Ruotare i campioni durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Pellet la proteina A perline magnetiche utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il supernante. Non disturbare le perline.
- Lavare le perline con 500 l A 1 mL del tampone di lavaggio a basso contenuto di sale e ruotare per 5 minuti a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso, pellet le perline utilizzando un separatore magnetico, e rimuovere il supernatant.
- Lavare le perline con 500 l A 1 mL del buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale e ruotare per 5 minuti a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso, pellet le perline utilizzando un separatore magnetico, e rimuovere il supernatant.
- Lavare le perline con 500 l A 1 mL del tampone di lavaggio LiCl e ruotare per 5 minuti a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso, pellet le perline utilizzando un separatore magnetico, e rimuovere il supernatant.
- Lavare le perline con 500 l a 1 mL di buffer TE e ruotare per 5 min a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso. Mantenere le perline nel buffer TE fino al passaggio 3.5.14.
- Rimuovere i campioni di ingresso (dai punti 3.5.2 e 3.5.3) dal congelatore e conservarsi sul ghiaccio.
- Scongelare un aliquot di Proteinase K.
- Pellet le perline utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il buffer TE dalle perline (dal punto 3.5.11).
- Aggiungere a ogni campione, inclusi i campioni di input, aggiungere un buffer di eluizione ChIP di 100 L: 1 L di Proteinase K. Incubare i campioni con agitazione a 62 gradi centigradi per 2 h utilizzando un termociclo.
- Dopo 2 h, i campioni di calore a 95 gradi centigradi per 10 min utilizzando un termociclo.
- Raffreddare i campioni a temperatura ambiente.
- Perline magnetiche pellet utilizzando un separatore magnetico e trasferire supernatant (contiene il DNA di interesse) in un nuovo tubo da 1,5 mL.
- Purificare il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR standard.
- Il DNA purificato può essere conservato a -20 gradi centigradi e può essere utilizzato come modelli nei protocolli qPCR standard. Seguire i protocolli del produttore per l'esecuzione di qPCR.
- Misurare il contenuto proteico della cromatina sonicata per i campioni DMSO e A-485 del punto 3.4.6. Il contenuto proteico può essere misurato utilizzando protocolli consolidati34.
- Analisi dei dati ChIP-qPCR
NOTA: Due metodi comuni per analizzare i risultati di ChIP-qPCR sono l'arricchimento della piega sull'anticorpo IgG e il metodo di input dell'1%. Un modello eccellente per entrambi i metodi di analisi è fornito da una fonte commerciale può essere utilizzato per calcolare rapidamente l'arricchimento della piega per ogni anticorpo IP/obiettivo diinteresse 37.- Per calcolare l'arricchimento della piega e l'input %, copiare e incollare i valori di zCt dai dati qPCR ottenuti per ogni anticorpo (IgG non specifico, l'anticorpo IP H3K27ac e l'input dell'1%) nell'area corrispondente nel modello di analisi e l'arricchimento di piegatura e l'input % di resa verranno popolati automaticamente.
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Representative Results
L'analisi dell'acetiltransferasi dell'istone in vitro (HAT) può essere utilizzata per sondare i composti che inibiscono l'attività p300 HAT verso un substrato istonetico. Figura 1A fornisce uno schema sperimentale per il test HAT. L'acido anacardico, un noto HATi3,38, è stato utilizzato in questo saggio in un intervallo di concentrazione da 12.5-100 . A 100 M, l'acido anacardico regola p300 catalizzato l'acetilazione istonetica a Histone 3, Lysines 9 e 18 rispetto al trattamento DMSO di controllo(Figura 1B, corsia 5 rispetto alla corsia 1). Un intervallo di concentrazione è stato utilizzato in questo saggio perché i dosaggi di droga più bassi non possono inibire notevolmente p300 attività HAT (Figura 1B, corsie 2-4 contro corsia 1). Nella corsia 6, nessun Acetyl-CoA è stato aggiunto alla reazione e serve come controllo negativo per la catalisi p300 e per i livelli basali di acetilazione istone su ricombinante H3.1 (Figura 1B). p300 e H3.1 sono stati utilizzati come controlli di carico (Figura 1B). Questi risultati dell'immunoblot sono stati quantificati utilizzando ImageJ39 (Figura 1C). Le variazioni di piegatura sono state calcolate confrontando l'intensità della banda di ogni campione con l'intensità della banda del controllo DMSO per ogni sonda di acetilazione. La quantificazione dell'acido anacardico a 100 M mostra una forte riduzione di H3K18ac e H3K9ac rispetto al controllo DMSO, confermando i risultati visivi nella Figura 1B.
