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Cancer Research

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Abstract

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en histonas y otras proteínas para regular la dinámica de la cromatina y la expresión génica. Los TCC, como cbP/p300, están bajo intensa investigación como dianas terapéuticas debido a su papel crítico en la tumorigenesis de diversos tipos de cáncer. El desarrollo de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a la función de la histona acetiltransferasa (HAT) de los TCA es un reto y requiere ensayos robustos que puedan validar la especificidad y potencia de los posibles inhibidores.

En este artículo se describe una canalización de tres métodos que proporcionan una validación in vitro rigurosa para nuevos inhibidores de HAT (HATi). Estos métodos incluyen un ensayo HAT de tubo de ensayo, un ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI) y PCR cuantitativo con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-qPCR). En el ensayo HAT, los HAT recombinantes se incuban con histonas en una reacción del tubo de ensayo, lo que permite la acetilación de residuos específicos de lisina en las colas de histona. Esta reacción puede ser bloqueada por un HATi y los niveles relativos de acetilación de histona específica del sitio se pueden medir a través de inmunoblotting. Los inhibidores identificados en el ensayo HAT deben ser confirmados en el entorno celular.

El ensayo ChHAI utiliza inmunoblotting para detectar nuevos HATi que atenúan la hiperacetilación robusta de las histonas inducidas por un inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi). La adición de un HDACi es útil porque los niveles basales de la acetilación de histona pueden ser difíciles de detectar a través de inmunoblotting.

Los ensayos HAT y ChHAI miden los cambios globales en la acetilación de histona, pero no proporcionan información sobre la acetilción en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, ChIP-qPCR se utiliza para investigar los efectos de HATi en los niveles de acetilación de histona en los elementos reguladores de genes. Esto se logra a través de la inmunoprecipitación selectiva de complejos histone-ADN y el análisis del ADN purificado a través de qPCR. Juntos, estos tres ensayos permiten la validación cuidadosa de la especificidad, potencia y mecanismo de acción de la nueva HATi.

Introduction

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en proteínas histonas y no histonas1,2,3,4. Investigaciones recientes revelan que los KAT y su función acetiltransferasa pueden promover el crecimiento sólido del tumor4,5,6,7,8,9. Por ejemplo, la proteína de unión a CREB (CBP)/p300 son dos KAT paralogos que regulan numerosas vías de señalización en el cáncer2,,3. CBP/p300 tienen una función de histona acetiltransferasa (HAT) bien caracterizada y catalizan Histone 3 lisina 27 acetillación (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcador importante para potenciadores activos, regiones promotoras y transcripción genética activa12,13,14. CBP/p300 sirven como co-activadores críticos para las vías de señalización pro-crecimiento en tumores sólidos mediante la activación de la transcripción de oncogenes a través de la acetilación de histonas y otros factores de transcripción4,9,15,16,17,18. Debido a su papel en la progresión tumoral, CBP/p300 y otros KAT están siendo investigados para el desarrollo de nuevos inhibidores que bloquean su función oncogénica4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 y GNE-049 representan dos intentos exitosos de desarrollar inhibidores potentes y específicos para CBP/p3004,,9. Actualmente se están investigando inhibidores adicionales para CBP/p300 y otros TCC.

Se está cuestionando la calidad de los inhibidores de la KAT descritos anteriormente (KATi), con muchos inhibidores que muestran los efectos diana y la mala caracterización21. Por lo tanto, la caracterización y validación rigurosas de nuevos candidatos a medicamentos es esencial para el desarrollo de sondas químicas de alta calidad. Aquí se describen tres protocolos que forman una canalización para el cribado y la validación rigurosa de la potencia y especificidad de la nueva KATi, con un enfoque específico en la inhibición de la función HAT (HATi) de los KAT. CBP/p300 y sus inhibidores se utilizan como ejemplos, pero estos protocolos se pueden adaptar para otros KAT que tienen una función HAT7.

El primer protocolo es un ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) que utiliza p300 recombinante purificado e histonas en una reacción controlada del tubo de ensayo. Este ensayo es fácil de realizar, es rentable, se puede utilizar para examinar compuestos en un entorno de bajo rendimiento y no requiere materiales radiactivos. En este protocolo, la acetilación de lisina recombinante p300 cataliza la lisina en las colas histonas durante un breve período de incubación y los niveles de acetilación de histona se miden mediante procedimientos de inmunoblotting estándar. La reacción enzimática se puede realizar en presencia o ausencia de inhibidores de CBP/p300 para detectar compuestos que reducen la acetilación de histona. Además, el ensayo HAT se puede utilizar para verificar si los compuestos nuevos son selectivos para CBP/p300 evaluando su actividad contra otros KAT purificados, como pcAF. El ensayo HAT es un excelente punto de partida para investigar nuevos inhibidores debido a su simplicidad, bajo costo y la capacidad de determinar la potencia/selectividad de un inhibidor. De hecho, este protocolo se utiliza a menudo en la literatura como una pantalla in vitro5,10. Sin embargo, los inhibidores identificados en el ensayo HAT no siempre son eficaces en el cultivo celular porque una reacción del tubo de ensayo es mucho más simple que un sistema celular vivo. Por lo tanto, es esencial caracterizar aún más los inhibidores en los experimentos de cultivo celular22,,23.

El segundo protocolo en la canalización es el ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI). Este ensayo basado en células utiliza inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi) como una herramienta para hiperacetilar histonas en cromatina antes de la incubación con un HATi24. La acetilación basal de histona puede ser baja en el cultivo celular, lo que dificulta la sondeo a través de inmunoblotting sin la adición de un HDACi para aumentar la acetilación. El propósito del ensayo ChHAI es identificar nuevos HATi que pueden atenuar el aumento de la acetilción histona causada por la inhibición del HDAC. Las ventajas de este ensayo incluyen su bajo costo, relativa facilidad de realizar, y el uso de células en el cultivo, que proporciona más relevancia fisiológica que el ensayo HAT del tubo de ensayo. Al igual que el ensayo HAT, este protocolo utiliza inmunoblotting estándar para la recopilación de datos.

