Summary
Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.
Abstract
Acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam acetilação de resíduos de lisesina em histones e outras proteínas para regular a dinâmica da cromatina e a expressão genética. Os TRTs, como o CBP/p300, estão sob intensa investigação como alvos terapêuticos devido ao seu papel crítico na tumorgênese de diversos cânceres. O desenvolvimento de novos inibidores de moléculas pequenas visando a função histone acetyltransferase (HAT) dos KATs é desafiador e requer ensaios robustos que podem validar a especificidade e potência dos inibidores potenciais.
Este artigo descreve um pipeline de três métodos que fornecem rigorosa validação in vitro para novos inibidores de HAT (HATi). Estes métodos incluem um ensaio hat do tubo de ensaio, ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI) e PCR quantitativo de imunoprecipitação de Chromatina (ChIP-qPCR). No ensaio hat, hats recombinantes são incubados com histones em uma reação de tubo de ensaio, permitindo acetilação de resíduos específicos de lisesina nas caudas de histona. Esta reação pode ser bloqueada por um HATi e os níveis relativos de acetilação de histona específica do local podem ser medidos através de imunoblotação. Os inibidores identificados no ensaio hat precisam ser confirmados no ambiente celular.
O ensaio chhai usa imunoblotting para tela para o novo HATi que atenua a robusta hiperacetilação de histones induzidos por um inibidor de histon deacetilase (HDACi). A adição de um HDACi é útil porque os níveis basais de acetilação de histona podem ser difíceis de detectar através da imunoblotação.
Os ensaios HAT e ChHAI medem as mudanças globais na acetilação de histona, mas não fornecem informações sobre acetilação em regiões genômicas específicas. Portanto, o ChIP-qPCR é usado para investigar os efeitos do HATi nos níveis de acetilação de histona em elementos regulatórios genéticos. Isso é realizado através da imunoprecipitação seletiva de complexos histono-DNA e análise do DNA purificado através de qPCR. Juntos, esses três ensaios permitem a validação cuidadosa da especificidade, potência e mecanismo de ação da nova HATi.
Introduction
As acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam a acetilação de resíduos de lisesina nas proteínas histona e não histona1,,2,,3,,4. Pesquisas recentes revelam que os KATs e sua função acetiltransferase podem promover o crescimento sólido do tumor4,5,6,7,8,9. Por exemplo, a proteína de ligação CREB (CBP)/p300 são dois KATs paralogos que regulam inúmeras vias de sinalização no câncer2,,3. CBP/p300 tem uma função de acetiltransferase de histona bem caracterizada (HAT) e catalisa histone 3 Lysine 27 acetilação (H3K27ac)2,,4,,5,10,,11, um marcador importante para melhoradores ativos, regiões promotoras e transcrição genética ativa12,,13,,14. CBP/p300 servem como co-ativadores críticos para vias de sinalização pró-crescimento em tumores sólidos, ativando a transcrição de oncogenes através da acetilação de histones e outros fatores de transcrição4,,9,,15,,16,,17,18. Devido ao seu papel na progressão do tumor, CBP/p300 e outros KATs estão sob investigação para o desenvolvimento de novos inibidores que bloqueiam sua função oncogênica4,,5,6,,7,,8,,9,,18,,19,20. A-485 e GNE-049 representam duas tentativas bem sucedidas de desenvolver inibidores potentes e específicos para CBP/p3004,9. Inibidores adicionais estão atualmente sob investigação para CBP/p300 e outros KATs.
A qualidade dos inibidores kat previamente descritos (KATi) está sendo questionada, com muitos inibidores mostrando efeitos-alvo e má caracterização21. Portanto, a caracterização rigorosa e validação de novos candidatos a medicamentos é essencial para o desenvolvimento de sondas químicas de alta qualidade. Delineados aqui estão três protocolos que formam um pipeline para triagem e validando rigorosamente a potência e especificidade do novo KATi, com foco específico em inibir a função HAT (HATi) de KATs. CBP/p300 e seus inibidores são usados como exemplos, mas esses protocolos podem ser adaptados para outros KATs que possuem uma função HAT7.
O primeiro protocolo é um ensaio in vitro de acetiltransferase de histona (HAT) que utiliza p300 recombinantes purificados e histones em uma reação controlada do tubo de ensaio. Este ensaio é simples de executar, é econômico, pode ser usado para tela compostos em uma configuração de baixo rendimento, e não requer materiais radioativos. Neste protocolo, p300 recombinante catalisa acetilação de lise em caudas de histona durante um breve período de incubação e os níveis de acetilação de histona são medidos usando procedimentos padrão de imunoblotação. A reação enzimática pode ser realizada na presença ou ausência de inibidores CBP/p300 para testar compostos que reduzem a acetilação de histona. Além disso, o ensaio HAT pode ser usado para verificar se novos compostos são seletivos para CBP/p300, avaliando sua atividade contra outros KATs purificados, como o PCAF. O ensaio hat é um excelente ponto de partida para investigar novos inibidores devido à sua simplicidade, baixo custo e capacidade de determinar a potência/seletividade de um inibidor. De fato, este protocolo é frequentemente usado na literatura como uma tela in vitro5,10. No entanto, os inibidores identificados no ensaio hat nem sempre são eficazes na cultura celular porque uma reação do tubo de ensaio é muito mais simples do que um sistema celular vivo. Portanto, é essencial caracterizar ainda mais os inibidores nos experimentos de cultura celular22,23.
O segundo protocolo no pipeline é o ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI). Este ensaio baseado em célula utiliza inibidores de histona deacetilase (HDACi) como uma ferramenta para hiperacetilar histones em cromatina antes da co-incubação com um HATi24. A acetilação de histona basal pode ser baixa na cultura celular, dificultando a sondagem para via imunoblotação sem a adição de um HDACi para aumentar a acetilação. O objetivo do ensaio chhai é identificar o novo HATi que pode atenuar o aumento da acetilação de histona causada pela inibição do HDAC. As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, relativa facilidade de execução, e o uso de células na cultura, o que proporciona mais relevância fisiológica do que o ensaio hat do tubo de ensaio. Semelhante ao ensaio hat, este protocolo usa imunoblotting padrão para coleta de dados.
