Summary
Presentado es un protocolo para fabricar un dispositivo basado en papel para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas.
Abstract
Las microvesículas y exosomas son pequeñas vesículas membranosas liberadas al ambiente extracelular y circulan por todo el cuerpo. Debido a que contienen varias biomoléculas derivadas de células parentales como ADN, ARNm, miRNA, proteínas y lípidos, su enriquecimiento y aislamiento son pasos críticos para su explotación como biomarcadores potenciales para aplicaciones clínicas. Sin embargo, los métodos de aislamiento convencionales (por ejemplo, ultracentrifugación) causan pérdidas significativas y daños a microvesículas y exosomas. Estos métodos también requieren múltiples pasos repetitivos de ultracentrifugación, carga y desgaste de reactivos. Este artículo describe un método detallado para fabricar un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) diseñado para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas de una manera sencilla. El diseño único del Exo-PAD, que consiste en capas multidobladas similares al acordeón con áreas de muestra convergentes, se integra con la técnica de polarización de concentración de iones, lo que permite un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas. Además, las microvesículas y exosomas enriquecidos se aíslan simplemente desplegando el Exo-PAD.
Introduction
Las microvesículas y los exosomas son vesículas de membrana pequeñas que miden 0,2 a 1 m y 30 a 200 nm, respectivamente. Son secretados en el entorno extracelular por varios tipos de células diferentes1,2,3,4,5. Contienen información de células parentales en forma de subconjuntos de ADN, ARNm, MIRNA, proteínas y lípidos, y circulan por todo el cuerpo a través de diversos fluidos corporales como suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico y saliva6,7,8,9. Por lo tanto, las técnicas para el aislamiento eficiente de microvesículas y exosomas de fluidos biológicos pueden proporcionar amplias oportunidades en los campos del diagnóstico, pronóstico y monitoreo en tiempo real de la enfermedad, así como en el desarrollo de nuevas terapias.
Sin embargo, el método de aislamiento convencional para microvesículas y exosomas basados en la ultracentrifugación consume mucho tiempo y causa una pérdida y contaminación significativas de la muestra. Esto se debe a que implica varios pasos de pipeteo y carga engorrosos y el descarte de varios reactivos con ultracentrifugación repetida5,6,10,11,12. Por otra parte, la alta tensión de cizallamiento inducida por la ultracentrifugación (100.000 x g)puede causar la lysis física de microvesículas y exosomas, produciendo tasas de recuperación deficientes (5-23%)6,,13,,14. Por lo tanto, se debe desarrollar una técnica de aislamiento altamente eficiente y discreta para microvesículas y exosomas para reducir el daño y la pérdida, logrando así mayores tasas de recuperación.
Un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) fue desarrollado para un aislamiento más simple, suave y altamente eficiente de microvesículas y exosomas6. El diseño del Exo-PAD es un papel multiplicizado con áreas de muestra conectadas en serie que disminuyen gradualmente de diámetro. La técnica de polarización de la concentración de iones (ICP), que es un fenómeno nanoelectrocinético que preconcentra biomoléculas cargadas, se integró con este diseño único. El uso del Exo-PAD dio como resultado un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas y su aislamiento simplemente desplegando el dispositivo. Este artículo describe el Exo-PAD en detalle, desde la fabricación y operación general del dispositivo hasta el análisis de su uso, para ilustrar el método y mostrar resultados representativos6.
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Protocol
1. Fabricación de dispositivos
- Defina la región que se va a imprimir en papel utilizando el software de impresora (Tabla de materiales).
NOTA: El diseño tiene 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de 5 mm a 2 mm(Figura 1A). - Imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa (Tabla de materiales) utilizando una impresora de cera comercial ( Tabla demateriales) (Figura 1B).
- Colocar el papel grabado en cera en un horno de laboratorio durante 80 s a 120 oC.
NOTA: Este paso permite que la cera llegue al interior del papel logrando un reflujo térmico de la cera impresa. Con este protocolo de incubación, la resolución del patrón es de 2 mm. Por lo tanto, tenga cuidado de no imprimir patrones de menos de 2 mm. De lo contrario los patrones serán bloqueados por la cera. - Corte el papel impreso en cera con un cortador para fabricar dispositivos individuales (Figura 1C).