Los ensayos HAT y ChHAI proporcionan datos sobre la potencia de los nuevos compuestos para inhibir la acetilación de la histona global, pero no proporcionan información sobre cómo estos compuestos afectan las modificaciones en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, el protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) es un experimento de cultivo celular que investiga las interacciones ADN-proteína en regiones específicas del genoma. En el protocolo ChIP, la cromatina se reticula para preservar las interacciones ADN-proteína. A continuación, la cromatina se extrae de las células y el complejo de proteínas del ADN se somete a inmunoprecipitación selectiva para la proteína de interés (por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico para H3K27ac). El ADN se purifica y analiza utilizando qPCR. Por ejemplo, ChIP-qPCR se puede utilizar para determinar si una nueva HATi regula la acetilción histona en oncogenes individuales, como Cyclin D125. Mientras que ChIP-qPCR es una técnica común utilizada en el campo, puede ser difícil optimizar4,10,26. Este protocolo proporciona consejos para evitar posibles escollos que pueden producirse al realizar el procedimiento ChIP-qPCR e incluye comprobaciones de control de calidad que se deben realizar en los datos.

Cuando se utilizan juntos, estos tres protocolos permiten la caracterización y validación rigurosas de la nueva HATi. Además, estos métodos ofrecen muchas ventajas porque son fáciles de realizar, relativamente baratos y proporcionan datos sobre la acetilación de histona global y regional.

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Protocol

1. Ensayo HAT in vitro

  1. Preparación de búferes
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para las recetas de búfer.
    1. Preparar el tampón de ensayo 5x y el sulfato de Dodecyl de sodio 6x (SDS) y almacenar a -20 oC. Alícuota SDS en 1 ml de alícuotas.
    2. Prepare el tampón de funcionamiento de gel SDS 10x y 10 veces TBST y guárdelo a temperatura ambiente.
    3. Preparar 1x tampón de transferencia y almacenar a 4 oC.
      ADVERTENCIA: Compruebe la ficha de datos de seguridad para ver todos los productos químicos utilizados en este protocolo. La SDS, la TDT y el azul de bromofenol son tóxicos y no deben ingerirse, inhalarse ni exponerse a la piel ni a los ojos. Consulte la ficha de datos de seguridad para conocer los procedimientos de manipulación adecuados. Utilice una campana de humo química para manipular productos químicos peligrosos.
  2. Reacción HAT
    NOTA: El ácido anacardico es un inhibidor conocido de p3003 y se utiliza como ejemplo para demostrar cómo el ensayo HAT puede identificar nuevos inhibidores de p300. Consulte Protocolo suplementario ( Esquema1) para obtener un esquema del paso 1.2.1.
    1. Preparar la siguiente reacción enzimática en un tubo de PCR de 0,2 ml: 2 ml de tampón de ensayo 5x, 1 l de p300 purificado (0,19 g/l), 1 l de ácido anacardico (HATi) o control DMSO diluido en tampón de ensayo 1x y 2 ml de ddH autoclavedo2O. Preincigula esta mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 3 l de acetil-coa de 100 m y 1 l de H3.1 purificado (0,2 g/L) a la reacción.
    2. Incubar la mezcla de reacción completa a 30oC durante 1 h en un ciclor térmico de PCR.
    3. Agregue 2-mercaptoetanol en una proporción 1:10 al búfer de muestra 6x SDS.
    4. Retire las muestras del ciclor térmico pcR y añada 2 l de SDS 6x (con 2-mercaptoetanol añadido) a la mezcla de reacción.
      ADVERTENCIA: 2-mercaptoetanol es tóxico y debe utilizarse dentro de una campana de humo químico. Consulte la ficha de datos de seguridad para un manejo adecuado.
    5. Caliente las muestras a 95 oC durante 5 minutos en un bloque de calor y enfríe sobre hielo. Almacene las muestras a -20 o -80 oC o realice electroforesis de gel e inmunoblotting como se detalla a continuación.
  3. Electroforesis de gel e inmunoblotting
    NOTA: Si no está familiarizado con la electroforesis de gel y la inmunoblotting, consulte este procedimiento estándar27 para obtener más detalles sobre cómo realizar los pasos 1.3.1-1.3.17. Puede encontrar información adicional aquí28,29,30,31,32,33.
    1. Pipetear 10 l de muestras (desde el paso 1.2.5.) hasta los pomos de un gel de poliacrilamida de 4-20% de gradiente. Pipetear 5 l de la escalera de proteínas en uno de los pozos como referencia de peso molecular. Ejecute el gel a 120 V durante 90 minutos con un depósito de gel.
    2. Transfiera el gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 70 min utilizando un tanque de transferencia.
    3. Retire la membrana del aparato de transferencia y colóquela en un recipiente de plástico. Bloquee la membrana añadiendo 1x TBST (que contiene 5% de leche) al recipiente y agite suavemente durante 1 h a temperatura ambiente.
    4. Quite el 1x TBST del paso 1.3.3. Incubar la membrana durante la noche con anticuerpos primarios de acetil específicos del sitio seleccionados (p. ej., anticuerpos primarios H3K18ac o H3K27ac a una dilución de 1:5.000 en 1x TBST que contiene 5% de leche) a 4 oC con agitación suave.
    5. Retire la solución primaria de anticuerpos. Lavar la membrana 2x con 1x TBST (sin leche) a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos cada lavado.
    6. Diluir el anticuerpo secundario a 1:20.000 en 1x TBST (que contiene 5% de leche) e incubar la membrana durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
    7. Retire la solución de anticuerpos secundaria. Lavar la membrana 2x con 1x TBST (sin leche) a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos cada lavado.
    8. Escurra el 1x TBST de la membrana. Mezclar la solución de peróxido de sustrato HRP y la solución de luminol de sustrato HRP en una relación 1:1 (1 ml de cada uno) y pipeta 2 ml de la solución combinada a la superficie de la membrana.
    9. Incubar la solución con la membrana durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    10. Escurra el exceso de sustrato quimiominiscente de la membrana sobre una toalla de papel y coloque la membrana en una envoltura de plástico dentro de un soporte de casete de rayos X.
    11. Muévase a una sala oscura dedicada al procesamiento de películas de rayos X. Exponga la membrana a una película de rayos X colocando la película encima de la membrana y cerrando el cassette durante 30 s.
      NOTA: El tiempo de contacto entre la película y la membrana debe determinarse experimentalmente. Las señales fuertes necesitarán exposiciones cortas (segundos) y las señales más débiles pueden necesitar exposiciones más largas.
    12. Retire la película de rayos X del cassette y procese la película ejecutándola a través de un procesador de película de rayos X. Consulte los manuales del fabricante para obtener instrucciones específicas sobre cómo procesar la película de rayos X.
    13. Retire la membrana de la envoltura de plástico y lávela con ddH2O durante 5 minutos a temperatura ambiente con un suave temblor.
    14. Incubar la membrana con 0,2 M NaOH durante 5 min a temperatura ambiente con agitación suave.
    15. Lavar la membrana con ddH2O durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
    16. Bloquee la membrana añadiendo 1x TBST (que contiene 5% de leche) al recipiente y agite suavemente durante 1 h a temperatura ambiente.
    17. Añadir la siguiente dilución primaria de anticuerpos (p. ej., sonda para H3K27ac si el primer anticuerpo utilizado fue H3K18ac) y agitar durante la noche a 4 oC. Repita los pasos 1.3.4-1.3.17 hasta que se completen todas las sondas de anticuerpos.