Os ensaios HAT e ChHAI fornecem dados sobre a potência de novos compostos para inibir a acetilação global de histona, mas não fornecem informações sobre como esses compostos afetam modificações em regiões genômicas específicas. Portanto, o protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) é um experimento de cultura celular que investiga interações DNA-proteína em regiões específicas do genoma. No protocolo ChIP, a cromatina é interligada para preservar as interações DNA-proteína. A cromatina é então extraída das células e o complexo DNA-proteína sofre imunoprecipitação seletiva para a proteína de interesse (por exemplo, usando um anticorpo específico para H3K27ac). O DNA é então purificado e analisado usando qPCR. Por exemplo, o ChIP-qPCR pode ser usado para determinar se um novo HATi diminui a acetilação de histona em oncogenes individuais, como Cyclin D125. Embora o ChIP-qPCR seja uma técnica comum usada no campo, pode ser difícil otimizar4,,10,26. Este protocolo fornece dicas para evitar possíveis armadilhas que podem ocorrer durante a realização do procedimento ChIP-qPCR e inclui verificações de controle de qualidade que devem ser realizadas nos dados.
Quando utilizados em conjunto, esses três protocolos permitem a caracterização rigorosa e validação do novo HATi. Além disso, esses métodos oferecem muitas vantagens porque são fáceis de executar, relativamente baratos e fornecem dados sobre acetilação de histona global e regional.
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Protocol
1. Ensaio in vitro HAT
- Preparação de buffer
NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão.- Prepare 5x tampão de ensaio e 6x Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e armazene a -20 °C. Aliquot SDS em alíquotas de 1 mL.
- Prepare o tampão de corrida de gel SDS 10x e 10x TBST e armazene à temperatura ambiente.
- Prepare 1x tampão de transferência e armazene a 4 °C.
ATENÇÃO: Verifique a ficha técnica de segurança de todos os produtos químicos utilizados neste protocolo. SDS, DTT e azul bromofenol são tóxicos e não devem ser ingeridos, inalados ou expostos à pele ou aos olhos. Consulte a ficha técnica de segurança para obter os procedimentos adequados de manuseio. Por favor, use uma capa de fumaça química para manusear produtos químicos perigosos.
- Reação hat
NOTA: O ácido anacárico é um inibidor p300 conhecido3 e é usado como exemplo para demonstrar como o ensaio hat pode identificar novos inibidores p300. Consulte o Protocolo Suplementar ( Esquema1)para um esquema da etapa 1.2.1.- Prepare a seguinte reação enzimática em um tubo PCR de 0,2 mL: 2 μL de tampão de ensaio 5x, 1 μL de p300 purificado (0,19 μg/μL), 1 μL de ácido anacárico (HATi) ou controle DMSO diluído em tampão de ensaio 1x e 2 μL de ddH2O. Pré-incubar esta mistura por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 3 μL de acetil-CoA de 100 μM e 1 μL de H3.1 purificado (0,2 μg/μL) à reação.
- Incubar a mistura completa de reação a 30 °C por 1 h em um ciclo térmico PCR.
- Adicione 2-mercaptoetanol a uma proporção de 1:10 para o buffer de amostra SDS de 6x.
- Remova amostras do ciclor térmico PCR e adicione 2 μL de SDS de 6x (com 2 mercaptoetanol adicionado) à mistura de reação.
ATENÇÃO: O 2-mercaptoetanol é tóxico e deve ser usado dentro de uma capa de fumaça química. Consulte a ficha técnica de segurança para o manuseio adequado. - Aqueça amostras a 95 °C por 5 minutos em um bloco de calor e esfrie no gelo. Armazene as amostras a -20 ou -80 °C ou realize eletroforese de gel e imunoblotting conforme detalhado abaixo.
- Eletroforese em gel e imunoblotting
NOTA: Se não estiver familiarizado com eletroforese de gel e imunoblotting, consulte este procedimento padrão27 para obter detalhes adicionais sobre como executar as etapas 1.3.1-1.3.17. Informações adicionais podem ser encontradas aqui28,29,30,31,32,33.- Pipeta 10 μL de amostras (a partir da etapa 1.2.5.) para os poços de um gel de poliacrilamida de 4-20% gradiente. Pipeta 5 μL de escada proteica em um dos poços como referência de peso molecular. Execute o gel a 120 V por 90 min usando um tanque de gel.
- Transfira o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilidene (PVDF) a 100 V por 70 min usando um tanque de transferência.
- Remova a membrana do aparelho de transferência e coloque-a em um recipiente plástico. Bloqueie a membrana adicionando 1x TBST (contendo 5% de leite) ao recipiente e agite suavemente por 1h à temperatura ambiente.
- Remova o 1x TBST da etapa 1.3.3. Incubar a membrana durante a noite com anticorpos acetilais selecionados no local (por exemplo, H3K18ac ou anticorpos primários H3K27ac a uma diluição de 1:5.000 em 1x TBST contendo 5% de leite) a 4 °C com agitação suave.
- Remova a solução de anticorpos primária. Lave a membrana 2x com 1x TBST (sem leite) em temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos cada lavagem.
- Diluir o anticorpo secundário em 1:20.000 em 1x TBST (contendo 5% de leite) e incubar a membrana por 1h à temperatura ambiente com agitação suave.
- Remova a solução de anticorpos secundários. Lave a membrana 2x com 1x TBST (sem leite) em temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos cada lavagem.
- Escorra o 1x TBST da membrana. Misture a solução de peróxido de substrato HRP e a solução de luminol substrato HRP em uma proporção de 1:1 (1 mL de cada) e pipeta 2 mL da solução combinada para a superfície da membrana.
- Incubar a solução com a membrana por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Escorra o substrato de quimiluminescente em excesso da membrana em uma toalha de papel e coloque a membrana em plástico dentro de um porta-fitas de raio-x.
- Mude-se para uma sala escura dedicada ao processamento de filme de raios-X. Exponha a membrana a uma filme de raio-x colocando o filme em cima da membrana e fechando o por 30 s.