Nel saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI), HDACi viene utilizzato come strumento per iperacetizzare gli istoni in cromatina prima della co-incubazione con un HATi24, come l'inibitore p300 A-4852,4. Lo scopo di questo saggio è quello di determinare l'efficacia di HATi per attenuare l'iperacetilazione istonea indotta da HDACi. Figura 2A fornisce uno schema sperimentale per il test ChHAI. In questo saggio, il trattamento delle cellule MCF-7 con HDACi MS-275 ha fortemente rieregolato l'acetilazione su Histone 3, su diversi residui di lino(Figura 2B, corsia 4 rispetto alla corsia 1). I livelli basali di H3K18ac e H3K27ac erano bassi, mostrando i vantaggi dell'aggiunta di un HDACi nel saggio ChHAI (Figura 2B, corsie 1-3). L'aggiunta di A-485 con MS-275 attenua l'accresciuta acetilazione istonea a H3K18 e H3K27, ma non H3K9 (Figura 2B, corsie 4-6). È importante sottolineare che H3K9ac non è regolato da p300 nella colturacellulare 2, mostrando la specificità di A-485 in questo esperimento. Questi risultati immunoblot sono stati quantificati nella figura 2C. I cambiamenti di piegatura sono stati calcolati confrontando l'intensità della banda di ogni campione con l'intensità della banda di MS-275 da solo (Lane 4) per ogni sonda di acetilazione. Le corsie 1-3 non sono state quantificate perché i livelli basali H3K18ac e H3K27ac non sono stati rilevati.
Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è un esperimento di coltura cellulare che studia le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. Può essere utilizzato per studiare gli effetti di HATi su elementi regolatori genici che controllano l'espressione oncogene25. Nella figura 3A è disponibile uno schema sperimentale per il protocollo ChIP-qPCR. Le cellule MCF-7 trattate con 3 M A-485 per 24 ore sono state sottoposte a ChIP-qPCR attraverso l'immunoprecipizione di complessi istone-DNA arricchiti in H3K27ac(Figura 3). Il DNA purificato è stato analizzato per la sequenza promotrice Cyclin D1. I primer ChIP-qPCR sono progettati in base a una specifica sequenza di DNA nel genoma e vengono utilizzati per rilevare la quantità relativa di DNA precipitato. La quantità di DNA precipitato riflette l'abbondanza della proteina di interesse nella regione genomica in esame. Infatti, nel campione DMSO, il DNA precipitato dall'anticorpo di controllo IgG produce un valore Ct superiore rispetto all'anticorpo H3K27ac nella reazione qPCR per il promotore Cyclin D1 (Figura 3B). Ciò indica che il controllo IgG non specifico ha precipitato meno complessi di proteine del DNA rispetto all'anticorpo specifico H3K27ac presso il promotore Cyclin D1. Questo si traduce in un arricchimento di 632,73 pieghe di H3K27ac sul controllo IgG non specifico (Figura 3B).
Questo arricchimento della piega fornisce la prova che l'anticorpo specifico H3K27ac è stato immunoprecipitato con successo gli istoni acetilati immunoprecipitati e che H3K27ac è arricchito presso il promotore Cyclin D1. Dopo aver convalidato la qualità dell'anticorpo H3K27ac, è possibile fare un confronto tra i gruppi trattati DMSO e A-485. Come illustrato nella Figura 3C, A-485 riduce l'arricchimento H3K27ac nel promotore di Cyclin D1 rispetto al controllo DMSO utilizzando il metodo %Input (risultato rappresentativo di n. 2). È importante sottolineare che A-485 è noto per ridurre significativamente H3K27ac nella colturacellulare 2,4.