2. Ensayo ChHAI

  1. Tratamientos farmacológicos in vitro y análisis de histonas acetiladas
    NOTA: A-485 es un potente y bien caracterizado p300 HATi2,4 . Este inhibidor se utilizará en los ensayos restantes debido a su eficacia y especificidad en el cultivo celular. MS-275 (Entinostat)24 es un HDACi que aumenta notablemente los niveles de acetilación de histona y se utiliza para facilitar la detección de sondas de acetilación con inmunoblotting estándar. Ver Protocolo Suplementario (Esquema 2) para un esquema de las diluciones de drogas utilizadas en el paso 2.1.
    1. Siembra 100.000 células MCF-7 en una placa de 12 pozos y permite que las células crezcan a 80-90% de confluencia en 1 ml del medio de cultivo celular. Marque los pozos para el siguiente diseño experimental: pozo 1: control DMSO (punto de referencia); pozo 2: A-485 (3 M); pozo 3: A-485 (10 m); pozo 4: MS-275 (3 m); bien 5: MS-275 (3 m) + A-485 (3 m); pozo 6: MS-275 (3 m) + A-485 (10 m).
      NOTA: Para el cultivo de células MCF-7, utilice medios DMEM completos y permita que las células crezcan a 37 oC con 5% de CO2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta completa de DMEM.
    2. A las 24 horas después de la siembra, pipeta 4 mL de soporte DMEM completo a un tubo cónico estéril de 15 ml. Pipetear 2 l de MS-275 (6 mM en DMSO) a los 4 ml de medio para una concentración final de 3 mM MS-275.
    3. Pipetear 2 l de DMSO a 4 ml de medio en un tubo cónico estéril separado de 15 ml.
      ADVERTENCIA: Por favor, compruebe la hoja de datos de seguridad para el manejo adecuado de DMSO. Algunos tipos de guantes no están clasificados para el manejo de DMSO.
    4. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 4-6 y la pipeta 1 mL de 3 mS-275 en medio (paso 2.1.2) a cada pocótula. Deseche el MS-275 diluido no utilizado.
    5. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 1-3 y la pipeta 1 mL de DMSO diluido (paso 2.1.3) a cada pozo. Deseche el DMSO diluido no utilizado.
    6. Devolver las células a la incubadora e incubar durante 4 horas para permitir la acumulación de histonas acetiladas en las células expuestas a MS-275 (pozos 4-6).
      NOTA: MS-275 es un HDACi y causará hiperacetilidad histona24. Esta pre-incubación de 4 h es necesaria para permitir que la MS-275 induzca hiperacetillación antes de la adición de A-485, que reduce la acetilción de histona2,4.
    7. Después de 4 h de incubación con MS-275, preparar las siguientes diluciones en tubos estériles separados de 1,5 ml por pipeteo: 1,0 ml de DMSO a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de DMSO y 0,5 l A-485 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de DMSO y 0,5 l de A-485 (20 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de DMSO y 0,5 l de MS-275 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de A-485 (6 mM) y 0,5 l de MS-275 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de A-485 (20 mM) y 0,5 l de MS-275 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM.
    8. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 1-6 y pipeta 1 mL de dilución 1 a pozo 1, dilución 2 a pozo 2, dilución 3 a pozo 3, dilución 4 a pozo 4, dilución 5 a pozo 5, y dilución 6 a pozo 6.
      NOTA: Una regla general es equilibrar el contenido de DMSO (solvente) entre grupos experimentales y no exceder el 0,1% de contenido de DMSO en el cultivo celular para evitar la toxicidad celular y los cambios en la proliferación.
    9. Devuelva las células a la incubadora y al cultivo durante 20 h.
    10. Después de 20 h, aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 1-6.
    11. Lavar las células pipeteando 1 ml de PBS a pozos 1-6. Aspirar el PBS.
    12. Agregue 100 l de 1x tampón de lisis pasiva (ver Tabla 1) a los pozos 1-6. Almacene la placa de cultivo celular (con muestras en el búfer de lisis pasiva) a 80 oC durante la noche para congelar el deshielo y la lisis de las células.
      ADVERTENCIA: Compruebe la hoja de datos de seguridad para todos los productos químicos antes de hacer tampones. La CDTA puede causar daños oculares graves e irritación.
    13. Descongelar muestras a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 min. Transfiera las muestras a tubos separados de 1,5 ml y colóquelos inmediatamente sobre hielo.
    14. Mida la concentración proteica de cada muestra. La concentración de proteínas se puede determinar utilizando varios protocolos bien establecidos34.
    15. Equilibrar la concentración de proteínas entre las muestras 1-6 (en un volumen igual) utilizando 1x tampón de lisis pasiva para diluir, según sea necesario.
    16. Agregue 2-mercaptoetanol en una proporción de 1:10 a 6x búfer de muestra SDS.
    17. Agregue 6x tampón de muestra SDS con 2-mercaptoetanol a las muestras 1-6 a una concentración final de 1x búfer de muestra SDS.
    18. Caliente las muestras a 95 oC durante 5 minutos en un bloque de calor y enfríe sobre hielo. Las muestras se pueden almacenar a -20 oC o -80 oC hasta el paso 2.1.19.
    19. Pipetear un volumen que contenga 30 g de proteína para muestras de 1-6 a los pocós en un gel de poliacrilamida de 4-20% de gradiente. Realizar el procedimiento de inmunoblotting de acuerdo con el protocolo descrito en el Protocolo 1.