NOTA: O tempo de contato entre o filme e a membrana deve ser determinado experimentalmente. Sinais fortes precisarão de exposições curtas (segundos) e sinais mais fracos podem precisar de exposições mais longas. - Remova o filme de raio-x do e processe o filme executando-o através de um processador de filme de raio-x. Consulte os manuais do fabricante para obter instruções específicas sobre como processar a filme de raio-x.
- Remova a membrana do plástico e lave-a com ddH2O por 5 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.
- Incubar a membrana com 0,2 M NaOH por 5 min a temperatura ambiente com agitação suave.
- Lave a membrana com ddH2O por 5 min a temperatura ambiente com agitação suave.
- Bloqueie a membrana adicionando 1x TBST (contendo 5% de leite) ao recipiente e agite suavemente por 1h à temperatura ambiente.
- Adicione a próxima diluição de anticorpos primários (por exemplo, teste para H3K27ac se o primeiro anticorpo usado for H3K18ac) e agite durante a noite a 4 °C. Repetição de passos 1.3.4-1.3.17 até que todas as sondas de anticorpos sejam concluídas.
2. Ensaio chhai
- Tratamentos in vitro de medicamentos e análise de histones acetilados
NOTA: A-485 é um p300 HATi potente e bem caracterizado2,4 . Este inibidor será utilizado nos ensaios restantes devido à sua eficácia e especificidade na cultura celular. MS-275 (Entinostat)24 é um HDACi que aumenta significativamente os níveis de acetilação de histona e é usado para facilitar a detecção de sondas de acetilação com imunoblotação padrão. Ver Protocolo Suplementar (Esquema 2), para um esquema das diluições da droga utilizadas na etapa 2.1.- Semente 100.000 células MCF-7 em uma placa de 12 poços e permitem que as células cresçam até 80-90% de confluência em 1 mL de meio de cultura celular. Marque os poços para o seguinte design experimental: bem 1: controle DMSO (ponto de referência); bem 2: A-485 (3 μM); bem 3: A-485 (10 μM); bem 4: MS-275 (3 μM); bem 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); bem 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
NOTA: Para cultivar células MCF-7, use mídia DMEM completa e permita que as células cresçam a 37 °C com 5% de CO2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita completa do DMEM. - Às 24 horas após a semeadura, pipeta 4 mL de mídia DMEM completa para um tubo cônico estéril de 15 mL. Pipeta 2 μL de MS-275 (6 mM em DMSO) para os 4 mL de médio para uma concentração final de 3 μM MS-275.
- Pipeta 2 μL de DMSO a 4 mL de meio em um tubo cônico separado estéril de 15 mL.
ATENÇÃO: Verifique a ficha de dados de segurança para obter o manuseio adequado do DMSO. Alguns tipos de luvas não são classificados para o manuseio de DMSO. - Aspire o meio de cultura celular dos poços 4-6 e pipeta 1 mL de 3 μM MS-275 em média (passo 2.1.2) para cada poço. Descarte MS-275 diluído nãouado.
- Aspire o meio de cultura celular dos poços 1-3 e pipeta 1 mL de DMSO diluído (passo 2.1.3) para cada poço. Descarte DMSO diluído nãoutado.
- Devolva as células à incubadora e incubar por 4h para permitir o acúmulo de histonas acetiladas em células expostas à MS-275 (poços 4-6).
NOTA: MS-275 é um HDACi e causará hiperacetilação histona24. Esta pré-incubação de 4h é necessária para permitir que o MS-275 induza a hiperacetilação antes da adição de A-485, que reduz a acetilação histona2,4. - Após 4h de incubação com MS-275, prepare as seguintes diluições em tubos estéreis separados de 1,5 mL por tubulação: 1,0 μL de DMSO a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de DMSO e 0,5 μL A-485 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de DMSO e 0,5 μL de A-485 (20 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de DMSO e 0,5 μL de MS-275 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de A-485 (6 mM) e 0,5 μL de MS-275 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de A-485 (20 mM) e 0,5 μL de MS-275 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM.
- Aspirar o meio de cultura celular dos poços 1-6 e pipeta 1 mL de diluição 1 a poço 1, diluição 2 a poço 2, diluição 3 a poço 3, diluição 4 a poço 4, diluição de 5 a poço 5, e diluição 6 a poço 6.
NOTA: Uma regra geral é equilibrar o conteúdo DMSO (solvente) entre grupos experimentais e não exceder 0,1% de teor de DMSO na cultura celular para evitar toxicidade celular e mudanças na proliferação. - Devolva as células à incubadora e cultura por 20 h.
- Após 20 h, aspire o meio de cultura celular dos poços 1-6.
- Lave as células tubondo 1 mL de PBS para poços 1-6. Aspire a PBS.
- Adicione 100 μL de 1x tampão de lise passiva (ver Tabela 1) aos poços 1-6. Armazene a placa de cultura celular (com amostras em tampão de lise passiva) a −80 °C durante a noite para congelamento e lise das células.
ATENÇÃO: Verifique a ficha de dados de segurança de todos os produtos químicos antes de fazer buffers. O CDTA pode causar sérios danos oculares e irritação. - Descongele amostras em temperatura ambiente com agitação suave por 10 minutos. Transfira amostras para separar tubos de 1,5 mL e coloque imediatamente no gelo.
- Meça a concentração proteica de cada amostra. A concentração de proteínas pode ser determinada usando vários protocolos bem estabelecidos34.
- Concentração de proteína equilibrada entre as amostras 1-6 (em volume igual) utilizando 1x tampão de lise passiva para diluir, conforme necessário.
- Adicione 2-mercaptoetanol a uma proporção de 1:10 para 6x tampão de amostra SDS.
- Adicione 6x tampão de amostra SDS com 2 mercaptoetanol às amostras 1-6 a uma concentração final de 1x tampão de amostra SDS.
- Aqueça amostras a 95 °C por 5 minutos em um bloco de calor e esfrie no gelo. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C ou -80 °C até o passo 2.1.19.
- Pipeta um volume contendo 30 μg de proteína para amostras 1-6 para os poços em um gel de poliacrilamida de 4-20% gradiente. Realizar o procedimento de imunoblotação de acordo com o protocolo descrito no Protocolo 1.