ChIP-qPCR raw %I valori di input possono essere altamente variabili tra repliche biologiche indipendenti, nonostante la tendenza sperimentale sia riproducibile. Pertanto, può essere utile presentare i dati come una percentuale normalizzata del controllo DMSO per mostrare il rapporto riproducibile tra controllo e trattamento farmacologico10. Ad esempio, nella figura 3D, A-485 significativamente downregula l'occupazione H3K27ac presso il promotore Cyclin D1 (n. 2). L'analisi statistica si basava sul t-test dello Studente (P < 0,05).
Figura 1: L'acido anacardico inibisce l'attività enzimatica p300 in un saggio HAT. (A) Un diagramma schematico del saggio HAT, raffigurante la reazione ezimatica. (B) L'acido anacardico ha inibito con forza l'attività enzimatica p300 e ha ridotto l'acetilazione degli itoni a H3K18 e H3K9 a 100 M (corsia 5) rispetto al trattamento di controllo DMSO (corsia 1). La corsia 6 manca di Acetil-CoA nella reazione e ha servito come controllo negativo per l'acetilazione istonea. (C) I risultati dell'immunoblot in (B) sono stati quantificati. Le variazioni di piegatura sono state calcolate confrontando l'intensità della banda di ogni campione con l'intensità della banda del controllo DMSO per ogni sonda di acetilazione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'inibitore P300 A-485 attenua potentemente l'iperacetilazione istonea nel saggio ChHAI. (A) Un diagramma schematico del saggio ChHAI. (B) Nelle cellule MCF-7, l'inibitore HDAC MS-275 ha potentemente regolato l'acetilazione degli istoni a H3K18, K27 e K9 (corsia 4) rispetto al controllo DMSO (corsia 1). L'aggiunta di A-485, un noto inibitore di P300 HAT, con MS-275 ha attenuato l'aumento dell'acetilazione istonea a H3K18 e K27, ma non H3K9 (corsie 5-6 contro corsia 4). (C) I risultati dell'immunoblot in (B) sono stati quantificati. I cambiamenti di piegatura sono stati calcolati confrontando l'intensità della banda di ogni campione con l'intensità della banda di MS-275 da solo (Lane 4) per ogni sonda di acetilazione. Le corsie 1-3 non sono state quantificate perché i livelli basali H3K18ac e H3K27ac non sono stati rilevati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: l'inibitore P300 A-485 diminuisce i livelli di H3K27ac al promotore Cyclin D1 misurato da ChIP-qPCR. (A) Un diagramma schematico del protocollo ChIP-qPCR. (B) Valori QPCR Ct rappresentativi per il promotore Cyclin D1 per le immunoprecipitazioni IgG e H3K27ac. Il controllo IgG aveva un valore Ct più alto, indicando che l'anticorpo H3K27ac si è arricchito con successo per H3K27ac sull'anticorpo IgG non specifico. (C) Trattamento A-485 (3 M) per H3K27ac 24 h downregulated presso il promotore Cyclin D1 rispetto al trattamento di controllo DMSO nelle cellule MCF-7 (risultato rappresentativo di n. 2). (D) L'input %Input da due esperimenti ChIP indipendenti sono stati normalizzati al controllo DMSO come percentuale del controllo DMSO. Il trattamento con A-485 nelle cellule MCF-7 riduce significativamente l'occupazione H3K27ac presso il promotore Cyclin D1. L'analisi statistica si basava sul t-test dello Studente (P < 0,05). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer | Ricetta | |
| 10X buffer di glicina | 18,74 g di glicina con PBS fino a dissoluzione e aggiungere PBS a 200 ml. | |
| 10X Buffer in esecuzione | 250 mM Tris, 1,9 M glicina, 1% SDS Sciogliere 30,0 g di base Tris, 144,0 g di glicina e 10,0 g di SDS in 1000 ml di H2O. Il pH del buffer deve essere 8.3 e non è necessaria alcuna regolazione del pH. Conservare il buffer in esecuzione a temperatura ambiente e diluire a 1X prima dell'uso. |
|
| 10X TBST | 2,42 g di base Tris, 8 g di NaCl, 2 ml di 50% Tween 20, aggiungere ddH2O a 1 litro | |
| 1X TBST con 5% di latte | 5 g di latte in polvere per circa 100 ml di 1X TBST | |
| Buffer di analisi 5X: | 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100 | |
| 5X Buffer di lysi passiva | fare uno stock aqueo contenente 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Tritone X-100 e 50% (vol/vol) glicerolo in ddH2O. | |
| 6X Sodio Dodecyl Solfato (SDS) | 0,375 M Tris pH 6.8, 6 ml di glicerolo, 1,2 g di SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 mg di bromofenolo blu, aggiungere acqua a 10 ml. | |