3. ChIP-qPCR

NOTA: El protocolo siguiente se describe para los inhibidores de p300 como ejemplo.

  1. Preparación de búferes
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para las recetas de búfer. Los pasos generales del protocolo ChIP (por ejemplo, recetas de tampón, tiempos de lavado y tiempos de centrifugación) a continuación se modifican y adaptan a partir de las recomendaciones del fabricante de un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)y de la literatura35,36.
    1. Prepare el tampón de dilución ChIP, el tampón de hinchazón de los núcleos, el tampón de lavado bajo en sal, el tampón de lavado con sal alta, el tampón de lavado LiCl y el tampón TE. Conservar a 4oC.
    2. Prepare el búfer de lisis SDS, el tampón de glicina 10x y el búfer de elución ChIP. Conservar a temperatura ambiente.
      ADVERTENCIA: Compruebe todas las fichas de datos de seguridad para todos los productos químicos antes de hacer tampones para garantizar un manejo adecuado.
  2. Tratamiento farmacológico
    NOTA: Véase Protocolo Suplementario (Esquema 3) para un esquema de las diluciones de medicamentos utilizadas en el paso 3.2.
    1. Seed MCF-7 células en dos platos de cultivo de 15 cm y crecen células a 90% de confluencia en 12 ml del medio DMEM completo. Marque los platos para el siguiente diseño experimental: Plato 1: control DMSO (punto de referencia); Plato 2: A-485 (3 m).
      NOTA: Para el cultivo de células MCF-7, utilice medios DMEM completos y crezca a 37 oC con un 5% de CO2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta completa de DMEM.
    2. En un tubo cónico estéril de 15 ml, pipeta de 12 ml de soporte DMEM y pipeta de 6 l de DMSO. Mezcla bien.
    3. En un tubo cónico estéril separado de 15 ml, pipeta 12 mL de soporte DMEM y pipeta 6 l de A-485 (6 mM en DMSO) para obtener una concentración final de 3 M A-485. Mezcla bien.
    4. Aspirar los medios de los platos 1 y 2.
    5. Agregue los 12 ml de DMSO diluido en DMEM (paso 3.2.2.) al plato 1.
    6. Agregue los 12 ml de 3 m A-485 en DMEM (paso 3.2.3.) al plato 2.
    7. Devolver los platos de cultivo celular a la incubadora e incubar durante 24 h.
  3. Fijación celular
    1. Pipetear 330 l (27,5 l por ml) de 37% de formaldehído a los medios completos y agitar suavemente la placa para mezclar.
      ADVERTENCIA: El formaldehído es tóxico. Consulte la ficha de datos de seguridad para conocer los procedimientos de manipulación adecuados.
    2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Pipeta 2 mL de 10x glicina a la placa y remolino para mezclar.
    4. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Después de la incubación, coloque los platos sobre hielo y descongele un cóctel alícuota de cóctel inhibidor de la proteasa.
    6. Prepare las siguientes soluciones para las muestras DMSO y A-485 utilizando los búferes preparados en el paso 3.1.
      1. 2 ml de PBS con una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa
      2. 1 ml de tampón de hinchazón de núcleos con una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa
      3. 0,5 ml de tampón de lelisis SDS con una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa
    7. Aspirar los medios de los platos de cultivo celular y lavar las células dos veces con 15 ml de PBS frío.
    8. Pipeta 2 mL de PBS con el cóctel inhibidor de la proteasa (paso 3.3.6.1) a los platos de cultivo celular. Levante las células en la solución con un rascador de células.
    9. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Recoja las células restantes con PBS adicional si es necesario.
    10. Tubos de giro a 800 x g a 4 oC durante 5 minutos para peletizar las células.
    11. Aspirar el sobrenadante y la pipeta 1 ml de tampón de hinchazón de núcleos con el cóctel inhibidor de la proteasa (paso 3.3.6.2) al pellet. Resuspender el pellet e incubar sobre hielo durante 10 min.
    12. Centrifugar los tubos a 2.700 x g a 4 oC durante 5 min hasta los núcleos de pellets.
    13. Aspirar el sobrenadante y la pipeta 0,5 ml de tampón de lelisis SDS con el cóctel inhibidor de la proteasa (paso 3.3.6.3) al pellet. Resuspender el pellet e incubar sobre hielo durante 10 min.
    14. Conservar las muestras de cromatina a -80 oC hasta el paso 3.4.1 o proceder inmediatamente al paso 3.4.
  4. Sonicación de ADN
    1. Transfiera 130 l de cromatina de la muestra DMSO (paso 3.3.14) a dos tubos de sonicación de ADN utilizando una pipeta (130 ml cada uno).
    2. Transfiera 130 l de cromatina de la muestra A-485 (paso 3.3.14) a dos tubos de sonicación de ADN utilizando una pipeta (130 ml cada uno).
    3. Sonicar el ADN a aproximadamente 150-200 fragmentos de par base utilizando los siguientes ajustes de sonicador: Potencia de incidente pico (W) de 175, Factor de trabajo de 10%, 200 ciclos por ráfaga y 430 s tiempo de tratamiento.
      NOTA: Es posible que los ajustes de sonicación difieran entre los modelos y los ajustes para lograr el tamaño de fragmento adecuado para diferentes líneas de celda.
    4. Mantenga las muestras sobre hielo después de la sonicación.
    5. Transfiera la cromatina sonicada a un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta y una centrífuga a 10.000 x g a 4 oC durante 10 minutos hasta los desechos de pellets.
    6. Pipetear el sobrenadante (contiene cromatina sonicada) a un tubo nuevo y desechar los residuos. La cromatina sónica se puede almacenar a -80 oC.
  5. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
    NOTA: Consulte Protocolo suplementario (Esquema 3) para obtener un esquema de los grupos ip en el paso 3.5.
    1. Mida el contenido proteico de la cromatina sonicada para las muestras DMSO y A-485 del paso 3.4.6. El contenido de proteínas se puede medir utilizando protocolos bien establecidos34.
      NOTA: Para simplificar, este protocolo asumirá que el contenido de proteínas es igual y se utilizarán 100 l de cromatina sonicada. De lo contrario, el contenido proteico tendrá que ser equilibrado entre todas las muestras en un volumen igual.
    2. Pipetear 100 l de cromatina sonicada DMSO a dos tubos de 1,5 ml (100 l cada uno). Pipetear 400 l de tampón de dilución ChIP (que contiene una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa) a cada tubo para llevar el volumen total hasta 500 l. Retire 5 l de la solución de uno de los tubos y guárdelo a -20 oC como entrada DMSO.
    3. Pipetear 100 l de cromatina sonicada A-485 a dos tubos de 1,5 ml (100 ml cada uno). Pipetear 400 l de tampón de dilución ChIP (que contiene una dilución de 1:1000 del cóctel inhibidor de la proteasa) a cada tubo para llevar el volumen total hasta 500 l. Retire 5 l de la solución de uno de los tubos y guárdelo a -20 oC como A-485 De entrada.
    4. Con una pipeta, añada el anticuerpo de inmunoprecipitación (IP) (por ejemplo, control IgG no específico o anticuerpo específico H3K27ac) a los tubos correspondientes para las muestras DMSO y A-485: IP #1 cromatina DMSO con anticuerpos IgG (5-10 g); IP #2 cromatina DMSO con anticuerpo H3K27ac (5-10 g); IP #3 A-485 cromatina con anticuerpos IgG (5-10 g); LA #4 A-485 con anticuerpo H3K27ac (5-10 g).
    5. Añadir 20 l de proteína A cuentas magnéticas a cada tubo. Asegúrese de que las cuentas estén bien resuspendidas.
    6. Gire las muestras durante la noche a 4 oC.
    7. Pele la proteína Un perla magnética usando un separador magnético y retire el sobrenadante. No moleste las cuentas.
    8. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml del tampón de lavado con bajo contenido de sal y girar durante 5 min a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo, pelete las perlas usando un separador magnético, y retire el sobrenadante.
    9. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml de la tampón de lavado de alta sal y girar durante 5 minutos a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo, pelete las perlas usando un separador magnético, y retire el sobrenadante.
    10. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml del tampón de lavado LiCl y girar durante 5 min a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo, pelete las perlas usando un separador magnético, y retire el sobrenadante.
    11. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml de tampón TE y girar durante 5 min a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo. Mantenga las perlas en el búfer TE hasta el paso 3.5.14.
    12. Retire las muestras de entrada (de los pasos 3.5.2 y 3.5.3) del congelador y manténgalos en hielo.
    13. Descongelar una alícuota de Proteinase K.
    14. Pele el cordón usando un separador magnético y retire el búfer TE de las perlas (del paso 3.5.11).
    15. Añadir 100 l de tampón de elución ChIP + 1 l de Proteinasa K a cada muestra, incluidas las muestras de entrada. Incubar muestras con agitación a 62oC durante 2 h utilizando un termociclo.
    16. Después de 2 h, calienta las muestras a 95oC durante 10 min usando un termociclo.
    17. Enfríe las muestras a temperatura ambiente.
    18. Perlas magnéticas de pellet utilizando un separador magnético y sobrenadante de transferencia (contiene el ADN de interés) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    19. Purifique el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR estándar.
    20. El ADN purificado se puede almacenar a -20 oC y se puede utilizar como plantillas en protocolos qPCR estándar. Siga los protocolos del fabricante para ejecutar qPCR.
  6. Análisis de datos ChIP-qPCR
    NOTA: Dos métodos comunes para analizar los resultados de ChIP-qPCR son el enriquecimiento por pliegue sobre el anticuerpo IgG y el método de entrada del 1%. Una fuente comercial proporciona una excelente plantilla para ambos métodos de análisis para calcular rápidamente el enriquecimiento del pliegue para cada anticuerpo IP/objetivo de interés37.
    1. Para calcular el enriquecimiento de pliegues y el % de entrada, copie y pegue los valores de Ct a partir de los datos qPCR obtenidos para cada anticuerpo (IgG no específico, el anticuerpo IP H3K27ac y la entrada del 1%) en la región correspondiente de la plantilla de análisis y la entrada de multiplicado por pliegue y porcentaje de rendimiento se rellenará automáticamente.