- Disminuir 5 s y 2 l de membrana permselectiva (p. ej., Nafion; Tabla de materiales) en las áreas de muestra en las capas más a la izquierda y a la derecha, respectivamente (Figura 1D).
- Coloque las capas recubiertas con la membrana permselectiva en una placa caliente a 70 oC durante 30 minutos para evaporar el disolvente de membrana permselectivo.
- Selle la superficie más externa de la capa recubierta frente a la solución tampón con cinta sensible a la presión, dejando un pequeño agujero.
- Doble el dispositivo individual impreso (es decir, Exo-PAD) de un lado a otro a lo largo de las líneas blancas.
NOTA: Al plegar el dispositivo, todas las áreas de muestra se conectan convergentemente(Figura 1E). Este diseño convergente centra las líneas de campo eléctrico cuando se aplica la tensión para ICP, logrando una preconcentración más intensiva de las microvesículas y exosomas.
2. Enriquecimiento y enfoque espacial de microvesículas y exosomas por polarización de la concentración iónica
- Cargue 15 l de la muestra de microvesícula y exosoma (3 x 1011 partículas/ml en solución salina tamponada de 0,1x fosfato [PBS] con 0,05% de interpolación 20) en las áreas de muestra convergentes por pipeteo y espere unos segundos para asegurar la humectación completa de todas las áreas de muestra (Figura 1F).
- Coloque dos cámaras de acrílico en ambos extremos del Exo-PAD y sujete el Exo-PAD de forma segura con pequeños clips de aglutinante para evitar que se desdoblen(Figura 1G).
- Llene las cámaras con 110 l de 0,1x PBS e inserte dos electrodos Ag/AgCl(Figura 1H).
- Aplicar 30 V a los electrodos durante 20 minutos utilizando un sistema de medición de fuente de corriente(Tabla de materiales).
NOTA: El voltaje aplicado genera el fenómeno ICP y por lo tanto preconcentra las microvesículas y exosomas en las capas 8 y 9 del Exo-PAD.
3. Aislamiento de las microvesículas y exosomas enriquecidos
- Separe el Exo-PAD plegado de las cámaras de acrílico y desdoble el dispositivo para aislar las microvesículas y exosomas enriquecidos de las otras capas (Figura 1I).
- Perforar las áreas de muestra en las capas 8 y 9, donde se enriquecen las microvesículas y los exosomas, para el análisis aguas abajo (Figura 1J).
4. Análisis de microscopía electrónica de barrido
- Fijar las microvesículas y exosomas enriquecidos sumergiendo las áreas perforadas en 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M tampón de cacodilato sódico durante 1 h y en 1% de tetroxido de osmio en 0,1 M de cacodilato sódico durante 1 h.
ADVERTENCIA: El tetróxido de Osmio es un producto químico altamente venenoso y peligroso. Debido a que el tetróxido de osmio puede penetrar en los plásticos, debe almacenarse en vidrio. Cualquier manipulación de tetróxido de osmio debe realizarse en una campana química con guantes de doble nitrilo. - Deshidratar las microvesículas fijas y los exosomas con grados ascendentes de etanol a prueba de 200 (es decir, 50%, 70%, 90% y 100%) durante 30 minutos cada uno.
- Seque químicamente la muestra sumergiéndola en hexametildisilazane en un desecador durante 30 min.
ADVERTENCIA: Hexamethyldisilazane es un producto químico inflamable y sensible a la humedad. Debe almacenarse en un área seca y bien ventilada lejos de fuentes de ignición. - Recubrir las microvesículas completamente secas y los exosomas con oro/paladio (20 nm) a través de imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de pulverización y captura.
5. Análisis de seguimiento de nanopartículas
- Golpee las áreas de muestra en las capas 6, 8 y 10 usando un punzón de biopsia después de 20 minutos de operación del dispositivo.
- Sumerja cada área perforada en solución tampón (0,1x PBS con 0,01% de interpolación 20).
- Vórtice durante 10 min y centrífuga durante 30 s a 6.000 rpm para resuspender las microvesículas y exosomas enriquecidos.
- Retire las áreas perforadas de la solución y mida la concentración de microvesículas y exosomas mediante un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Tabla de materiales).