- Semente 100.000 células MCF-7 em uma placa de 12 poços e permitem que as células cresçam até 80-90% de confluência em 1 mL de meio de cultura celular. Marque os poços para o seguinte design experimental: bem 1: controle DMSO (ponto de referência); bem 2: A-485 (3 μM); bem 3: A-485 (10 μM); bem 4: MS-275 (3 μM); bem 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); bem 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
3. ChIP-qPCR
NOTA: O protocolo abaixo é descrito para inibidores do p300 como exemplo.
- Preparação de buffer
NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão. As etapas gerais do protocolo ChIP (por exemplo, receitas tampão, tempos de lavagem e tempos de centrifugação) abaixo são modificadas e adaptadas das recomendações do fabricante de um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e da literatura35,36.- Prepare o tampão de diluição chip, tampão de inchaço dos núcleos, tampão de lavagem de sal baixo, tampão de lavagem de sal alto, tampão de lavagem LiCl e tampão DE TE. Armazenar a 4 °C.
- Prepare o tampão de lise SDS, o tampão de glicina de 10x e o tampão de elução ChIP. Armazene à temperatura ambiente.
ATENÇÃO: Verifique a ficha de dados de segurança de todos os produtos químicos antes de fazer buffers para garantir o manuseio adequado.
- Tratamento medicamentoso
NOTA: Consulte o Protocolo Suplementar ( Esquema3) para um esquema das diluições de medicamentos utilizadas na etapa 3.2.- Células seed MCF-7 em dois pratos de cultura de 15 cm e crescer células para 90% de confluência em 12 mL do meio DMEM completo. Marque os pratos para o seguinte design experimental: Prato 1: Controle DMSO (ponto de referência); Prato 2: A-485 (3 μM).
NOTA: Para cultivar células MCF-7, use mídia DMEM completa e cresça a 37 °C com 5% de CO2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita completa do DMEM. - Em um tubo cônico estéril de 15 mL, pipeta 12 mL de mídia DMEM e pipeta 6 μL de DMSO. Misture bem.
- Em um tubo cônico estéril separado de 15 mL, pipeta 12 mL de mídia DMEM e pipeta 6 μL de A-485 (6 mM em DMSO) para obter uma concentração final de 3 μM A-485. Misture bem.
- Aspire a mídia do Prato 1 e 2.
- Adicione os 12 mL de DMSO diluídos no DMEM (etapa 3.2.2.) ao Prato 1.
- Adicione os 12 mL de 3 μM A-485 em DMEM (etapa 3.2.3.) ao Prato 2.
- Devolva os pratos da cultura celular à incubadora e incubar por 24 horas.
- Células seed MCF-7 em dois pratos de cultura de 15 cm e crescer células para 90% de confluência em 12 mL do meio DMEM completo. Marque os pratos para o seguinte design experimental: Prato 1: Controle DMSO (ponto de referência); Prato 2: A-485 (3 μM).
- Fixação celular
- Pipeta 330 μL (27,5 μL por mL) de 37% de formaldeído para a mídia completa e girar suavemente a placa para misturar.
ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico. Consulte a ficha técnica de segurança para obter os procedimentos adequados de manuseio. - Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Pipeta 2 mL de 10x de glicina na placa e redemoinho para misturar.
- Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Após a incubação, coloque pratos no gelo e descongele uma alíquota de coquetel inibidor de protease.
- Prepare as seguintes soluções para as amostras DMSO e A-485 utilizando os buffers preparados na etapa 3.1.
- 2 mL de PBS com diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease
- 1 mL de tampão de inchaço de núcleos com diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease
- 0,5 mL de tampão de lise SDS com diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease
- Aspire a mídia dos pratos de cultura celular e lave as células duas vezes com 15 mL de PBS frio.
- Pipeta 2 mL de PBS com o coquetel inibidor de protease (passo 3.3.6.1) aos pratos de cultura celular. Levante as células em solução usando um raspador de células.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Colete células remanescentes com PBS adicional, se necessário.
- Gire tubos a 800 x g a 4 °C por 5 minutos para pelotar as células.
- Aspire o supernasal e pipeta 1 mL de tampão de inchaço de núcleos com o coquetel inibidor de protease (passo 3.3.6.2) à pelota. Resuspend a pelota e incubar no gelo por 10 minutos.
- Centrifugar os tubos a 2.700 x g a 4 °C por 5 min para os núcleos de pelotas.
- Aspire o supernasal e pipeta 0,5 mL de tampão de lise SDS com o coquetel inibidor de protease (passo 3.3.6.3) à pelota. Resuspend a pelota e incubar no gelo por 10 minutos.
- Armazene as amostras de cromatina a -80 °C até o passo 3.4.1 ou proceda imediatamente para a etapa 3.4.
- Pipeta 330 μL (27,5 μL por mL) de 37% de formaldeído para a mídia completa e girar suavemente a placa para misturar.
- Sônica de DNA
- Transfira 130 μL de cromatina da amostra DMSO (etapa 3.3.14) para dois tubos de sônica de DNA usando uma pipeta (130 μL cada).
- Transfira 130 μL de cromatina da amostra A-485 (etapa 3.3.14) para dois tubos de sônica de DNA usando uma pipeta (130 μL cada).
- Sonicate o DNA para cerca de 150-200 fragmentos de par de base usando as seguintes configurações de sonicator: Peak Incident Power (W) de 175, Duty Factor de 10%, 200 Ciclos por Explosão e 430 s tempo de tratamento.
NOTA: As configurações de sônica podem diferir entre modelos e as configurações podem precisar ser ajustadas para alcançar o tamanho adequado do fragmento para diferentes linhas celulares. - Mantenha amostras no gelo após a sônicação.
- Transfira a cromatina sônica para um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta e centrífuga a 10.000 x g a 4 °C por 10 minutos para pelotas de detritos.
- Pipeta o sobrenante (contém cromatina sônica) a um novo tubo e descartar os detritos. A cromatina sônica pode ser armazenada a -80 °C.
- Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
NOTA: Consulte o Protocolo Suplementar ( Esquema3) para um esquema dos grupos IP na Etapa 3.5.- Meça o teor proteico da cromatina sônica para as amostras DMSO e A-485 da Etapa 3.4.6. O teor de proteínas pode ser medido usando protocolos bem estabelecidos34.