| Buffer di diluizione ChIP | 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl | |
| Buffer di eluzione ChIP | 1% SDS (w/v) e 0,1 M NaHCO3 in ddH2O autoclaved | |
| DMEM completo per celle MCF-7: | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 10% siero di vitello bovino (BCS), penicillina (10 unità/ml) e streptomicina (10 mg/ml) | |
| Buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale | 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl. | |
| Tampone di lavaggio LiCl | 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deossicholate di sodio, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0. | |
| Tampone di lavaggio a basso contenuto di sale | 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl. | |
| Cuscinetto di gonfiore Nuclei | 5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40 | |
| Buffer di lysi SDS | 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 | |
| Buffer TE | 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. | |
| Buffer di trasferimento | 25 mM Tris, 190 mM di glicina, 20% di metanolo e controllare il pH e regolare al pH 8.3 se necessario. | |
Tabella 1: Ricette dei buffer e della soluzione utilizzata.
File supplementari: schemi sperimentali supplementari per i protocolli 1-3. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'acetiltransferasi di l'acetilsione (KAT) acetilate diversi residui di litina sulle code dell'istoneo e sui fattori di trascrizione per regolare la trascrizionegenica 2,3. Il lavoro degli ultimi due decenni ha rivelato che i KAT, come CBP/p300, PCAF e GCN5, interagiscono con i fattori di trascrizione oncogenici e aiutano a guidare la crescita del tumore in diversi tipi di tumore solido4,5,9,15,16,17,18. A causa del loro ruolo emergente nella promozione della crescita del tumore, i KAT sono studiati come nuovi obiettivi nel trattamento del cancro. I nuovi inibitori KAT (KATi) devono essere testati attentamente e rigorosamente per la potenza, la selettività e la sicurezza prima di passare all'uso in clinica. Prove recenti hanno dimostrato che i composti KATi precedentemente descritti mostrano effetti fuori bersaglio e sono stati scarsamente caratterizzati prima di essere ampiamente utilizzati nella letteratura scientifica come sonde chimiche21. Pertanto, sono necessari metodi rigorosi per la caratterizzazione KATi. Descritti qui sono tre protocolli che possono essere utilizzati insieme per caratterizzare e convalidare nuovi inibitori mirati alla funzione istone acetiltransferase (HAT) dei KAT: un saggio HAT in vitro, il saggio ChHAI e ChIP-qPCR. Questi protocolli utilizzano CBP/p300 e i loro inibitori come esempi, ma questi metodi possono essere facilmente adattati per l'applicazione futura nello studiare altri KAT.
Il test HAT è semplice e un modo conveniente per screening composti per la potenza nell'inibire la funzione HAT in una provetta. I HAT purificati (ricombinanti4,10 o immunoprecipitati40) possono essere testati in questo saggio, ma il ricombinante CBP/p300 viene utilizzato come esempio in questo protocollo. CBP/p300 hanno un dominio HAT ezimatico che trasferisce un gruppo acetil da Acetyl-CoA a un residuo di lisina su un substrato bersaglio3. I bersagli istoni CBP/p300 più caratterizzati sono Histone 3 Lysine 18 e 27 (H3K18 e H3K27, rispettivamente)2,3,10,11. Nel saggio HAT, il dominio purificato p300 HAT viene incubato con Acetil-CoA e Histone 3.1 come substrato. Durante il periodo di incubazione, p300 catalerà l'acetilazione su diversi residui di H3.1, tra cui H3K18 e H3K27. L'abbondanza relativa di acetilazione su questi residui può essere misurata tramite immunoblotting. Questa reazione in provetta può essere utilizzata per lo screening di nuovi composti che si legano a p300 e inibiscono la sua attività HAT (HATi). Ad esempio, l'acido anacardico, un noto HATi38, regola potentemente l'acetilazione degli istoni sia a H3K18 che a H3K9 rispetto al controllo DMSO (Figura 1B, corsia 5 rispetto alla corsia 1). È di fondamentale importanza aggiungere Acetyl-CoA alle reazioni sperimentali (Figura 1B, Corsie 1-5) o p300 catalisi dell'acetilazione istonea non si verificherà (Figura 1B, Corsia 6). L'assenza di Acetil-CoA può essere utilizzata anche come controllo negativo per la catalisi p300 e per i livelli basali di acetilazione istonea su ricombinante H3.1.