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Representative Results
El tiempo de operación debe optimizarse para lograr el máximo rendimiento de recuperación de las microvesículas y exosomas enriquecidos. El tiempo insuficiente no permite una migración suficiente de las microvesículas y exosomas, lo que disminuye el enriquecimiento, mientras que el tiempo excesivo deteriora el enfoque espacial y por lo tanto dispersa las microvesículas y exosomas. Así, a través del paso de optimización del tiempo, se puede identificar el factor máximo de preconcentración de microvesículas y exosomas y la ubicación final donde se enriquecen más microvesículas y exosomas. Para encontrar la ubicación final de las microvesículas y los exosomas, se observó la migración de lapso de tiempo de microvesículas y exosomas con etiqueta fluorescente con un microscopio (Figura 2A) y las intensidades de fluorescencia en todas las áreas de la muestra se cuantificaron utilizando el software ImageJ (Figura 2B). Antes del proceso de enriquecimiento(Figura 2A,0 min), se dispersaron microvesículas y exosomas en todas las áreas de la muestra con una disminución gradual de la intensidad debido a la ligera acción de filtrado de la matriz de papel(Figura 2B,0 min). Después de 10 minutos de procesamiento(Figura 2A,10 min), microvesículas y exosomas migraron electroquinéticamente y apareció un enchufe de preconcentración instantánea en la capa 7. El procesamiento posterior logró una mayor preconcentración de microvesículas y exosomas. Cuando el tiempo de proceso llegó a 20 min, las microvesículas y los exosomas se centraron fuertemente en las capas 8 y 9(Figura 2A,20 min) y enriquecidas cinco veces, basadas en las intensidades de fluorescencia(Figura 2B,20 min).
Después de completar el proceso de preconcentración, las microvesículas y exosomas enriquecidos se aislaron desplegando el dispositivo y el área de la muestra en la capa 8 fue perforada para su posterior análisis. Se obtuvieron imágenes SEM para investigar la integridad de las microvesículas y exosomas enriquecidos. Como se muestra en las imágenes SEM (Figura 3A), se observaron significativamente más microvesículas y exosomas no dañados después del proceso de enriquecimiento. Utilizando las imágenes SEM obtenidas, se analizó la distribución del tamaño de las microvesículas y exosomas enriquecidos(Figura 3B),donde se distinguieron los exosomas y microvesículas en función de un diámetro de umbral de 200 nm. En otras palabras, el tamaño de los exosomas osciló entre 95-195 nm con un diámetro medio de 134 nm y el de las microvesículas de 214-377 nm con un diámetro medio de 315 nm.
Posteriormente, la NTA analizó la concentración real de las microvesículas y exosomas enriquecidos en las áreas de muestra en las capas 6, 8 y 10. Antes del enriquecimiento, la concentración fue de 2,24 x 1011 partículas/ml en la capa 8(Figura 3C,capa 8). Después del enriquecimiento, la concentración fue de 1,25 x 1012 partículas/ml en la capa8 (Figura 3C,capa 8), lo que indica que las microvesículas y los exosomas fueron preconcentrados por un factor de 5,58. No se observó una preconcentración notable en las otras capas(Figura 3C,capas 6 y 10). En conjunto, estos resultados demuestran que el dispositivo basado en papel propuesto puede enriquecer las microvesículas y los exosomas en aproximadamente cinco veces.
La eficiencia de aislamiento del dispositivo se evaluó de la siguiente manera: El volumen de la muestra que se puede acomodar con la capa 8 y 9 es de 2,2 oL de un total de 15 ml de volumen de la muestra en 10 capas debido al diseño de estrechamiento del Exo-PAD. Si asumimos un caso ideal en el que todas las microvesículas y exosomas están preconcentrados en la capa 8 y 9 y ninguno se pierde, entonces el factor de preconcentración ideal debe ser de 6,8 euros (15 l/2,2 l a 6,8). Sin embargo, el factor de preconcentración experimental obtenido por NTA (Figura 3c) fue de 5,58 euros, lo que significa que una parte de 1,22 microvesículas y exosomas se perdieron por lisis o unión inespecífica a la matriz de papel.
donde 2,24 x 1012 partículas/ml es la concentración inicial de microvesículas y exosomas. A partir de este cálculo, la tasa de pérdida esperada del Exo-PAD es de aproximadamente 18%; por lo tanto, la eficiencia de aislamiento es de aproximadamente el 82%. Esta es una mejora significativa en comparación con los pobres rendimientos de la ultracentrifugación (5%-23%).