NOTA: Para simplificar, este protocolo assumirá que o teor de proteínas é igual e serão utilizados 100 μL de cromatina sônica. Caso contrário, o conteúdo proteico precisará ser equilibrado entre todas as amostras em um volume igual. - Pipeta 100 μL de cromatina sônica DMSO para dois tubos de 1,5 mL (100 μL cada). Pipeta 400 μL de tampão de diluição chIP (contendo uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease) para cada tubo para trazer volume total até 500 μL. Remova 5 μL da solução de um dos tubos e armazene a -20 °C como Entrada DMSO.
- Pipeta 100 μL de cromatina sônica A-485 para dois tubos de 1,5 mL (100 μL cada). Pipeta 400 μL de tampão de diluição chIP (contendo uma diluição de 1:1000 do coquetel inibidor de protease) para cada tubo para trazer volume total até 500 μL. Remova 5 μL da solução de um dos tubos e armazene a -20 °C como Entrada A-485.
- Usando uma pipeta, adicione o anticorpo de imunoprecipitação (IP) (por exemplo, controle IgG não específico ou anticorpo específico H3K27ac) aos tubos correspondentes para as amostras DMSO e A-485: IP #1 cromatina DMSO com anticorpo IgG (5-10 μg); IP #2 cromatina DMSO com anticorpo H3K27ac (5-10 μg); IP #3 cromatina A-485 com anticorpo IgG (5-10 μg); IP #4 cromatina A-485 com anticorpo H3K27ac (5-10 μg).
- Adicione 20 μL de proteína A contas magnéticas a cada tubo. Certifique-se de que as contas estão bem resuspendidas.
- Gire as amostras durante a noite a 4 °C.
- Pellte a proteína Uma conta magnética usando um separador magnético e remova o supernasce. Não perturbe as contas.
- Lave as contas com 500 μL a 1 mL do tampão de lavagem de sal baixo e gire por 5 min a 4 °C. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas usando um separador magnético, e remova o supernatante.
- Lave as contas com 500 μL a 1 mL do tampão de lavagem de sal alto e gire por 5 min a 4 °C. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas usando um separador magnético, e remova o supernatante.
- Lave as contas com 500 μL a 1 mL do tampão de lavagem LiCl e gire por 5 min a 4 °C. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas usando um separador magnético, e remova o supernatante.
- Lave as contas com 500 μL a 1 mL de tampão te e gire por 5 min a 4 °C. Faça uma rápida rotação para baixo. Mantenha as contas no buffer TE até o passo 3.5.14.
- Remova as amostras de entrada (da etapa 3.5.2 e 3.5.3) do congelador e mantenha no gelo.
- Descongele uma alíquota de Proteinase K.
- Pelota as contas usando um separador magnético e remova o tampão te das contas (a partir da etapa 3.5.11).
- Adicione 100 μL chIP elution buffer + 1 μL de Proteinase K a cada amostra, incluindo as amostras de entrada. Incubar amostras com agitação a 62 °C por 2 h usando um termociclador.
- Após 2h, aqueça amostras a 95 °C por 10 minutos usando um termociclador.
- Esfrie as amostras à temperatura ambiente.
- Contas magnéticas de pelotas usando um separador magnético e transferem supernascentes (contém o DNA de interesse) para um novo tubo de 1,5 mL.
- Purifique o DNA usando um kit de limpeza PCR padrão.
- O DNA purificado pode ser armazenado a -20 °C e pode ser usado como modelos em protocolos qPCR padrão. Siga os protocolos do fabricante para executar qPCR.
- Meça o teor proteico da cromatina sônica para as amostras DMSO e A-485 da Etapa 3.4.6. O teor de proteínas pode ser medido usando protocolos bem estabelecidos34.
- Análise de dados chIP-qPCR
NOTA: Dois métodos comuns para analisar os resultados do ChIP-qPCR são o enriquecimento de dobras sobre o anticorpo IgG e o método de entrada de 1%. Um excelente modelo para ambos os métodos de análise é fornecido por uma fonte comercial pode ser usado para calcular rapidamente o enriquecimento de dobras para cada anticorpo IP/alvo de interesse37.- Para calcular o enriquecimento do fold e % Entrada, copie e cole os valores ΔCt dos dados qPCR obtidos para cada anticorpo (IgG não específico, o anticorpo IP H3K27ac e o Insumo de 1%) na região correspondente no modelo de análise e a Entrada de Enriquecimento e Rendimento do Fold será preenchida automaticamente.
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Representative Results
O ensaio in vitro histone acetyltransferase (HAT) pode ser usado para sondar compostos que inibem a atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. A Figura 1A fornece um esquema experimental para o ensaio hat. O ácido anacácárico, um conhecido HATi3,38, foi utilizado neste ensaio em uma faixa de concentração de 12,5-100 μM. A 100 μM, o ácido anacárico diminui a p300 catalisada acetilação histona em Histone 3, Lysines 9 e 18 contra o controle tratamento DMSO(Figura 1B, pista 5 versus pista 1). Utilizou-se uma faixa de concentração neste ensaio porque doses mais baixas de medicamentos podem não inibir muito a atividade p300 HAT(Figura 1B, faixas 2-4 versus pista 1). Na Raia 6, nenhum Acetil-CoA foi adicionado à reação e serve como um controle negativo para a catálise p300 e para níveis basais de acetilação de histona em H3.1 recombinante (Figura 1B). os níveis de proteína p300 e H3.1 foram utilizados como controles de carga(Figura 1B). Estes resultados do imunoblot foram quantificados por meio da ImageJ39 (Figura 1C). As alterações do fold foram calculadas comparando a intensidade da banda de cada amostra com a intensidade da banda do controle DMSO para cada sonda de acetilação. A quantificação do ácido anacárico a 100 μM mostra uma redução potente em H3K18ac e H3K9ac versus o controle DMSO, confirmando os resultados visuais na Figura 1B.