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Representative Results

El ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) se puede utilizar para sondear compuestos que inhiben la actividad de p300 HAT hacia un sustrato de histona. La Figura 1A proporciona un esquema experimental para el ensayo HAT. El ácido anacardico, conocido HATi3,38, se utilizó en este ensayo en un rango de concentración de 12,5-100 M. A 100 m, el ácido anacardico reduce las regulaciones p300 y cataliza la acetilción histona en Histone 3, Lisinas 9 y 18 en comparación con el tratamiento de control DMSO(Figura 1B,carril 5 frente al carril 1). Un rango de concentración fue utilizado en este ensayo porque las dosis más bajas de fármacos pueden no inhibir en gran medida la actividad de p300 HAT (Figura 1B, carriles 2-4 versus carril 1). En el carril 6, no se añadió acetil-coA a la reacción y sirve como un control negativo para la catálisis p300 y para los niveles basales de acetilación de histona en H3.1 recombinante (Figura 1B). los niveles de proteína p300 y H3.1 se utilizaron como controles de carga(Figura 1B). Estos resultados de inmunoblot se cuantificaron utilizando ImageJ39 (Figura 1C). Los cambios de plegado se calcularon comparando la intensidad de la banda de cada muestra con la intensidad de banda del control DMSO para cada sonda de acetilación. La cuantificación del ácido anacardico a 100 oM muestra una potente reducción en H3K18ac y H3K9ac en comparación con el control DMSO, confirmando los resultados visuales en la Figura 1B.

En el ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI), HDACi se utiliza como herramienta para hiperacetilar histonas en cromatina antes de la incubación con un HATi24,como el inhibidor P300 A-4852,4. El propósito de este ensayo es determinar la eficacia de HATi para atenuar la hiperacetilación histona inducida por HDACi. La Figura 2A proporciona un esquema experimental para el ensayo ChHAI. En este ensayo, el tratamiento de células MCF-7 con HDACi MS-275 acetilada fuertemente regulada en Histone 3, en varios residuos de lisina(Figura 2B,carril 4 frente al carril 1). Los niveles basales de H3K18ac y H3K27ac fueron bajos, mostrando los beneficios de agregar un HDACi en el ensayo ChHAI(Figura 2B, carriles 1-3). La adición de A-485 con MS-275 atenúa el aumento de la acetilidad histona en H3K18 y H3K27, pero no H3K9(Figura 2B, carriles 4-6). Es importante destacar que H3K9ac no está regulado por p300 en el cultivo celular2,mostrando la especificidad de A-485 en este experimento. Estos resultados de inmunoblotos se cuantificaron en la Figura 2C. Los cambios de plegado se calcularon comparando la intensidad de la banda de cada muestra con la intensidad de banda de MS-275 solo (Carril 4) para cada sonda de acetilación. Los carriles 1-3 no se cuantificaron porque no se detectaron los niveles basales H3K18ac y H3K27ac.

Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) es un experimento de cultivo celular que investiga las interacciones ADN-proteína en regiones específicas del genoma. Se puede utilizar para investigar los efectos de HATi en elementos reguladores de genes que controlan la expresión de oncogén25. La Figura 3A proporciona un esquema experimental para el protocolo ChIP-qPCR. Las células MCF-7 tratadas con 3 a-485 M durante 24 horas fueron sometidas a ChIP-qPCR mediante inmunoprecipitación de complejos histona-ADN enriquecidos en H3K27ac (Figura 3). El ADN purificado fue analizado para la secuencia promotora de Cyclin D1. Las imprimaciones ChIP-qPCR están diseñadas contra una secuencia de ADN específica en el genoma y se utilizan para detectar la cantidad relativa de ADN precipitado. La cantidad de ADN precipitado refleja la abundancia de la proteína de interés en la región genómica bajo investigación. De hecho, en la muestra DMSO, el ADN precipitado por el anticuerpo de control IgG produce un valor Ct más alto que el anticuerpo H3K27ac en la reacción qPCR para el promotor Cyclin D1 (Figura 3B). Esto indica que el control IgG no específico precipitó menos complejos de proteínas de ADN que el anticuerpo específico H3K27ac en el promotor Cyclin D1. Esto se traduce en un enriquecimiento de 632,73 veces de H3K27ac sobre el control IgG no específico (Figura 3B).

Este enriquecimiento de pliegue proporciona evidencia de que el anticuerpo específico H3K27ac con éxito inmunoprecipitado acetiladas acetiladas y que H3K27ac se enriquece en el promotor de Cyclin D1. Después de validar la calidad del anticuerpo H3K27ac, se puede hacer una comparación entre los grupos tratados CON DMSO y A-485. Como se muestra en la Figura 3C,A-485 reduce el enriquecimiento de H3K27ac en el promotor Cyclin D1 en comparación con el control DMSO utilizando el método %Input (resultado representativo de n-2). Es importante destacar que se sabe que A-485 reduce significativamente H3K27ac en el cultivo celular2,,4.

ChIP-qPCR valores de entrada sin procesar pueden ser muy variables entre réplicas biológicas independientes, a pesar de que la tendencia experimental es reproducible. Por lo tanto, puede ser útil presentar los datos como un porcentaje normalizado del control DMSO para mostrar la relación reproducible entre el control y el tratamiento farmacológico10. Por ejemplo, en la Figura 3D, A-485 reduce significativamente la ocupación de H3K27ac en el promotor Cyclin D1 (n-2). El análisis estadístico se basó en la prueba t del estudiante (*P < 0.05).

Figure 1
Figura 1: El ácido anacardico inhibe la actividad enzimática p300 en un ensayo de HAT. (A) Un diagrama esquemático del ensayo HAT, que representa la reacción enzimática. (B) El ácido anacardico inhibió potentemente la actividad enzimática de p300 y reguló la aceilación de histona en H3K18 y H3K9 a 100 m (carril 5) frente al tratamiento de control DMSO (carril 1). El carril 6 carece de acetil-coA en la reacción y sirvió como un control negativo para la acetilidad histona. (C) Se cuantificaron los resultados de inmunoblot en (B). Los cambios de plegado se calcularon comparando la intensidad de la banda de cada muestra con la intensidad de banda del control DMSO para cada sonda de acetilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El inhibidor de p300 A-485 atenúa potentemente la hiperacetilción de la histona en el ensayo ChHAI. (A) Un diagrama esquemático del ensayo ChHAI. (B) En las células MCF-7, el inhibidor de la HDAC MS-275 puede sobrerregular potentemente la acetilción histona a H3K18, K27 y K9 (carril 4) frente al control DMSO (carril 1). La adición de A-485, un inhibidor conocido de p300 HAT, con MS-275 atenió el aumento de la acetilación histona en H3K18 y K27, pero no H3K9 (carriles 5-6 contra el carril 4). (C) Se cuantificaron los resultados de inmunoblot en (B). Los cambios de plegado se calcularon comparando la intensidad de la banda de cada muestra con la intensidad de banda de MS-275 solo (Carril 4) para cada sonda de acetilación. Los carriles 1-3 no se cuantificaron porque no se detectaron los niveles basales H3K18ac y H3K27ac. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El inhibidor de p300 A-485 disminuye los niveles de H3K27ac en el promotor Cyclin D1 medido por ChIP-qPCR. (A) Un diagrama esquemático del protocolo ChIP-qPCR. (B) Valores representativos de qPCR Ct para el promotor Cyclin D1 para las inmunoprecipitaciones IgG y H3K27ac. El control IgG tenía un valor ct más alto, lo que indica que el anticuerpo H3K27ac se enriqueció con éxito para H3K27ac sobre el anticuerpo IgG no específico. (C) Tratamiento A-485 (3 m) para 24 h de H3K27ac regulado a la baja en el promotor Cyclin D1 en comparación con el tratamiento de control DMSO en células MCF-7 (resultado representativo de n-2). (D) El %Input de dos experimentos ChIP independientes se normalizó al control DMSO como un porcentaje del control DMSO. El tratamiento con A-485 en células MCF-7 reduce significativamente la ocupación de H3K27ac en el promotor Cyclin D1. El análisis estadístico se basó en la prueba t del estudiante (*P < 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Búfer Receta
10X Tampón de glicina 18,74 g de glicina con PBS hasta que se disuelva y añadir PBS a 200 ml.
10X Búfer de ejecución 250 mM Tris, 1.9 M glicina, 1% SDS
Disolver 30,0 g de base Tris, 144,0 g de glicina y 10,0 g de SDS en 1000 ml de H2O. El pH del tampón debe ser 8.3 y no se requiere ningún ajuste de pH. Almacene el búfer de funcionamiento a temperatura ambiente y diluya a 1 veces antes de usarlo.
10X TBST 2.42 g de base Tris, 8g de NaCl, 2 ml de 50% Tween 20, añadir ddH2O a 1 litro
1X TBST con 5% de leche 5 g de leche en polvo por aproximadamente 100 ml de 1X TBST
5X Búfer de ensayo: 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Tritón X-100
5X Tampón de lisis pasiva hacer un stock acuoso que contenga 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM TDT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 y 50% (vol/vol) glicerol en ddH2O.
6X Sulfato de Dodecyl de sodio (SDS) 0,375 M Tris pH 6,8, 6 ml de glicerol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-ditiothreitol (TDT), 6 mg de bromofenol azul, añadir agua a 10 ml.
Búfer de dilución ChIP 0.01% SDS, 1.1% Tritón X-100, 1.2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl
ChIP Elution Buffer 1% SDS (p/v) y 0,1 M NaHCO3 en ddH2O autoclavado
DMEM completo para células MCF-7: Medio águila modificada de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera bovina (BCS), penicilina (10 unidades/ml) y estreptomicina (10 mg/ml)
Tampón de lavado de sal alta 0.1% SDS, 1% Tritón X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl.
Tampón de lavado LiCl 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% desoxicolato de sodio, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
Tampón de lavado bajo en sal 0.1% SDS, 1% Tritón X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl.
Búfer de hinchazón de núcleos 5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40
Búfer de lesis SDS 1% SDS, EDTA de 10 mM, 50 mM Tris-HCl pH 8.0
Tampón TE 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA.
Búfer de transferencia 25 mM Tris, 190 mM de glicina, 20% de metanol y comprobar el pH y ajustar a pH 8.3 si es necesario.