Figura 1: Procedimientos generales de Exo-PAD, desde el montaje hasta la operación. (A) Diseño de software para guiar la impresión de cera hidrófoba en papel de celulosa. (B) El papel encerado después de la incubación en un horno durante 80 s a 120 oC. (C) Los dispositivos individuales se cortan con una herramienta de corte. (D) La solución de membrana permselectiva se deja caer en las áreas de la muestra en las capas más a la izquierda y a la derecha y el disolvente se evapora en una placa de cocción a 70 oC durante 30 min(E) El Exo-PAD impreso se dobla hacia adelante y hacia atrás a lo largo de las líneas blancas; todas las áreas de muestra están conectadas convergentemente. (F) Se carga una muestra de microvesícula y exosoma en el área de la muestra. (G) Dos cámaras de acrílico se colocan en los extremos del dispositivo y se fijan con pequeños clips de aglutinante. (H) Las cámaras de acrílico se llenan con solución tampón y se insertan dos electrodos Ag/AgCl para aplicar una tensión de 30 V. (I) El dispositivo se despliega para aislar las microvesículas preconcentradas y los exosomas. (J) Las áreas de muestra de las capas 8 y 9 se perforan para su análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Observación de microvesículas y exosomas con etiqueta fluorescente durante el funcionamiento del dispositivo e intensidades de fluorescencia correspondientes. (A) Observación de lapso de tiempo de microvesículas y exosomas. Barra de escala de 5 mm. Con 20 minutos de procesamiento, las microvesículas y exosomas se centraron fuertemente en las capas 8 y 9, donde(B) se enriquecieron por aproximadamente cinco veces. Las barras de error representan la desviación estándar (n a 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de las microvesículas y exosomas enriquecidos. (A) imágenes SEM que muestran la integridad de las microvesículas y exosomas enriquecidos. Después de la preconcentración, se observaron muchos más microvesículos y exosomas6. Barra de escala a 1 m. (B) Distribución del tamaño de las microvesículas y exosomas enriquecidos. Los tamaños de los exosomas fueron de 95 a 195 nm (diámetro medio de 134 nm) y los tamaños de microvesículas fueron de 214 a 377 nm (diámetro medio de 315 nm). (C) La concentración real de las microvesículas y exosomas enriquecidos evaluados con NTA. Después del enriquecimiento, la concentración de microvesículas y exosomas se quintuplicaron por cinco, lo que es consistente con los resultados de fluorescencia6. Las barras de error representan la desviación estándar (n a 3). Los paneles A y C se reproducen con permiso de Kim et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Microvesículas y exosomas preconcentrados y centrados en la capa 8 se separaron de la albúmina sérica bovina (BSA), que se quedó en las capas 1–3. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aunque el Exo-PAD se utilizó con éxito para el enriquecimiento y aislamiento de microvesículas y exosomas, se deben considerar cuidadosamente varios puntos críticos: 1) el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la preparación del dispositivo, 2) el tiempo de procesamiento, 3) la aplicación de voltaje con diferentes números de capa y diámetros de área de muestra, y 4) la aplicabilidad a las muestras clínicas.
El tiempo de incubación y la temperatura indicados en el protocolo son condiciones optimizadas para fabricar un dispositivo confiable. Tiempos de incubación más largos o una temperatura más alta pueden causar distorsión del diseño convergente debido al reflujo excesivo de la cera impresa. Esto evitará la formación de líneas de campo eléctricas enfocadas y así aumentar la resistencia a la migración durante el proceso de enriquecimiento electrocinético.