No ensaio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI), o HDACi é usado como uma ferramenta para hiperacetilar histones em cromatina antes da co-incubação com um HATi24, como o inibidor p300 A-4852,4. O objetivo deste ensaio é determinar a eficácia do HATi para atenuar a hiperacetilação de histona induzida por HDACi. A Figura 2A fornece um esquema experimental para o ensaio chhai. Neste ensaio, o tratamento de células MCF-7 com HDACi MS-275 fortemente regulada acetilação em Histone 3, em vários resíduos de liseina(Figura 2B, faixa 4 versus pista 1). Os níveis basais de H3K18ac e H3K27ac foram baixos, mostrando os benefícios de adicionar um HDACi no ensaio ChHAI (Figura 2B, faixas 1-3). A adição de A-485 com MS-275 atenua o aumento da acetilação histona em H3K18 e H3K27, mas não H3K9(Figura 2B, faixas 4-6). É importante ressaltar que o H3K9ac não é regulado pelo p300 na cultura celular2,mostrando a especificidade do A-485 neste experimento. Estes resultados do imunoblot foram quantificados na Figura 2C. As alterações do fold foram calculadas comparando a intensidade da banda de cada amostra com a intensidade da banda apenas MS-275 (Faixa 4) para cada sonda de acetilação. As faixas 1-3 não foram quantificadas porque os níveis basais H3K18ac e H3K27ac não foram detectados.
Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) é um experimento de cultura celular que investiga interações DNA-proteína em regiões específicas do genoma. Pode ser usado para investigar os efeitos do HATi em elementos regulatórios genéticos que controlam a expressão oncogene25. A Figura 3A fornece um esquema experimental para o protocolo ChIP-qPCR. As células MCF-7 tratadas com 3 μM A-485 durante 24 horas foram submetidas a ChIP-qPCR através da imunoprecipitação de complexos histono-DNA enriquecidos em H3K27ac(Figura 3). O DNA purificado foi analisado para a sequência de promotor cyclin D1. Os primers chIP-qPCR são projetados contra uma sequência de DNA específica no genoma e são usados para detectar a quantidade relativa de DNA precipitado. A quantidade de DNA precipitado reflete a abundância da proteína de interesse na região genômica sob investigação. De fato, na amostra DMSO, o DNA precipitado pelo anticorpo de controle IgG produz um valor ct maior do que o anticorpo H3K27ac na reação qPCR para o promotor Cyclin D1(Figura 3B). Isso indica que o controle IgG não específico precipitou menos complexos de proteína de DNA do que o anticorpo específico H3K27ac no promotor Cyclin D1. Isso se traduz em um enriquecimento de 632,73 vezes de H3K27ac sobre o controle IgG não específico(Figura 3B).
Este enriquecimento de dobra fornece evidências de que o anticorpo específico H3K27ac com sucesso imunoprecipitado histones acetilados e que H3K27ac é enriquecido no promotor Cyclin D1. Após validar a qualidade do anticorpo H3K27ac, pode ser feita uma comparação entre os grupos tratados DMSO e A-485. Como mostrado na Figura 3C, A-485 reduz o enriquecimento H3K27ac no promotor Cyclin D1 versus o controle DMSO usando o método %Input (resultado representativo de n=2). É importante ressaltar que o A-485 é conhecido por reduzir significativamente o H3K27ac na cultura celular2,4.
Os valores brutos de insumos chIP-qPCR podem ser altamente variáveis entre as réplicas biológicas independentes, apesar da tendência experimental ser reprodutível. Portanto, pode ser útil apresentar os dados como um percentual normalizado de controle DMSO para mostrar a razão reprodutível entre controle e tratamento medicamentoso10. Por exemplo, na Figura 3D,A-485 diminui significativamente a ocupação H3K27ac no promotor Cyclin D1 (n=2). A análise estatística foi baseada no teste t do Aluno (*P < 0,05).
Figura 1: O ácido anacárico inibe a atividade enzimática p300 em um ensaio hat. (A) Um diagrama esquemático do ensaio HAT, representando a reação enzimática. (B) O ácido anacárico inibiu potentemente a atividade enzimática p300 e diminuiu a acetilação de histona em H3K18 e H3K9 a 100 μM (pista 5) versus o tratamento de controle DMSO (pista 1). A pista 6 não tem Acetyl-CoA na reação e serviu como um controle negativo para acetilação histona. (C) Os resultados do imunoblot em (B) foram quantificados. As alterações do fold foram calculadas comparando a intensidade da banda de cada amostra com a intensidade da banda do controle DMSO para cada sonda de acetilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: inibidor p300 A-485 atenua potentemente a hiperacetilação de histona no ensaio ChHAI. (A) Um diagrama esquemático do ensaio ChHAI. (B) Nas células MCF-7, o inibidor de HDAC MS-275 potencialmente aumentou a acetilação de histona em H3K18, K27 e K9 (pista 4) contra o controle DMSO (pista 1). A adição de A-485, um conhecido inibidor p300 HAT, com MS-275 atenuado o aumento da acetilação histona em H3K18 e K27, mas não H3K9 (pistas 5-6 versus pista 4). (C) Os resultados do imunoblot em (B) foram quantificados. As alterações do fold foram calculadas comparando a intensidade da banda de cada amostra com a intensidade da banda apenas MS-275 (Faixa 4) para cada sonda de acetilação. As faixas 1-3 não foram quantificadas porque os níveis basais H3K18ac e H3K27ac não foram detectados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: o inibidor P300 A-485 diminui os níveis de H3K27ac no promotor Cyclin D1 medido por ChIP-qPCR. (A) Um diagrama esquemático do protocolo ChIP-qPCR. (B) Representante qPCR Ct valores para o promotor Cyclin D1 para as imunoprecipitações IgG e H3K27ac. O controle IgG tinha um valor ct mais alto, indicando que o anticorpo H3K27ac enriqueceu com sucesso para H3K27ac sobre o anticorpo IgG não específico. (C) Tratamento A-485 (3 μM) para 24 h regulado H3K27ac no promotor Cyclin D1 em comparação com o tratamento de controle DMSO em células MCF-7 (resultado representativo de n=2). (D) A entrada %de dois experimentos chip independentes foi normalizada para o controle DMSO como uma porcentagem do controle DMSO. O tratamento com células A-485 em células MCF-7 diminui significativamente a ocupação H3K27ac no promotor Cyclin D1. A análise estatística foi baseada no teste t do Aluno (*P < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer | Receita | |
| Tampão de glycina 10X | 18,74 g de glycina com PBS até dissolver e adicionar PBS a 200 ml. | |
| Buffer de execução de 10X | 250 mM Tris, 1,9 M de glycina, 1% SDS Dissolver 30,0 g de base Tris, 144,0 g de glicina e 10,0 g de SDS em 1000 ml de H2O. O pH do buffer deve ser de 8,3 e não é necessário ajuste de pH. Armazene o buffer de funcionamento à temperatura ambiente e dilua para 1X antes de usar. |