Quando si esegue il test HAT, è importante assicurarsi che ogni reazione riceva la stessa quantità di p300, H3.1 e Acetyl-CoA. I livelli H3.1 e p300 nell'immunoblot fungono da controlli di carico per il gel. Per questo saggio, anticorpi istoni istoni specifici del sito o un anticorpo pan-acetil possono essere utilizzati per l'immunoblotting. Quando si ottimizza per migliorare la qualità dell'immunoblot è fondamentale utilizzare anticorpi convalidati per l'immunoblotting e seguire inizialmente le raccomandazioni del produttore per la diluizione degli anticorpi. Le diluizioni anticorpehe utilizzate nella sezione Protocollo sono di riferimento e le diluizioni possono essere modificate in base ai risultati degli esperimenti iniziali (ad esempio, se il segnale è troppo forte, l'anticorpo può essere ulteriormente diluito). Grazie alla sua semplicità, il saggio HAT è un ottimo esperimento di partenza per lo screening di nuovi inibitori. Tuttavia, il test HAT presenta degli svantaggi. Una delle principali preoccupazioni con il saggio HAT è che i composti che sono efficaci in una provetta possono rivelarsi inefficaci in un sistema vivente. Questo è un problema perché l'efficacia composta nella coltura cellulare può essere alterata da problemi di permeabilità cellulare, metabolismo cellulare, e stabilità composta. Inoltre, i KAT, in particolare CBP/p300, hanno molte interazioni proteina-proteina che regolano la loro attività KAT nellacoltura cellulare 3,41,42. Pertanto, è essenziale caratterizzare ulteriormente gli inibitori identificati nel saggio HAT negli esperimenti di colturacellulare 20,23.
Il saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) è il secondo protocollo in cantiere ed è utile per convalidare gli effetti dei nuovi inibitori nella coltura cellulare. Questo saggio utilizza inibitori HDAC (HDACi)24 per indurre l'iperacetilazione istonetica nelle cellule perché l'acetilazione basale può essere troppo bassa per rilevare su un immunoblot. Le linee cellulari di scelta sono pre-incubate con un HDACi per consentire l'accumulo di cromatina acetilata prima dell'aggiunta di un HATi. Dopo aver co-incubato l'HDACi e l'HATi, le cellule vengono librate e sottoposte a procedure standard di immunoblotting per specifici siti di acetilazione istonea. Lo scopo di questo saggio è quello di determinare l'efficacia del nuovo HATi per attenuare l'iperacetilazione istonea indotta da HDACi. Le cellule esposte a HDACi devono avere livelli significativamente più elevati di acetilazione istonea rispetto alle cellule esposte al solvente DMSO (Figura 2B, corsia 4 rispetto alla corsia 1). L'aggiunta dell'HATi insieme all'HDACi dovrebbe ridurre il segnale di immunoblot rispetto al solo trattamento HDACi(Figura 2B, corsie 5-6 rispetto alla corsia 4). I livelli basali di acetilazione istone(Figura 2B, Corsie 1-3) sono difficili da rilevare e sottolinea l'importanza di aggiungere un HDACi in questo protocollo. MS-275 (Entinostat) viene utilizzato come esempio, ma altri HDACi possono essere utilizzati24,43. MS-275 ha concentrazioni inibitorie variabili rispetto alle HDAC di classe I e generalmente inibisce HDAC1 e HDAC3 con concentrazioni di micromolari da nanomolari a basse,rispettivamente 43,44. Un'ampia gamma di concentrazioni di MS-275 è utilizzata nella letteratura45,46,47, ma un trattamento da 3 M fornisce un aumento robusto e riproducibile dell'acetilazione dell'istone nelle cellule MCF-7. Pertanto, può essere utile eseguire uno schermo iniziale con una vasta gamma di concentrazioni di HDACi e HATi per determinare la concentrazione ottimale per il saggio ChHAI quando si utilizza una linea cellulare diversa.