El tiempo de procesamiento también es un factor a tener en cuenta para el máximo enriquecimiento y aislamiento. Un tiempo de procesamiento de <20 min da como resultado menos preconcentración porque no hay tiempo suficiente para permitir la migración de microvesículas y exosomas. Por otro lado, un tiempo de procesamiento de >20 min deteriora la eficiencia de enfoque y permite la dispersión de las microvesículas y exosomas enriquecidos. Según esta prueba, 20 min es el mejor tiempo de procesamiento para lograr el máximo enriquecimiento y aislamiento de microvesículas y exosomas.
La tensión aplicada es otro factor importante a tener en cuenta. En este protocolo, teniendo en cuenta el número de capas y los diámetros del área de la muestra, se utiliza 30 V para lograr una preconcentración y aislamiento estables. Cuando se genera un fenómeno ICP en el dispositivo, el régimen de operación se puede dividir en tres regiones distintas según la tensión aplicada: (1) ohmica, (2) limitación y (3) regiones de sobrelimitación6,,15,,16. Para una preconcentración y aislamiento estables, el dispositivo debe funcionar en la región limitante, donde se genera una zona de agotamiento iónico y se preconcentran los microvesículos y exosomas de forma estable. En este ajuste experimental, el rango de voltaje de funcionamiento (5-40 V) corresponde a la región limitante para el Exo-PAD. Si la tensión aplicada es <5 V, el dispositivo funciona en la región ohmica, donde la corriente eléctrica aumenta linealmente, lo que indica que no se genera ninguna región de agotamiento iónico para la preconcentración. Sin embargo, si la tensión es >40 V, la región de agotamiento de iones es destruida por una fuerte electroconvección impulsada por voltaje, que desestabiliza la preconcentración. Teniendo en cuenta estos factores, se determinó que 30 V era el voltaje óptimo para usar para un dispositivo con 12 capas y un diámetro de área de muestra de 2 x 5 mm. Los números de capa o los diámetros del área de la muestra se pueden aumentar para ampliar el volumen de la muestra, pero estos factores, así como el voltaje de funcionamiento, deben optimizarse para lograr un enriquecimiento estable de microvesículas y exosomas.
El Exo-PAD propuesto se puede utilizar para aislar microvesículas y exosomas de varias muestras clínicas, incluyendo saliva, orina, suero y plasma. Para muestras con menos proteínas, como saliva u orina, las microvesículas y los exosomas se pueden aislar fácilmente sin cambios importantes, ya que una pequeña cantidad de proteína en estas muestras se filtrará mediante la unión inespecífica al papel. Al operar el dispositivo dentro de la región limitante, sólo es necesario considerar el voltaje aplicado, porque la fuerza iónica de las muestras puede ser diferente. Para muestras ricas en proteínas, como suero o plasma, se deben considerar cuidadosamente tanto la preconcentración de microvesículas y exosomas como su separación de proteínas abundantes. Nuestro experimento reciente muestra que la separación de microvesículas y exosomas de las proteínas mejora significativamente cuando se utiliza el tampón de carbonato, porque el tampón de carbonato da como resultado una mayor diferencia de carga eléctrica entre microvesículas y exosomas y proteínas debido al punto isoeléctrico, lo que resulta en una mejor eficiencia de separación. Para este experimento, una sustancia con abundantes proteínas coexistidas con microvesículas y exosomas se imitaba mezclando microvesículos purificados y exosomas etiquetados con FITC (Ex/Em: 490/520 nm) con BSA etiquetado con un fluoróforo diferente (Ex/Em: 590/617 nm) en 50 mM de bufferato de carbono(Tabla de Materiales). Como se muestra en la Figura Suplementaria 1,la mayoría de las microvesículas y exosomas fueron preconcentrados en la capa 8, como en la Figura 2A y se separaron de BSA, que se quedaron en las capas 1–3. Este resultado sugiere que el enriquecimiento de una muestra de suero o plasma requiere un paso adicional añadiendo tampón de carbonato a la muestra, y demuestra claramente que el Exo-PAD puede purificar microvesículas y exosomas de abundantes proteínas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee fue apoyado por una beca de investigación de la Universidad de Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim recibió el apoyo del "Programa de Desarrollo de Competencias para Especialistas en Industria" del Ministerio de Comercio, Industria y Energía de Corea (MOTIE), operado por el Instituto Coreano para el Avance de la Tecnología (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para la convergencia industrial de dispositivos inteligentes portátiles).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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