Tabla 1: Recetas de los buffers y la solución utilizada.

Archivos complementarios: Esquemas experimentales suplementarios para los protocolos 1-3. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Acetiltransferasas de lisina (KAT) acetillasoar varios residuos de lisina en las colas de histona y factores de transcripción para regular la transcripción genética2,3. El trabajo en las últimas dos décadas ha revelado que los KAT, como CBP/p300, PCAF y GCN5, interactúan con factores de transcripción oncogénicos y ayudan a impulsar el crecimiento tumoral en varios tipos de tumores sólidos4,,5,,9,,15,,16,,17,,18. Debido a su papel emergente en la promoción del crecimiento tumoral, los KAT están siendo investigados como nuevos objetivos en el tratamiento del cáncer. Los nuevos inhibidores de KAT (KATi) deben someterse a pruebas cuidadosas y rigurosas en busca de potencia, selectividad y seguridad antes de pasar a utilizar en la clínica. La evidencia reciente ha demostrado que los compuestos KATi descritos anteriormente exhiben efectos objetivo y se caracterizaron mal antes de ser ampliamente utilizados en la literatura científica como sondas químicas21. Por lo tanto, se necesitan métodos rigurosos para la caracterización de KATi. Aquí se describen tres protocolos que se pueden utilizar juntos para caracterizar y validar nuevos inhibidores dirigidos a la función de la histona acetiltransferasa (HAT) de los TCA: un ensayo HAT in vitro, el ensayo ChHAI y ChIP-qPCR. Estos protocolos utilizan CBP/p300 y sus inhibidores como ejemplos, pero estos métodos se pueden adaptar fácilmente para su aplicación futura en la investigación de otros TCC.

El ensayo HAT es simple y una forma rentable de examinar compuestos para determinar la potencia en la inhibición de la función HAT en un tubo de ensayo. Los HAT purificados (ya sea recombinantes4,,10 o inmunoprecipitados40)se pueden probar en este ensayo, pero CBP/p300 recombinante se utiliza como ejemplo en este protocolo. CBP/p300 tiene un dominio HAT enzimático que transfiere un grupo de acetil de acetil-coA a un residuo de lisina en un sustrato objetivo3. Los objetivos histoneos CBP/p300 más caracterizados son Histone 3 Lisine 18 y 27 (H3K18 y H3K27, respectivamente)2,3,10,11. En el ensayo HAT, el dominio p300 HAT purificado se incuba con Acetyl-CoA e Histone 3.1 como sustrato. Durante el período de incubación, p300 catalizará la acetilción en varios residuos H3.1 incluyendo H3K18 y H3K27. La abundancia relativa de acetilación en estos residuos se puede medir a través de inmunoblotting. Esta reacción del tubo de ensayo se puede utilizar para detectar nuevos compuestos que se unen a p300 e inhiben su actividad HAT (HATi). Por ejemplo, el ácido anacardico, un CONOCIDO HATi38,regula potentemente la acetilción histona tanto en H3K18 como en H3K9 en comparación con el control DMSO(Figura 1B,carril 5 frente al carril 1). Es de vital importancia añadir acetil-CoA a las reacciones experimentales(Figura 1B, Carriles 1-5) o p300 catálisis de la acetilción histona no ocurrirá(Figura 1B, Carril 6). La ausencia de acetil-CoA también se puede utilizar como control negativo para la catálisis p300 y para los niveles basales de acetilción de histona en H3.1 recombinante.

Al realizar el ensayo HAT, es importante asegurarse de que cada reacción reciba la misma cantidad de p300, H3.1 y Acetil-CoA. Los niveles H3.1 y p300 en el inmunoblot sirven como controles de carga para el gel. Para este ensayo, se pueden utilizar anticuerpos de acetil de histona específicos del sitio o un anticuerpo pan-acetil para inmunoblotting. Al optimizar para mejorar la calidad del inmunoblot es crucial utilizar anticuerpos validados para inmunoblotting e inicialmente seguir las recomendaciones del fabricante para la dilución de anticuerpos. Las diluciones de anticuerpos utilizadas en la sección Protocolo son de referencia y las diluciones se pueden cambiar en función de los resultados de los experimentos iniciales (por ejemplo, si la señal es demasiado fuerte, el anticuerpo se puede diluir aún más). Debido a su simplicidad, el ensayo HAT es un excelente experimento inicial para la detección de nuevos inhibidores. Sin embargo, el ensayo HAT tiene desventajas. Una preocupación importante con el ensayo HAT es que los compuestos que son eficaces en un tubo de ensayo pueden resultar ineficaces en un sistema vivo. Este es un problema porque la eficacia compuesta en el cultivo celular puede ser alterada por problemas de permeabilidad celular, metabolismo celular, y estabilidad compuesta. Además, los KAT, específicamente CBP/p300, tienen muchas interacciones proteína-proteína que regulan su actividad DE KAT en el cultivo celular3,,41,,42. Por lo tanto, es esencial caracterizar aún más los inhibidores identificados en el ensayo HAT en los experimentos de cultivo celular20,,23.

El ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI) es el segundo protocolo en curso y es útil para validar los efectos de nuevos inhibidores en el cultivo celular. Este ensayo utiliza inhibidores de la HDAC (HDACi)24 para inducir la hiperacetilción histona en las células porque la acetilción basal puede ser demasiado baja para detectar en un inmunoblot. Las líneas celulares de elección están pre-incubadas con un HDACi para permitir la acumulación de cromatina acetilada antes de la adición de un HATi. Después de la co-incubación de la HDACi y HATi, las células se lejen y se someten a procedimientos de inmunoblotting estándar para sitios específicos de acetilación de histona. El propósito de este ensayo es determinar la eficacia de la nueva HATi para atenuar la hiperacetilación histona inducida por HDACi. Las células expuestas a HDACi deben tener niveles significativamente más altos de acetilción de histona que las células expuestas al disolvente DMSO(Figura 2B,carril 4 frente al carril 1). Se espera que la adición del HATi junto con el HDACi reduzca la señal de inmunoblot en comparación con el tratamiento CON HDACi solo(Figura 2B, carriles 5-6 frente al carril 4). Los niveles basales de la acetilización histona(Figura 2B, Carriles 1-3) son difíciles de detectar y destaca la importancia de agregar un HDACi en este protocolo. MS-275 (Entinostat) se utiliza como ejemplo, pero otros HDACi se pueden utilizar24,43. MS-275 tiene concentraciones inhibitorias notificadas variables frente a HDAC clase I y generalmente inhibe HDAC1 y HDAC3 con concentraciones nanomolares a micromolares bajas, respectivamente43,44. Una amplia gama de concentraciones de MS-275 se utiliza en la literatura45,46,47, pero un tratamiento de 3 M proporciona un aumento robusto y reproducible en la acetilción de histona en células MCF-7. Por lo tanto, puede ser beneficioso realizar una pantalla inicial con una amplia gama de concentraciones de HDACi y HATi para determinar la concentración óptima para el ensayo ChHAI cuando se utiliza una línea celular diferente.

Al igual que el ensayo HAT, es posible que sea necesario optimizar el protocolo de inmunoblot para obtener resultados de calidad mediante el uso de anticuerpos adecuados, diluciones óptimas de anticuerpos y una carga de muestras cuidadosamente controlada. La carga cuidadosamente controlada de la muestra es esencial para el éxito de este protocolo y se puede lograr mediante el equilibrio del contenido proteico de todas las muestras y a través del pipeteo igual volumen de muestras en los pozos del gel de inmunoblot. Un anticuerpo pan-acetil se puede utilizar para sondear en este protocolo. Sin embargo, debe complementarse con anticuerpos de acetil específicos del sitio porque los KAT tienen especificidad para ciertos residuos de lisina histona y HATi no afecta a todos los sitios de acetilación de histona en el cultivo celular1,2,4,5,10,11. Los inhibidores que son potentes para reducir la acetilación de histona en los ensayos HAT y ChHAI son candidatos fuertes para una evaluación posterior. Es importante destacar que los ensayos HAT y ChHAI tienen la limitación de proporcionar únicamente datos sobre los cambios globales en la acetilidad histona. Esta limitación crea la necesidad de caracterizar los efectos de la nueva HATi en regiones específicas del genoma.

La reacción en cadena de la inmunoprecipitación cuantitativa de cromatina (ChIP-qPCR) es el protocolo final en la canalización y evalúa las interacciones ADN-proteínas en regiones específicas del genoma. En este ensayo, las regiones genómicas enriquecidas en H3K27ac se purifican mediante inmunoprecipitación (IP) y se analizan utilizando imprimaciones de ADN en qPCR. Esta técnica proporciona una visión mecanicista de cómo HATi afecta las modificaciones de histona en los promotores y potenciadores de genes. ChIP-qPCR es una técnica robusta y es menos costosa que la secuenciación del genoma completo (por ejemplo, ChIP-seq), pero puede ser difícil de optimizar debido a muchos pasos que afectan el resultado. El paso más difícil de optimizar correctamente es el paso 3.5, la inmunoprecipitación. Este paso es difícil de optimizar porque si el ADN purificado en el paso 3.5.20 es altamente diluido puede causar malos resultados en la reacción qPCR (por ejemplo, ninguna amplificación de la secuencia génica objetivo y valores muy altos de Ct). El éxito del paso de la P.I. depende de varios factores, como la abundancia del objetivo proteico de interés y la calidad del anticuerpo IP. Es crucial validar la calidad del anticuerpo IP H3K27ac frente al control IgG para verificar el éxito del paso IP. Por ejemplo, en la Figura 3B,el anticuerpo específico H3K27ac muestra un enriquecimiento de 632,73 veces más que el control IgG no específico. Esto indica que el anticuerpo H3K27ac es de alta calidad y que H3K27ac se enriquece en el promotor Cyclin D1. Después de la validación del anticuerpo IP, se puede hacer una comparación entre los grupos tratados CON DMSO y A-485. Como se muestra en la Figura 3C,A-485 reduce el enriquecimiento de H3K27ac en el promotor Cyclin D1 en comparación con el control DMSO utilizando el método %Input (resultado representativo de n-2). Si el anticuerpo IP demuestra ser de baja calidad y no muestra enriquecimiento de pliegue en experimentos iniciales, intente aumentar los números de células en el paso 3.2.1. Un número más alto de células puede ayudar a compensar la mala calidad de los anticuerpos al aumentar el contenido total de proteínas del anate y permitirá añadir más proteínas a la reacción IP.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses o divulgaciones que hacer.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Biomédica James y Esther King (6JK03 y 20K07), y Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 y 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation y UF Health Cancer Center. Además, nos gustaría dar las gracias al Dr. Zachary Osking y a la Dra. Andrea Lin por su apoyo durante el proceso de publicación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

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Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

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