Simile al saggio HAT, il protocollo dell'immunoblot potrebbe dover essere ottimizzato per ottenere risultati di qualità attraverso l'uso di anticorpi appropriati, diluizioni ottimali degli anticorpi e caricamento del campione attentamente controllato. Il caricamento del campione attentamente controllato è essenziale per il successo di questo protocollo e può essere ottenuto attraverso l'equilibrio del contenuto proteico di tutti i campioni e attraverso il pipettamento di un volume uguale di campioni nei pozzi del gel immunoblot. Un anticorpo pan-acetil può essere utilizzato per sondare in questo protocollo. Tuttavia, dovrebbe essere integrato con anticorpi acetil site-specific perché i KAT hanno specificità per alcuni residui di lisina istonea e HATi non influisce su tutti i siti di acetilazione istone nellacoltura cellulare 1,2,4,5,10,11. Gli inibitori che sono potenti nel ridurre l'acetilazione degli istoni sia nei saggi HAT che ChHAI sono forti candidati per un'ulteriore valutazione. È importante sottolineare che i test HAT e ChHAI hanno la limitazione di fornire solo dati sui cambiamenti globali nell'acetilazione dei toni. Questa limitazione crea la necessità di caratterizzare gli effetti dei nuovi HATi in specifiche regioni del genoma.
Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è il protocollo finale della pipeline e valuta le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. In questo saggio, le regioni genomiche arricchite in H3K27ac vengono purificate attraverso l'immunoprecipizione (IP) e analizzate utilizzando primer del DNA in qPCR. Questa tecnica fornisce informazioni meccanicistiche su come HATi influisce sulle modifiche degli istoni presso promotori geni e stimolatori. ChIP-qPCR è una tecnica robusta ed è meno costosa del sequenziamento dell'intero genoma (ad esempio, ChIP-seq), ma può essere difficile da ottimizzare a causa di molti passaggi che influenzano il risultato. Il passo più difficile da ottimizzare correttamente è il passaggio 3.5, l'immunoprecipitation. Questo passaggio è difficile da ottimizzare perché se il DNA purificato al punto 3.5.20 è altamente diluito può causare scarsi risultati nella reazione qPCR (ad esempio, nessuna amplificazione della sequenza genica bersaglio e valori di Ct molto elevati). Il successo della fase IP dipende da diversi fattori, come l'abbondanza dell'obiettivo proteico di interesse e la qualità dell'anticorpo IP. È fondamentale convalidare la qualità dell'anticorpo IP H3K27ac rispetto al controllo IgG per verificare il successo del passaggio IP. Ad esempio, nella figura 3B, l'anticorpo specifico H3K27ac visualizza l'arricchimento 632.73-fold sul controllo IgG non specifico. Ciò indica che l'anticorpo H3K27ac è di alta qualità e che H3K27ac è arricchito al promotore Cyclin D1. Dopo la convalida dell'anticorpo IP, è possibile fare un confronto tra i gruppi trattati DMSO e A-485. Come illustrato nella Figura 3C, A-485 riduce l'arricchimento H3K27ac nel promotore di Cyclin D1 rispetto al controllo DMSO utilizzando il metodo %Input (risultato rappresentativo di n. 2). Se l'anticorpo IP risulta di bassa qualità e non mostra l'arricchimento della piega negli esperimenti iniziali, provare ad aumentare il numero di cellule al punto 3.2.1. Numeri cellulari più elevati possono contribuire a compensare la scarsa qualità degli anticorpi aumentando il contenuto proteico totale del lisato e consentiranno di aggiungere più proteine alla reazione IP.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni da fare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di James ed Esther King Biomedical Research Program (6JK03 e 20K07), e Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 e 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation e UF Health Cancer Center. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. Osking e il Dr. Andrea Lin per il loro sostegno durante il processo di pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
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