|
| 10X TBST | 2,42 g de base Tris, 8g de NaCl, 2 ml de 50% Tween 20, adicionar ddH2O a 1 litro | |
| 1X TBST com 5% de leite | 5g de leite em pó por aproximadamente 100 ml de 1X TBST | |
| Tampão de ensaio 5X: | 500 mM HEPES, pH 7.5, 0,4 % Triton X-100 | |
| 5X Tampão de lise passiva | fazer um estoque aquoso contendo 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 e 50% (vol/vol) gliceol em ddH2O. | |
| Sulfato de dodecyl de sódio 6X (SDS) | 0,375 M Tris pH 6.8, 6 ml de glicerol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 mg de azul bromofenol, adicionar água a 10 ml. | |
| Tampão de diluição chIP | 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl | |
| Tampão de elução chIP | 1% SDS (w/v) e 0,1 M NaHCO3 em ddH2O autoclaved | |
| DMEM completo para células MCF-7: | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementado com soro de bezerro bovino de 10% (BCS), penicilina (10 unidades/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) | |
| Tampão de lavagem de sal alto | 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl. | |
| Tampão de lavagem LiCl | 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% desoxicolato de sódio, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0. | |
| Tampão de lavagem de sal baixo | 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl. | |
| Tampão de inchaço dos núcleos | 5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40 | |
| Tampão de lise SDS | 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 | |
| Tampão te | 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. | |
| Tampão de transferência | 25 mM Tris, 190 mM de gliccina, 20% de metanol e verifique o pH e ajuste para pH 8,3 se necessário. | |
Tabela 1: Receitas dos buffers e solução utilizada.
Arquivos complementares: Esquemas experimentais complementares para protocolos 1-3. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Acetiltransferases de lysina (KATs) acetilamam vários resíduos de lisesina nas caudas de histona e fatores de transcrição para regular a transcrição genética2,3. O trabalho nas últimas duas décadas revelou que os KATs, como CBP/p300, PCAF e GCN5, interagem com fatores de transcrição oncogênica e ajudam a impulsionar o crescimento do tumor em vários tipos de tumores sólidos4,5,,9,,15,,16,,17,18. Devido ao seu papel emergente na promoção do crescimento do tumor, os KATs estão sendo investigados como novos alvos no tratamento do câncer. Os novos inibidores de KAT (KATi) precisam ser cuidadosamente e rigorosamente testados para potência, seletividade e segurança antes de se mudarem para uso na clínica. Evidências recentes mostraram que compostos kati descritos anteriormente exibem efeitos-alvo e foram mal caracterizados antes de serem amplamente utilizados na literatura científica como sondas químicas21. Portanto, são necessários métodos rigorosos para a caracterização kati. Descritos aqui estão três protocolos que podem ser usados juntos para caracterizar e validar novos inibidores visando a função histone acetyltransferase (HAT) de KATs: um ensaio de CHAPÉU in vitro, o ensaio ChHAI e ChIP-qPCR. Esses protocolos usam CBP/p300 e seus inibidores como exemplos, mas esses métodos podem ser facilmente adaptados para aplicação futura na investigação de outros KATs.
O ensaio HAT é simples e uma maneira econômica de selecionar compostos para a potência na inibição da função HAT em um tubo de ensaio. HATs purificados (recombinante4,10 ou imunoprecipitados40) podem ser testados neste ensaio, mas cbp/p300 recombinante é usado como exemplo neste protocolo. CBP/p300 tem um domínio HAT enzimático que transfere um grupo de acetil de Acetyl-CoA para um resíduo de liseina em um substrato de destino3. Os alvos histonas CBP/p300 mais caracterizados são Histone 3 Lysine 18 e 27 (H3K18 e H3K27,respectivamente) 2,3,10,11. No ensaio HAT, o domínio purificado p300 HAT é incubado com Acetyl-CoA e Histone 3.1 como substrato. Durante o período de incubação, p300 catalisará acetilação em vários resíduos de H3.1, incluindo H3K18 e H3K27. A abundância relativa de acetilação nesses resíduos pode ser medida através da imunoblotação. Esta reação do tubo de ensaio pode ser usada para tela para novos compostos que se ligam ao p300 e inibem sua atividade HAT (HATi). Por exemplo, o ácido anacárico, um conhecido HATi38,potencialmente diminui a acetilação de histona tanto em H3K18 quanto H3K9 em comparação com o controle DMSO(Figura 1B, faixa 5 versus pista 1). É extremamente importante adicionar Acetil-CoA às reações experimentais(Figura 1B, Faixas 1-5) ou p300 catalise de acetilação de histona não ocorrerá(Figura 1B, Pista 6). A ausência de Acetil-CoA também pode ser usada como um controle negativo para a catálise p300 e para níveis basais de acetilação de histona em H3.1 recombinante.
Ao realizar o ensaio HAT, é importante garantir que cada reação receba a mesma quantidade de p300, H3.1 e Acetyl-CoA. Os níveis de H3.1 e p300 no imunoblot servem como controles de carregamento para o gel. Para este ensaio, anticorpos de acetil de histona específicos do local ou um anticorpo pan-acetil podem ser usados para imunoblotação. Ao otimizar para melhorar a qualidade do imunoblot é crucial usar anticorpos validados para imunoblotação e seguir inicialmente as recomendações do fabricante para a diluição de anticorpos. As diluições de anticorpos utilizadas na seção Protocolo são para referência e as diluições podem ser alteradas com base nos resultados dos experimentos iniciais (por exemplo, se o sinal for muito forte, o anticorpo pode ser ainda mais diluído). Devido à sua simplicidade, o ensaio HAT é um excelente experimento inicial para a triagem de novos inibidores. No entanto, o ensaio hat tem desvantagens. Uma grande preocupação com o ensaio hat é que compostos que são eficazes em um tubo de ensaio podem se mostrar ineficazes em um sistema vivo. Isso é um problema porque a eficácia composta na cultura celular pode ser alterada por problemas de permeabilidade celular, metabolismo celular e estabilidade composta. Além disso, os KATs, especificamente CBP/p300, possuem muitas interações proteína-proteína que regulam sua atividade KAT na cultura celular3,,41,,42. Portanto, é essencial caracterizar ainda mais os inibidores identificados no ensaio hat em experimentos de cultura celular20,23.
O ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI) é o segundo protocolo no pipeline e é útil para validar os efeitos de novos inibidores na cultura celular. Este ensaio utiliza inibidores de HDAC (HDACi)24 para induzir a hiperacetilação histona nas células porque a acetilação basal pode ser muito baixa para detectar em um imunobloto. As linhas celulares escolhidas são pré-incubadas com um HDACi para permitir o acúmulo de cromatina acetilada antes da adição de um HATi. Após a co-incubação do HDACi e HATi, as células são lícitas e submetidas a procedimentos padrão de imunobloco para locais específicos de acetilação de histona. O objetivo deste ensaio é determinar a eficácia do novo HATi para atenuar a hiperacetilação de histona induzida por HDACi. As células expostas ao HDACi devem ter níveis significativamente mais elevados de acetilação de histona do que as células expostas ao solvente DMSO(Figura 2B, faixa 4 versus faixa 1). Espera-se que a adição do HATi junto com o HDACi reduza o sinal de imunoblot em comparação apenas com o tratamento HDACi(Figura 2B, faixas 5-6 versus pista 4). Os níveis basais de acetilação de histona(Figura 2B, Faixas 1-3) são difíceis de detectar e destacam a importância de adicionar um HDACi neste protocolo. MS-275 (Entinostat) é usado como exemplo, mas outros HDACi podem ser usados24,43. O MS-275 tem concentrações inibitórias relatadas variáveis versus HDACs classe I e geralmente inibe HDAC1 e HDAC3 com nanomolar a baixas concentrações de micromolar,respectivamente 43,44. Uma ampla gama de concentrações de MS-275 é usada na literatura45,46,47, mas um tratamento de 3 μM proporciona um aumento robusto e reprodutível na acetilação de histona nas células MCF-7. Portanto, pode ser benéfico executar uma tela inicial com uma ampla gama de concentrações HDACi e HATi para determinar a concentração ideal para o ensaio ChHAI ao usar uma linha celular diferente.
Semelhante ao ensaio hat, o protocolo de imunoblot pode precisar ser otimizado para obter resultados de qualidade através do uso de anticorpos apropriados, diluições de anticorpos ideais e carregamento de amostras cuidadosamente controlado. O carregamento de amostras cuidadosamente controlado é essencial para o sucesso deste protocolo e pode ser alcançado através do equilíbrio do teor proteico de todas as amostras e através da pipetação igual volume de amostras nos poços do gel de imunoblot. Um anticorpo pan-acetil pode ser usado para sondagem neste protocolo. No entanto, ele deve ser complementado com anticorpos de acetil específicos do local porque os KATs têm especificidade para certos resíduos de histone lysina e HATi não afeta todos os locais de acetilação de histona na cultura celular1,2,,4,,5,10,11. Inibidores que são potentes na redução da acetilação de histona nos ensaios HAT e ChHAI são fortes candidatos para uma avaliação posterior. É importante ressaltar que os ensaios HAT e ChHAI têm a limitação de fornecer apenas dados sobre mudanças globais na acetilação de histona. Essa limitação cria a necessidade de caracterizar os efeitos do novo HATi em regiões específicas do genoma.
Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) é o protocolo final no pipeline e avalia interações DNA-proteína em regiões específicas do genoma. Neste ensaio, as regiões genômicas enriquecidas em H3K27ac são purificadas através de imunoprecipitação (IP) e analisadas usando primers de DNA em qPCR. Esta técnica fornece uma visão mecanicista sobre como o HATi afeta modificações de histonas em promotores e intensificadores genéticos. ChIP-qPCR é uma técnica robusta e é menos dispendionada do que o sequenciamento de genoma inteiro (por exemplo, ChIP-seq), mas pode ser difícil de otimizar devido a muitas etapas que afetam o resultado. O passo mais difícil de otimizar corretamente é o passo 3.5, a imunoprecipitação. Esta etapa é difícil de otimizar porque se o DNA purificado na etapa 3.5.20 é altamente diluído pode causar resultados ruins na reação qPCR (por exemplo, nenhuma amplificação da sequência genética alvo e valores ΔCt muito altos). O sucesso da etapa ip depende de vários fatores, como a abundância da meta proteica de interesse e a qualidade do anticorpo IP. É crucial validar a qualidade do anticorpo IP H3K27ac versus o controle IgG para verificar o sucesso da etapa IP. Por exemplo, na Figura 3B,o anticorpo específico H3K27ac exibe enriquecimento de 632,73 vezes sobre o controle IgG não específico. Isso indica que o anticorpo H3K27ac é de alta qualidade e que o H3K27ac é enriquecido no promotor Cyclin D1. Após a validação do anticorpo IP, pode ser feita uma comparação entre os grupos tratados DMSO e A-485. Como mostrado na Figura 3C, A-485 reduz o enriquecimento H3K27ac no promotor Cyclin D1 versus o controle DMSO usando o método %Input (resultado representativo de n=2). Se o anticorpo IP se mostrar de baixa qualidade e não mostrar enriquecimento de dobras em experimentos iniciais, tente aumentar o número de células na etapa 3.2.1. Números mais altos de células podem ajudar a compensar a má qualidade de anticorpos, aumentando o teor total de proteínas do lysate e permitirão que mais proteínas sejam adicionadas à reação ip.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações para fazer.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa de Pesquisa Biomédica James e Esther King (6JK03 e 20K07), e do Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 e 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation e UF Health Cancer Center. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Dr. Zachary Osking e à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
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